一株刺糖多孢菌多殺菌素高產(chǎn)工程菌株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一株刺糖多孢菌多殺菌素高產(chǎn)工程菌株及其應(yīng)用，采用基因工程技 術(shù)，阻斷刺糖多孢菌中亮氨酰氨肽酶同源基因表達(dá)，獲得殺菌素高產(chǎn)菌株s. SP- Λ pepA。
【背景技術(shù)】
[0002] 多殺菌素及其衍生物同時具有高效殺的蟲活性及綠色安全的優(yōu)良特性，成為近幾 年生物殺蟲制劑研宄領(lǐng)域的一大熱點，而野生菌株極低的發(fā)酵產(chǎn)量是阻礙多殺菌素進(jìn)一步 研宄的難題。多殺菌素通過與煙堿乙酰膽堿受體結(jié)合使昆蟲神經(jīng)細(xì)胞去極化，引起中央 神經(jīng)系統(tǒng)超活化，從而導(dǎo)致非功能性肌收縮、衰竭和麻痹，因此它對昆蟲有快速觸殺和攝 食毒性。多殺菌素殺蟲譜十分廣泛，包括鱗翅目（Lepidoptera)、纓翅目（Thysanoptera)、 鞘翅目（Coleoptera)、膜翅目（Hymenoptera)、雙翅目（Diptera)等害蟲，尤其對鱗翅目、 纓翅目害蟲有極強(qiáng)的選擇性殺蟲活性。多殺菌素具有諸多衍生物，到目前為止，由刺糖多 孢菌所產(chǎn)生的多殺菌素共分離得到30多種，其中包括9種缺少福樂糖基的擬糖苷配基 (Pseudoaglycone，PSA)，多殺菌素擬糖苷配基也可用作進(jìn)一步化學(xué)修飾的底物，并產(chǎn)生新 的帶有獨特性質(zhì)和活性譜的半合成多殺菌素。
[0003] 目前國際上關(guān)于多殺菌素合成機(jī)制的研宄仍處在起步階段，野生型刺糖多孢菌菌 株中多殺菌素產(chǎn)量極低，因此如何提高其發(fā)酵產(chǎn)量是亟待解決的一大難題。多殺菌素的合 成量極低，采用各種途徑如培養(yǎng)基優(yōu)化、理化誘變和分子遺傳改造等方法對其進(jìn)行菌種改 良是非常有必要的。利用基因工程技術(shù)對刺糖多孢菌基因組進(jìn)行定向遺傳修飾，有望成為 提尚多殺菌素廣量有效方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，利用基因工程技術(shù)，提供一株 刺糖多孢菌多殺菌素高產(chǎn)工程菌株及其應(yīng)用，通過定向遺傳修飾刺糖多孢菌，獲得多殺菌 素高產(chǎn)菌株。
[0005] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題采用的技術(shù)方案是， 本發(fā)明之刺糖多孢菌多殺菌素高產(chǎn)工程菌株，即刺糖多孢菌S. SP- Λ pepA， 577//705? S. sp-ApepA,于2015年6月8日在中國典型培養(yǎng)物保藏 中心(簡稱CCTCC，地址：中國武漢武漢大學(xué)）保藏，菌種保藏號為CCTCC NO :M 2015362。
[0006] 本發(fā)明之多殺菌素高產(chǎn)工程菌株的獲得步驟如下： (1) 通過 NCBI 的在線 Blast 工具（http://blast, ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi)進(jìn) 行搜索和比對亮氨酰氨肽酶基因（/^以)，利用Cluster X軟件對同源蛋白序列進(jìn)行比對分 析； (2) PCR擴(kuò)增含班《1111/ feoR V酶切位點的1420 bp的/76細(xì)同源基因中間片段； (3) 利用"ialIII/ feoR V雙酶切原始質(zhì)粒p0J260和同源基因片段后，通過連接酶作 用獲得敲除載體P〇J26〇-pepA ; (4) 通過電轉(zhuǎn)化方法將敲除載體p0J260-pepA導(dǎo)入供體菌E. coli S17后與野生型刺 糖多孢菌進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移，構(gòu)建工程菌株刺糖多孢菌S. SP- Λ pepA ; (5) 設(shè)計引物鑒定p0J260-pepA整合位點； (6) HPLC分析工程菌多殺菌素的生物合成能力； (7) 比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析亮氨酰氨肽酶同源基因阻斷對刺糖多孢菌蛋白表達(dá)水平的影 響。
[0007] 研宄表明，亮氨酰氨肽酶（pepA; EC 3. 4. 11. 1)是氨肽酶M17超家族中的一員，該 家族成員均具有從蛋白質(zhì)、多肽的N端將亮氨酸殘基切割下來的作用。該家族胺肽酶在生 物界普遍存在，其功能結(jié)構(gòu)的研宄僅在牛、大腸桿菌、土豆中開展過。
[0008] 研宄證明，大腸桿菌的p epA具有DNA結(jié)合活性，能與多種啟動子序列結(jié)合，對p epA 蛋白六聚體X射線三維結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)其具有一個凹槽結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)被認(rèn)為是DNA結(jié)合位點。 Song等在天藍(lán)色鏈霉菌中將亮氨酰氨肽酶基因（/^以）敲除發(fā)現(xiàn)缺失突變株產(chǎn)孢子能力和 抗生素合成能力明顯提高，雙向電泳和1^〇?檢測發(fā)現(xiàn)/^7、>55^、和<^(//-0/?/￥的蛋白 表達(dá)和轉(zhuǎn)錄水平也有較大幅度提高，這表明天藍(lán)色鏈霉菌中的在抗生素合成過程中 作為負(fù)調(diào)控因子發(fā)揮作用。
[0009] 本發(fā)明利用NCBI數(shù)據(jù)庫和Cluster X軟件從刺糖多孢菌基因簇中找到亮氨 酰氨肽酶同源基因，PCR擴(kuò)增該同源基因的中間片段，利用限制性酶切、連接的方法， 將PCR產(chǎn)物克隆到大腸桿菌-鏈霉菌穿梭質(zhì)粒p0J260上，采用屬間接合轉(zhuǎn)移方法將功 能載體P〇J26〇-pepA導(dǎo)入刺糖多孢菌中，獲得亮氨酰氨肽酶基因被阻斷的工程菌株S. sp- Λ pepA。PCR鑒定結(jié)果表明，該質(zhì)粒已成功地整合至刺糖多孢菌基因組上，并設(shè)計引物 對該功能載體在刺糖多孢菌基因組上的整合位點進(jìn)行了鑒定。HPLC檢測結(jié)果表明，工程菌 S. sp- Λ pepA中多殺菌素產(chǎn)量提高到原始菌株的137%。光學(xué)顯微鏡觀察表明，/76·/^基因 阻斷后刺糖多孢菌菌絲形態(tài)發(fā)生明顯變化，其菌絲變短，分支增多且片段化程度提高；利用 SDS-PAGE方法對工程菌株S. sp-Λ pepA和原始菌株5： 的全蛋白進(jìn)行比較分析， 發(fā)現(xiàn)亮氨酰氨肽酶基因阻斷后，工程菌株全蛋白條帶減少尤其是66. 4- 97. 2 kDa區(qū)域，且 分子量超過100 kDa的蛋白表達(dá)均被抑制，但某些條帶蛋白表達(dá)水平顯著提高。ID-LC-MS/ MS鑒定差異蛋白條帶，結(jié)果表明p印A基因阻斷后菌株的能量代謝和蛋白組裝過程發(fā)生改 變。
[0010] 微生物保藏情況說明 本發(fā)明之刺糖多孢菌多殺菌素高產(chǎn)工程菌株，即刺糖多孢菌S. SP- Λ pepA， 577//705? S. sp-ApepA,于2015年6月8日在中國典型培養(yǎng)物保藏 中心(簡稱CCTCC，地址：中國武漢武漢大學(xué)）保藏，菌種保藏號為CCTCC NO :M 2015362。
【附圖說明】
[0011] 圖1為基因編碼蛋白同源性比對圖； 圖2 -A和圖2 - B為功能載體p0J260-pepA的構(gòu)建圖；A，同源基因片段的PCR擴(kuò)增； B，功能載體p0J260-p印A的酶切鑒定； 圖3為接合子的PCR鑒定圖；M，DNA Marker;泳道1，陰性對照；泳道2,陽性對照；泳 道3、4，接合子基因組S. sp-ApepA為模板； 圖4 一 A和圖4 一 B為載體p0J260-pepA整合位點的鑒定圖；4 一 A，載體整合方式示 意圖；4 一 B，整合位點鑒定圖； 圖5為本發(fā)明工程菌刺糖多孢菌S. sp- Λ p印A與原始菌刺糖多孢菌S. spinosa (48 h)菌絲形態(tài)觀察圖； 圖6 -A和圖6 -B為原始菌株刺糖多孢菌5： (6 - A)與工程菌株刺糖多 孢菌 S. sp- Λ pepA (6 - B)的 HPLC 分析圖； 圖7為SDS-PAGE分析原始菌與工程菌（72 h)全蛋白圖。
[0012]
【具體實施方式】
[0013] 以下對本發(fā)明的【具體實施方式】結(jié)合附圖進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0014] 本實施例之刺糖多孢菌多殺菌素高產(chǎn)工程菌株，即刺糖多孢菌S. sp- Λ pepA， 577//705? S. sp-ApepA,于2015年6月8日在中國典型培養(yǎng)物保藏 中心(簡稱CCTCC，地址：中國武漢武漢大學(xué)）保藏，菌種保藏號為CCTCC NO :M 2015362。
[0015] ①具體培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件 (1) 5： 種子活化采用SP-2培養(yǎng)基：葡萄糖9 g/L，胰蛋白胨大豆肉湯30 g/ L，酵母提取物3 g/L，硫酸鎂2 g/L。接種單克隆或1%菌種保藏液加入裝有20 mL SP-2的 250 mL 搖瓶中，30°C，300 r/min 培養(yǎng) 48-72 h; (2) 轉(zhuǎn)接采用胰蛋白胨大豆肉湯（TSB)培養(yǎng)基：胰蛋白胨大豆肉湯30 g/L ;接種1%菌 液加入裝有 20 mL SP-2 的 250 mL 搖瓶中，30°C，300 r/min 培養(yǎng) 48-72 h; (3) 發(fā)酵培養(yǎng)采用SP-3培養(yǎng)基：葡萄糖60 g/L，可溶性淀粉10 g/L，玉米漿7 g/L，棉 籽粉22.5 8/1，豆餅粉5 8/1，酵母提取物2 8/1，碳酸鈣5 8/1，油酸甲酯42111171，微量元 素2. 5 mL/L (氯化鈷0. 3 g/L，硫酸鋅I. 4 g/L，硫酸亞鐵3. 8 g/L，硫酸鎳0. 5 g/L，溶于 0. 5 mol/L的鹽酸中），pH 7. 0 ;接種10%菌種保藏液加入裝有20 mL SP-3的300 mL搖瓶 中，30°C，300 r/min 培養(yǎng) 10-12 d; (4) 接合轉(zhuǎn)移采用R6固體培養(yǎng)基：培養(yǎng)基（g/L):蔗糖200,糊精10,酪蛋白氨基酸1，， K2SO4 0·