一種產(chǎn)丁二酸重組大腸桿菌細(xì)胞的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種產(chǎn)丁二酸重組大腸桿菌細(xì)胞的制備 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 當(dāng)前微生物發(fā)酵產(chǎn)丁二酸研究所涉及的微生物，主要有野生型的微生物以及基因 工程菌。利用大腸桿菌來發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸，是利用了大腸桿菌生長快速、培養(yǎng)條件簡單、安 全性好、易操作易改造等諸多優(yōu)點(diǎn)。目前利用大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸主要采取的是兩階 段發(fā)酵、純厭氧發(fā)酵以及純好氧發(fā)酵的工藝。
[0003] 目前細(xì)胞回收一般采用的工藝為離心分離或者膜分離手段，這兩種操作比較麻煩 且容易染菌，回收細(xì)胞的時(shí)間較長，容易造成細(xì)胞活力下降的現(xiàn)象。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是在產(chǎn)丁二酸重組大腸桿菌發(fā)酵結(jié)束時(shí)，通過一種溫 和、高效的方法回收菌體細(xì)胞。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0006] (1)利用重組大腸桿菌采用兩階段發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸；
[0007] (2) 丁二酸發(fā)酵結(jié)束時(shí)，采用沉降法收集菌體回收細(xì)胞回收低活性的產(chǎn)丁二酸重 組大腸桿菌細(xì)胞；
[0008] (3)將回收低活性的產(chǎn)丁二酸重組大腸桿菌細(xì)胞，轉(zhuǎn)入新鮮培養(yǎng)基中，通空氣或者 氧氣，并維持40%~60%的溶氧，溫度及發(fā)酵液pH值分別控制在33 °C~36 °C和6. 8~7. 5。 [0009] 所述的步驟（1)具體操作為：用活化重組大腸桿菌菌體，轉(zhuǎn)接入發(fā)酵培養(yǎng)基，添加 葡萄糖至初始濃度為20-30g. Γ1，培養(yǎng)過程溶氧維持在40%~60%以上；待葡萄糖基本消耗 完時(shí)改通CO2氣體，進(jìn)入?yún)捬醢l(fā)酵產(chǎn)酸階段，發(fā)酵過程中補(bǔ)加葡萄糖的方法，且控制葡萄糖 濃度在5~20g · Γ1，同時(shí)添加用于提供二氧化碳供體，調(diào)控pH值在6. 8-7. 0之間。
[0010] 所述的活化重組大腸桿菌菌體為從甘油凍存管中取少量菌液，在LB平板上劃線 后放置于37°C下培養(yǎng)12h ;從LB平板上取單菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基，在37°C，200r/min 條件下至菌體密度的0D600值在0. 6~0. 8之間。
[0011] 所述的步驟（2)具體操作為待發(fā)酵結(jié)束時(shí)，發(fā)酵罐內(nèi)停止通氣與攪拌，靜置5~10 分鐘，待細(xì)胞沉降完全后，將菌體細(xì)胞上層的發(fā)酵清液通過壓縮空氣給罐子增壓通過壓差 將發(fā)酵罐內(nèi)的上層清液移除；或者在發(fā)酵罐外面用泵將發(fā)酵罐內(nèi)的上層清液抽出發(fā)酵罐即 可實(shí)現(xiàn)菌體的收集。
[0012] 所述的步驟（3)中的新鮮的培養(yǎng)基為JSM-CN培養(yǎng)基、JSM-CP培養(yǎng)基、JSM-CT培養(yǎng) 基。
[0013] 添加葡萄糖至初始濃度為20_30g ·ΙΛ培養(yǎng)過程溶氧維持在40%~60% ;待葡萄糖 基本消耗完時(shí)改通CO2氣體，進(jìn)入?yún)捬醢l(fā)酵產(chǎn)酸階段，發(fā)酵過程中補(bǔ)加葡萄糖的方法，且控 制葡萄糖濃度在5~20g · Γ1，同時(shí)添加用于提供二氧化碳供體，調(diào)控pH值在6. 4-7. O之 間。
[0014] 本發(fā)明利用重組大腸桿菌兩階段發(fā)酵(先進(jìn)行有氧發(fā)酵再轉(zhuǎn)入?yún)捬跚闆r下進(jìn)行發(fā) 酵）產(chǎn)丁二酸以后，將菌體進(jìn)行回收，將原先菌體處于的厭氧狀態(tài)恢復(fù)至有氧狀態(tài)，讓菌體 重新恢復(fù)生長的能力，而這種大腸桿菌經(jīng)兩階段發(fā)酵以后再經(jīng)過有氧誘導(dǎo)菌體使其恢復(fù)生 長，再以一定的原料進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)其他產(chǎn)物的方法目前未見公開，而這種應(yīng)用將有效提高 產(chǎn)丁二酸重組大腸桿菌的利用效率。
[0015] 在大腸桿菌在厭氧的情況下菌體基本上是不生長的一個(gè)狀態(tài)，而本發(fā)明在厭氧發(fā) 酵結(jié)束時(shí)又將它恢復(fù)成好氧的狀態(tài)，使得菌體又恢復(fù)了生長的能力，同時(shí)菌體內(nèi)部的酶活 在一定培養(yǎng)基存在的情況下得到誘導(dǎo)。
[0016] 有益效果：
[0017] 本發(fā)明回收細(xì)胞的方式由于就在原發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)行，因此可以大大降低染菌的幾率 以及減少對(duì)細(xì)胞的損傷。細(xì)胞回收率最商可達(dá)91%。
[0018] 以回收的低活性的產(chǎn)丁二酸重組大腸桿菌為催化劑，丁二酸鈉為底物，有氧轉(zhuǎn)化 合成富馬酸，其轉(zhuǎn)化率達(dá)到92%以上。
[0019] 說明書附圖
[0020] 圖1為富馬酸生產(chǎn)過程曲線圖
【具體實(shí)施方式】
[0021] 本發(fā)明中所述的菌株及培養(yǎng)基：
[0022] 菌株：Escherichia coli AFPlll (Applied Environmental Microbiology. 2002, 68, 1715-1727)
[0023] 培養(yǎng)基：
[0024] (I) LB種子液培養(yǎng)基：酵母粉5g · Γ1 ;蛋白胨IOg · Γ1 ;NaC15g · Γ1 ;
[0025] (2) JSM 發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖 40g · L-1 ;檸檬酸 3g · L-1 ;Na2HP04 · 7H203g · L-1 ; KH2P048g · L-1 ; (NH4) 2HP048g · L-1 ;NH4C10. 2g · I/1 ; (NH4)2SO4O. 75g · L-1 ; MgSO4 · 7H201. OOg · I/1 ;CaCl2 · 2H2010.0 mg · I/1 ;ZnS04 · 7H200. 5mg · I/1 ; CuCl2 · 2H200. 25mg · I/1 ;MnS04 · H202. 5mg · I/1 ;CoCl2 · 6H201. 75mg · I/1 ;H3B030. 12mg ; Al2 (SO4) 3 · xH201. 77mg · L 1 ;Na2Mo04 · 2H200. 5mg · L 1 ;梓樣酸鐵 16. Img · L 1 !VBjO · mg L 1 ; 生物素2mg · L'
[0026] 下面的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)說明，但對(duì)本發(fā)明沒有限制。
[0027] 實(shí)施例1
[0028] 兩階段發(fā)酵產(chǎn)酸的過程采用如下技術(shù)方案中所描述的：
[0029] 菌種活化：從甘油凍存管中取少量菌液，在LB平板上劃線后放置于37°C下培養(yǎng) 12h ;種子液制備：從LB平板上取單菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基，在37°C，200r/min條件下 搖瓶培養(yǎng)至菌體密度（〇D_)值0. 6。
[0030] 兩階段發(fā)酵：添加葡萄糖至初始濃度為25g · Γ1，培養(yǎng)過程溶氧維持在50% ;待葡 萄糖基本消耗完時(shí)改通CO2氣體，進(jìn)入?yún)捬醢l(fā)酵產(chǎn)酸階段，發(fā)酵過程中采用恒速補(bǔ)加葡萄糖 的方法，且控制葡萄糖濃度在20g · Γ1，同時(shí)間歇性添加堿式碳酸鎂用于提供二氧化碳供 體，同時(shí)調(diào)控pH值在7.0。
[0031] 發(fā)酵結(jié)束時(shí)對(duì)菌體進(jìn)行回收，回收細(xì)胞的方式采用沉降法收集菌體。具體操作為 待發(fā)酵結(jié)束時(shí)，發(fā)酵罐內(nèi)停止通氣與攪拌，靜置5分鐘，待細(xì)胞沉降完全后，將菌體細(xì)胞上 層的發(fā)酵清液通過壓縮空氣給罐子增壓通過壓差將發(fā)酵罐內(nèi)的上層清液移除，此時(shí)細(xì)胞的 回收率達(dá)到87%。
[0032] 回收的菌體細(xì)胞隨后便進(jìn)行富馬酸的生產(chǎn)，培養(yǎng)條件為維持40%的溶氧，溫度及 發(fā)酵液pH值分別控制在33°C和6. 8,初始細(xì)胞干重DCW在10g/L，添加的底物丁二酸鈉折合 丁二酸的質(zhì)量濃度為20g L'
[0033] 首先對(duì)轉(zhuǎn)化過程的培養(yǎng)基進(jìn)行了篩選，以JSM發(fā)酵培養(yǎng)