物。若精子分散體系包 含此類組合物，則其濃度足以產(chǎn)生保護(hù)性作用而不會(huì)對(duì)精子健康產(chǎn)生不良影響。示例性濃 度范圍包括從約10 μ M至約20mM，取決于諸如所用的具體組合物或分散體系中精子的濃度 等因素。例如，精子分散體系中丙酮酸鹽的濃度可為約ImM至約20mM，優(yōu)選為約5mM至約 15mM，更優(yōu)選為約10mM。精子分散體系中維生素 K的濃度可為約1 μΜ至約100 μΜ，優(yōu)選為 約10 μ M至約100 μ Μ，更優(yōu)選為約100 μ Μ。精子分散體系中硫辛酸的濃度可為約0.1 mM至 約ImM，優(yōu)選為約0. 5mM至約ImM，而更優(yōu)選為約lmM。
[0041] 精子分散體系中可包含抗生素以抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)。示例性抗生素包括如，泰樂菌 素、慶大霉素、林可霉素、壯觀霉素、利高霉素 Linco-Spectin? (林可霉素羥氯化物-壯觀 霉素）、青霉素、鏈霉素、替卡西林（ticarcillin)、多粘菌素 B或其任意組合物。若包含抗 生素，則其濃度可為每毫升精液中約50 μ g至約800 μ g(不論精液是否是純凈的、緩沖性的 或包含其他物質(zhì)，例如此處提及的任一種添加劑）°C ertified Semen Services(CSS)和美 國(guó)國(guó)家動(dòng)物育種協(xié)會(huì)（NAAB)已經(jīng)頒布了有關(guān)抗生素在精子收集和使用中應(yīng)用的綱要。
[0042] 可以向精子分散體系中加入生長(zhǎng)因子，以協(xié)助維持精子細(xì)胞的存活力。示例性生 長(zhǎng)因子包括如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（〃TGF)(例如TGFf3 -1和TGFI3 -2)，以及胰島素樣生長(zhǎng)因子 (〃IGF〃）（例如IGF-1)。一般而言，精子分散體系中的TGF可以TGFI3-1的形式出現(xiàn)，其濃 度為約〇· I ng/L至約10 μ g/L，或?yàn)門GF β -2的形式，其濃度為約0· lng/L至約200ng/L ; 而IGF在精子分散體系中可為IGF-I形式，其濃度為約0. lng/L至約50 μ g/L。此類生長(zhǎng)因 子的用途為本領(lǐng)域所公知，并公開于如美國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào)2003/0157473中，其內(nèi)容在此 處引用作為參考。
[0043] 一旦收集了細(xì)胞，可將以靜止?fàn)顟B(tài)保存所需時(shí)間，或者在數(shù)小時(shí)內(nèi)使用。兩者中任 一情況下，細(xì)胞都可用于如染色過程、分選過程或育種過程。
[0044] A.收集細(xì)胞的分選
[0045] ⑴細(xì)胞染色
[0046] 運(yùn)動(dòng)性抑制劑可用于使細(xì)胞在細(xì)胞染色期間不運(yùn)動(dòng)。一般而言，精子細(xì)胞染色方 法中可包括形成染色混合物（有時(shí)稱為標(biāo)記混合物），其中包含完整的活精子細(xì)胞、運(yùn)動(dòng)性 抑制劑和染料（有時(shí)稱為標(biāo)記）。在本發(fā)明的這一方面，可以將運(yùn)動(dòng)性抑制劑與精子細(xì)胞接 觸以形成精子分散體系，然后將精子分散體系與DNA選擇性染料相接觸。在該實(shí)施方案中， 精子來源可為純精液，或者為通過離心或使用其他手段分離精液級(jí)分而得到的包含精子的 精液衍生物。
[0047] 在備選實(shí)施方案中，染料可與運(yùn)動(dòng)性抑制劑相組合，從而形成染料溶液。因此如純 固體（包括可自由流動(dòng)的粉末）或液體組合物形式的染料可與抑制劑組合形成染料溶液， 所述溶液可隨后與純精子、精子分散體系或含精子的精液衍生物組合。
[0048] 任何情況下，只要精子細(xì)胞保存在抑制劑中，一般都會(huì)保持靜止（Salisbury等 人，1963)。然而，優(yōu)選將染色混合物保存在二氧化碳分壓相對(duì)于周圍空氣而言增高的大氣 中；例如，一般優(yōu)選染色混合物上方的大氣中含99% +的C02。
[0049] 可將染色混合物的pH保持在一定pH值范圍內(nèi)的任意一點(diǎn)；一般而言，該范圍為約 5. 0至約9. 0。例如，可使染色混合物保持在"微酸性"pH下，即約5. 0至約7. 0。在該實(shí)施 方案中，優(yōu)選pH為約6. 0至約7. 0,更優(yōu)選為約6. 0至約6. 5,而最優(yōu)選為約6. 2。備選地， 可使染色混合物保持在"微堿性"pH下，即約7. 0至約9. 0。在該實(shí)施方案中，優(yōu)選pH為約 7. 0至約8. 0,更優(yōu)選為約7. 0至約7. 5,而最優(yōu)選為約7. 35。
[0050] 如以前在美國(guó)專利號(hào)5, 135, 759和WO 02/41906中所述，可使用一種或多種 可經(jīng)UV或可見光激發(fā)的DNA選擇性染料可以形成染色混合物，其內(nèi)容均在此處引用作 為參考。示例性紫外光（UV)激發(fā)的選擇性染料包括Hoechst33342和Hoechst33258， 二者均可從Sigma - Aldrich (St. Louis, MO)購(gòu)得。示例性可見光激發(fā)的染料包括 購(gòu)自 Molecular Probe, Inc. (Eugene, OR)的 SYBR-14，以及 W002/41906 中所描述 的 bisbenzimide- B()D1PY_? 綴合物 6-{[3-((2Ζ)-2-{[1-(二氟硼烷基）-3, 5-二 甲基-IH-吡咯-2-基]亞甲基}-2H-吡咯-5-基）丙酰基]氨基}-N-[3-(甲基 {3-[({4-[6-(4-甲基哌嗪-1-基）-1!1，3'!1-2,5'-二苯并咪唑-2'-基]苯氧基}乙基）氨 基]丙基}氨基）丙基]己酰胺（"BBC"）。這些染料中的每一種都可以單獨(dú)使用或者聯(lián) 合使用；或可以將其他具有細(xì)胞滲透性的UV和可見光激發(fā)的染料單獨(dú)或與前述染料聯(lián)合 使用，只要所述染料在可進(jìn)行別處所述分選或富集的濃度下不會(huì)對(duì)精子細(xì)胞的存活力產(chǎn)生 不可接受的不良影響。
[0051] 還可利用熒光聚酰胺形成染色混合物，更具體而言是利用綴合有熒光標(biāo)記或報(bào)告 子的聚酰胺。此類標(biāo)記在結(jié)合于核酸時(shí)會(huì)發(fā)出熒光。連接有熒光標(biāo)記或報(bào)告子的聚酰胺實(shí) 例包括，如 Best 等人，Proc. Natal. Acad. Sci. USA, 100(21) :12063-12068(2003) ;Gygi 等 人，Nucleic Acids Res. ,30 (13) :2790-2799 (2002);美國(guó)專利號(hào) 5, 998, 140;美國(guó)專利號(hào) 6, 143, 901以及美國(guó)專利號(hào)6, 090, 947中所公開的那些，每一篇的內(nèi)容均在此處引用作為 參考。
[0052] 熒光核苷酸序列也可用于標(biāo)記精子細(xì)胞。此類核苷酸序列在與包含靶序列或互補(bǔ) 序列的核酸雜交時(shí)會(huì)發(fā)出熒光，但在非雜交狀態(tài)時(shí)則不會(huì)發(fā)出熒光。此類核苷酸公開見于 如美國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào)2003/0113765(此處引用作為參考）。
[0053] 性別特異性抗體也可用于標(biāo)記染色混合物中的精子細(xì)胞。例如在該實(shí)施方案中， 性別特異性抗體可綴合于熒光部分（或等價(jià)報(bào)告分子）。由于抗體結(jié)合的抗原只存在于帶 有X染色體或Y染色體的細(xì)胞上，根據(jù)其熒光（相對(duì)于無熒光的未標(biāo)記細(xì)胞）能夠選擇性 地鑒定此類細(xì)胞。此外，可以同時(shí)使用分別與不同熒光部分相連的一種以上性別特異性抗 體。從而能根據(jù)帶有X染色體或Y染色體的細(xì)胞間的不同熒光，對(duì)之進(jìn)行區(qū)分。
[0054] 也可使用發(fā)光的色彩選擇性納米晶體標(biāo)記染色混合物中的精子細(xì)胞。這些顆 粒也稱為量子點(diǎn)，正如美國(guó)專利號(hào)6, 322, 901和美國(guó)專利號(hào)6, 576, 291所述為本領(lǐng)域所 公知（均在此處引用作為參考）。這些納米晶體已被綴合于多種生物材料，包括如肽、 抗體、核酸、鏈霉親和素及多糖（見如美國(guó)專利號(hào)6, 207, 392、6, 423, 551、5, 990, 479和 6, 326, 144,均在此處引用作為參考），且已用于檢測(cè)生物靶標(biāo)（見如美國(guó)專利號(hào)6, 207, 392 和6, 247, 323,兩者均在此處引用作為參考）。
[0055] 染色混合物中DNA選擇性染料或任何其他類型染料的濃度優(yōu)選為一系列變量的 函數(shù)，所述變量包括細(xì)胞對(duì)于所選擇染料的滲透性、染色混合物的溫度、完成染色所需要的 時(shí)間、精子濃度以及在隨后的分選步驟中要求的富集程度。一般而言，優(yōu)選的染料濃度足 以在適度短的時(shí)間內(nèi)達(dá)到所需的染色程度，而不會(huì)對(duì)精子存活力產(chǎn)生實(shí)質(zhì)性不良影響。例 如，Hoechst 33342、Hoechst 33258、SYBR-14 或 BBC 在混合物中的濃度一般在約 0· ΙμΜ 至 約1.0 M之間，優(yōu)選為約0. 1 μ M至約1000 μ Μ，更優(yōu)選為約100 μ M至約500 μ Μ，更優(yōu)選為 約200 μ M至約500 μ Μ，更優(yōu)選為約300 μ M至約450 μ Μ。因此，在一種染色條件設(shè)置下， Hoechst33342的濃度優(yōu)選為約350 μΜ。在另一種染色條件設(shè)置下，Hoechst33342的濃度 為約400 μM。在另一種染色條件設(shè)置下，濃度優(yōu)選為約450 μM。
[0056] 又例如，熒光聚酰胺的濃度（例如美國(guó)申請(qǐng)公開號(hào)2001/0002314中所述的那些）， 一般為約0. 1 μ M至約ImM，優(yōu)選約1 μ M至約ImM，更優(yōu)選約5 μ M至約100 μ M，甚至更優(yōu)選 約 10 μ M0
[0057] 染色混合物中也可任選地包含增強(qiáng)精子存活力的添加劑。示例性添加劑包括如上 文"細(xì)胞樣品的收集"中已經(jīng)討論過的抗生素、生長(zhǎng)因子或調(diào)節(jié)胞內(nèi)和/或胞外氧化/還原 反應(yīng)的組合物。據(jù)此向收集液中添加此類添加劑。
[0058] 染色混合物一旦形成，可以在一系列溫度范圍中的任意溫度下保存；一般而言，溫 度范圍為約4°C至約50°C。例如，可以將染色混合物保存于"相對(duì)低"的溫度下，即溫度為約 4°C至約30°C ;在該實(shí)施方案中，溫度優(yōu)選為約20°C至約30°C，更優(yōu)選為約25°C至約30°C， 最優(yōu)選為約28°C?；蛘咭部蓪⑷旧旌衔锉４嬗?中間"溫度范圍內(nèi)，即溫度為約30°C至 約39°C ;在該實(shí)施方案中，溫度優(yōu)選為約34°C至約39°C，更優(yōu)選為約37°C。此外還可將染 色混合物保存于"相對(duì)高"的溫度范圍內(nèi)，即溫度為約40°C至約50°C ;在該實(shí)施方案中，溫 度優(yōu)選為約41°C至約49 °C，更優(yōu)選為約41°C至約45 °C，更優(yōu)選為約41°C至約43 °C，最優(yōu) 選為約41°C。對(duì)于優(yōu)選溫度的選擇一般取決于一系列變量，包括如細(xì)胞對(duì)所用染料的滲透 性、染色混合物中染料的濃度、細(xì)胞在染色混合物中留存的時(shí)間、以及在分選或富集步驟中 所需的富集程度。
[0059] 精子細(xì)胞攝取染色混合物中的染料可以持續(xù)一段足夠長(zhǎng)的時(shí)間，以達(dá)到所需程度 的DNA染色。所述時(shí)間一般足以使染料結(jié)合于精子細(xì)胞的DNA，從而能根據(jù)帶有X及Y染 色體的精子細(xì)胞間不同的且可測(cè)量的熒光強(qiáng)度，將兩者分選或富集出來。一般而言，這一時(shí) 間不會(huì)超過約24小時(shí)；優(yōu)選不超過約10小時(shí)，更優(yōu)選不超過2小時(shí)，進(jìn)一步優(yōu)選不超過約 90分鐘，甚至更優(yōu)選不超過約60分鐘，而最優(yōu)選為約5分鐘至約60分鐘。在具體實(shí)施方案 中，這一時(shí)間為約30分鐘。
[0060] 染色階段的長(zhǎng)度與染色時(shí)溫度的關(guān)系為，染色時(shí)間越長(zhǎng)，染色溫度就可越低。例 如，在一個(gè)實(shí)施方案中，染色可發(fā)生于"相對(duì)低"的溫度下，持續(xù)約3小時(shí)至約24小時(shí)。或 者，染色可發(fā)生于"中間"的溫度下，持續(xù)約半小時(shí)至約3小時(shí)。此外，染色可發(fā)生于"相對(duì) 高"的溫度下，持續(xù)約10分鐘至約90分鐘。在具體的實(shí)施方案中，染色可發(fā)生于約4°C下 持續(xù)約24小時(shí)。在另一實(shí)施