用于授精的精子懸浮液的制作方法
【專利說明】
[0001] 本申請是申請人于2005年3月29日提交的題為"用于授精的精子懸浮液"的中 國專利申請200580017376. 2的分案申請。
技術領域
[0002] 本發(fā)明主要涉及貯存精子細胞的方法。更具體地，本發(fā)明涉及貯存運動性比體內 射出精子降低的分選及未分選精子的方法，提供該精子分散體系用于授精雌性哺乳動物的 方法，利用該精子分散體系授精雌性哺乳動物的方法。
【背景技術】
[0003] 通過人工授精（Al)使動物受精以及體外受精后的胚胎移植已經是成熟的技術。 由于用于這些操作的精子的存活力和運動性會影響其結局（即，該受精和授精過程是否能 成功產生后代），精子細胞能夠耐受授精過程中通常伴隨的困難（包括如細胞的收集、貯存 和運輸）至關重要。
[0004] 例如，在家畜產業(yè)中，常希望可對繁殖結果產生影響，而使其后代具有一種或多種 優(yōu)選性狀的能力，如得到特定性別的后代。為達到這樣的結局，從雄性哺乳動物收集精液樣 品，以染料染色，然后分選為帶有X和Y染色體的細胞，任選在冰凍或冷卻狀態(tài)下貯存一段 時間，然后運輸至育種地點，最終在該處對雌性哺乳動物授精。這該過程中的每一步均對于 精子細胞產生壓力，導致精子細胞的存活力或運動性，特別是前向性運動性（progressive motility)降低。
[0005] Salisbury等人描述了將公牛射出的精液直接收集至稀釋液中的技術，所述稀釋 液抑制細胞的運動性并防止其從周圍精漿中吸收糖類。當收集射出精液至該稀釋液中且將 液體上的氣相替換為100%的〇)2時，射出精液內的細胞會不再運動。只要將細胞留存于該 稀釋液中且排除空氣，該細胞就可在室溫下幾小時內保持不運動，5°C下至少約8天保持不 運動。
[0006] 發(fā)明概沐
[0007] 本發(fā)明的多方面之一是在貯存、運輸或受精中減少精子運動的方法，從而保護精 子免受這些過程中的困難。因此在本發(fā)明的一個實施方案中，形成了包含精子和下調精子 糖類攝取的組合物的精子分散體系（有時也稱為精子懸浮液）。
[0008] 簡言之，本發(fā)明因此涉及貯存未分選精子的方法，所述方法包括形成包含精子、誘 導精子不運動的組合物以及抗生素的精子分散體系，以及貯存該精子分散體系。
[0009] 本發(fā)明還涉及貯存分選的精子的方法，所述方法包括形成包含精子、誘導精子不 運動的組合物的精子分散體系，將該精子分散體系分選為分離群體，并于約-4°c至約30°C 的溫度下貯存一個群體，其中所述群體之一中的精子包括至少約65 %帶有X染色體的精子 細胞或至少約65%帶有Y染色體的精子細胞。
[0010] 本發(fā)明還涉及授精雌性哺乳動物的方法，該方法包括用精子分散體系授精雌性哺 乳動物，所述精子分散體系包含不運動的精子和誘導精子不運動的組合物。
[0011] 本發(fā)明還涉及提供新鮮精子分散體系來授精雌性哺乳動物的方法，該方法包括形 成包含精子和誘導精子不運動的組合物的精子分散體系、將該精子分散體系置于容器中用 以進行遠距離運輸，并在形成精子分散體系后的約24小時內將該容器內的精子分散體系 進行遠距離運輸。
[0012] 本方面還涉及包括用于授精雌性哺乳動物的細長容器和精子分散體系的組合，所 述精子分散體系包括不運動的精子和誘導精子不運動的組合物。精子分散體系包含在該細 長容器中。
[0013] 本發(fā)明還涉及包含不運動的精子、誘導精子不運動的組合物以及冷凍防腐劑的精 子分散體系。該精子分散體系中也可包含增強精子存活力的添加劑，例如，抗生素、生長因 子、己酸、過氧化氫酶或調節(jié)胞內和/或胞外氧化/還原反應的組合物。
[0014] 本發(fā)明的其他方面和特征部分是顯而易見的，部分將于此后說明。
[0015] 發(fā)明詳沐
[0016] 出人意料的是，已經證明相對于體內射精精子（相同種系），運動性降低的精子， 更具體而言是運動性暫時降低的精子，往往不必冷凍就更能耐受貯存和運輸過程。大約從 來源哺乳動物收集精子時起，就可以將精子保存在運動性降低的狀態(tài)下，直至用該不運動 精子授精雌性哺乳動物。因此，在優(yōu)選實施方案中，可以制備特定濃度的新鮮未冰凍精子 (分選或未分選的）用于貯存、運輸或受精，所述精子相對于冰凍后解凍的相同濃度的精子 而言，其中活細胞的數目增加或可運動精子的數目增加。
[0017] 精子分散體系中精子存活力的增加，使得可以在受精或授精過程中可使用包含較 低密度精子的精子分散體系等份；這是由于一等份的分散體系包含的活的、前向運動性細 胞的百分比（例如人工授精解凍液內包含的細胞百分比）更高，因而授精卵子的潛能也更 大。同理，由于受精或授精方法所需的等份分散體系中精子細胞密度更低，精子分散體系形 式的單次射精精液可以分為更多等份用于受精或授精方法。
[0018] 根據本發(fā)明的方法，形成包含精子和一種或多種抑制精子運動性的組合物的分散 體系；該運動性受抑的狀態(tài)有時被稱為不運動或精子靜止。一般而言，該分散體系包含精 子的密度為至少約IX IO3精子/ml分散體系，更優(yōu)選密度為至少約0.1 X 10 6精子/ml分散 體系，但一般不超過約5 X IOltl精子/ml分散體系，更優(yōu)選密度不超過5 X 10 8精子/ml分散 體系。例如，在一個實施方案中，懸浮液中可包含"相對低"密度的精子，即精子密度少于約 I X IO7精子/ml懸浮液，優(yōu)選少于約I X 10 6精子/ml懸浮液，更優(yōu)選約I X 10 3至約5 X 10 6精子/ml懸浮液，更優(yōu)選約I X IO3至約I X 10 6精子/ml懸浮液，甚至更優(yōu)選I X 10 4至約 I X IO5精子/ml懸浮液，最優(yōu)選約I X 10 5精子/ml懸浮液。在另一實施方案中，懸浮液中 可包含"中間"密度的精子，即密度為約IX IO7至約IX 10 8精子/ml懸浮液。在另一實施 方案中，懸浮液中可包含"相對高"密度的精子，即精子密度為至少約IX IO8精子/ml懸 浮液，優(yōu)選約IX IO8至約5 X 10 1(1精子/ml懸浮液，更優(yōu)選約I. 5 X 10 8至約2 X 10 1(1精子/ ml懸浮液，甚至更優(yōu)選I. 5 X IO8至約2 X 10 8精子/ml懸浮液，更加優(yōu)選約I. 5 X 10 8精子/ ml懸浮液。因此，例如，在一個實施方案中，該分散體系中可包含至少約0.04X 106、至少約 I X 106、至少約I. 5xl06、至少約2xl06、至少約3X 106、至少約0. 5X 107、至少約I X 107、至少 約2X 107、至少約3X 107、至少約4X 107、至少約5X 107、至少約6X 107、至少約7X 107、至少 約8 X 107、至少約9 X 107、或甚至至少約12 X IO7精子/ml分散體系。在另一實施方案中，懸 浮液中可包含小于約9X105、小于約7X105、小于約5X105、小于約2X10 5、小于約1X105、 小于約IX 1〇4、或甚至小于約IX IO3精子/ml懸浮液。
[0019] 精子的密度可取決于若干因素，包括如獲取精子的哺乳動物種系。例如，牛精子分 散體系密度可較高，但一般量較小，例如0. 5 X IO6精子/ml至約8 X 107精子/ml，量約0. 5ml 至約25ml。然而豬精子分散體系可能密度較低但一般量較大，例如0. 04X IO6精子/ml至 約I X IO7精子/ml，量為約50ml至約250ml。
[0020] 精子分散體系中的精子密度可因個體哺乳動物或種系特異性因素而有所差異。此 類因素的實例包括如哺乳動物不同種系間的差異、某一種系哺乳動物間的差異，甚至同一 動物不同次射精間的差異。
[0021] 也可人工操作精子分散體系中精子的密度，以獲得具有特定精子密度的分散體 系。對于精子分散體系中的精子密度的操作（如在授精解凍物中進行），可取決于若干因 素，例如分散體系的貯存溫度、貯存期的長度、精子分散體系中的精子是分選過的還是未分 選過的、收集精子的雄性哺乳動物的種系、收集精子的哺乳動物的生育力，以及將接受授精 的雌性哺乳動物的種系。
[0022] 隨后富集或分選精子細胞的方法也可影響精子分散體系中的精子密度。例如，可 使用如下文詳述的流式細胞術分選精子細胞。在這種情況下，緩沖精子懸浮液一般含"中 間"或"相對高"密度的精子。其他分選或富集技術更利于在精子密度更低時使用，例如標 有標記（如此處所述的染料和標記）的"相對低"密度的精子。
[0023] 簡單濃縮（例如通過離心）精子也會影響精子分散體系中的精子密度。在該情況 下，可將分散體系大致分為常說的沉淀（包含最少量液體的細胞團）和上清液（可溶性的 液體級分）。隨后可以在不干擾沉淀的情況下傾析上清液，從而得到相對密實的包含最少量 抑制性緩沖液的精子細胞沉淀，其作用是減少分散體系的體積而不改變分散體系的成分。 這樣，沉淀中的精子細胞保持不運動的狀態(tài)。
[0024] 在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明分散體系中的精子在某些方面表現出附睪精子的特征 性行為；例如，精子不運動，相對于剛射出精子而言其內呼吸速率更低而有氧糖酵解的速率 更尚。有利的是，受抑精子具有與一種或多種抑制劑分尚后，運動性能夠表現出射出精子的 特征性行為（而不具有附睪精子的特征性行為）；而在一個實施方案中，其運動性和呼吸均 能夠表現出射出精子的特征性行為。
[0025] 例如在一個實施方案中，通過HTM-IVOS精子分析（Hamilton-Thorne HTM-IVOS 計算機輔助精子分析系統(tǒng)，Hamilton-Thorne Research, Beverly MA)測量，運動抑制劑可 使分散體系中精子細胞的路徑速度、前向性速度或此兩者相對于相同種系剛射出精液中精 子細胞的路徑速度、前向性速度或此兩者，降低至少約50%。優(yōu)選通過HTM-IVOS精子分析 測量，運動抑制劑可使分散體系中精子細胞的路徑速度、前向性速度或此兩者相對于相同 種系剛射出精液中精子細胞的路徑速度、前向性速度或此兩者，降低至少約60%。更優(yōu)選 通過HTM-IVOS精子分析測量，運動抑制劑可使分散體系中精子細胞的路徑速度、前向性速 度或此兩者相對于相同種系剛射出精液中精子細胞的路徑速度、前向性速度或此兩者，降 低至少約70%。進一步優(yōu)選通過HTM-IVOS精子分析測量，運動抑制劑可使分散體系中精 子細胞的路徑速度、前向性速度或此兩者相對于相同種系剛射出精液中精子細胞的路徑速 度、前向性速度或此兩者，降低至少約80%。甚至更優(yōu)選通過HTM-IVOS精子分析測量，運 動抑制劑可使分散體系中精子細胞的路徑速度、前向性速度或此兩者相對于相同種系剛射 出精液中精子細胞的路徑速度、前向性速度或此兩者，降低至少約90%。甚至更優(yōu)選通過 HTM-IVOS精子分析測量，運動抑制劑可使分散體系中精子細胞的路徑速度、前向性速度或 此兩者相對于相同種系剛射出精液中精子細胞的路徑速度、前向性速度或此兩者，降低至 少約95 %