專利名稱：：一種循環(huán)利用重組大腸桿菌細胞發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種循環(huán)利用重組大腸桿菌細胞發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法，具體涉及利用兩階段發(fā)酵時產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物有氧誘導(dǎo)提高重組大腸桿菌細胞胞內(nèi)酶活，并循環(huán)利用已提高胞內(nèi)酶活的細胞生產(chǎn)丁二酸的方法。
背景技術(shù)：
：丁二酸(succinicacid)被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)藥、染料、香料、油漆、食品和塑料等行業(yè)，同時作為優(yōu)秀的C4平臺化合物，可用于合成1，4-丁二醇、四氫呋喃、Y-丁內(nèi)酯等有機化學(xué)品以及聚丁二酸丁二醇酯(PBS)類生物可降解材料，被美國能源部認為是未來12種最有價值的生物煉制產(chǎn)品之一。丁二酸的生產(chǎn)方法主要包括化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法，利用微生物發(fā)酵法轉(zhuǎn)化可再生資源(葡萄糖、木糖等)，由于原料來源廣泛且價格低廉，污染小，環(huán)境友好，且在發(fā)酵過程中可吸收固定(A，能有效緩解溫室效應(yīng)，開辟了溫室氣體二氧化碳利用的新途徑，近年來成為研究的熱點。丁二酸的生產(chǎn)菌株主要包括naerobiospirillumsucciniciproducens、Actinobacillussuccinogenes、Ma皿heimiasucciniciproducens、重組谷氨酸棒桿菌和重組大腸桿菌。利用野生菌株生產(chǎn)丁二酸，雖然獲得了較高的產(chǎn)物濃度，但培養(yǎng)過程培養(yǎng)基成本較高，且甲酸、乙酸等副產(chǎn)物積累較多，阻礙了其工業(yè)化進程。大腸桿菌由于遺傳背景清楚、易操作、易調(diào)控、培養(yǎng)基要求簡單和生長迅速等優(yōu)點，近年來被廣泛用于研究以獲得產(chǎn)丁二酸優(yōu)秀菌株。利用大腸桿菌生產(chǎn)丁二酸的發(fā)酵模式主要包括專一性厭氧發(fā)酵及兩階段發(fā)酵。專一性厭氧發(fā)酵時，菌株生長緩慢，丁二酸終濃度和收率均較低。Vemuri等人利用大腸桿菌AFP111(PYC)兩階段發(fā)酵，其厭氧階段可完成1.lgg—1的丁二酸收率和1.3gL—1h—1的丁二酸生產(chǎn)強度(AppliedEnvironmentalMicrobiology.2002，68，17151727)。但如果考慮有氧階段消耗的糖及花費的時間，收率和生產(chǎn)強度將下降。Andersson等人通過及時回收厭氧發(fā)酵細胞并轉(zhuǎn)化新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)厭氧丁二酸生產(chǎn)，解除了產(chǎn)物抑制，延長了丁二酸的生產(chǎn)時間，在相同時間內(nèi)較兩階段發(fā)酵，產(chǎn)物濃度提高了60%;但過程中菌體密度、細胞比生產(chǎn)強度都不斷下降(BioprocessandBiosystemsEngineering.2009，DOI10.1007/s00449-009-0393-y)。因此，若能解決在兩階段發(fā)酵結(jié)束時通過有氧短時間誘導(dǎo)細胞，并收集已提高胞內(nèi)關(guān)鍵酶活的細胞進一步厭氧轉(zhuǎn)化合成丁二酸，將可大幅度提高細胞的比生產(chǎn)強度，同時可有效延長厭氧丁二酸的生產(chǎn)時間。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供一種能提高重組大腸桿菌胞內(nèi)合成丁二酸途徑關(guān)鍵酶酶活的方法，并利用已提高胞內(nèi)酶活的微生物進一步轉(zhuǎn)化合成丁二酸，以大幅度提高菌株生產(chǎn)丁二酸整個過程的收率及生產(chǎn)強度。為實現(xiàn)本發(fā)明循環(huán)利用重組大腸桿菌細胞生產(chǎn)丁二酸的目的，本發(fā)明采用以下技3術(shù)方案—種循環(huán)利用重組大腸桿菌細胞發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法，包括以下步驟(1)利用重組大腸桿菌采用兩階段發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸；所述的兩階段發(fā)酵，其特征在于先有氧培養(yǎng)菌體，繼而轉(zhuǎn)厭氧發(fā)酵產(chǎn)丁二酸首先用LB培養(yǎng)基活化菌體，按1X(v/v)接種量從凍存管接入三角瓶中，有氧培養(yǎng)菌體12h左右作為種子液；按接種量3%轉(zhuǎn)接JSM發(fā)酵培養(yǎng)基，添加葡萄糖至初始濃度為25g，L—、有氧培養(yǎng)至細胞干重在1012g*L—、培養(yǎng)過程溶氧維持在40%以上；改通(A氣體，進行厭氧發(fā)酵產(chǎn)酸，并分批補加葡萄糖，且最高濃度不超過50gL—、同時添加堿式碳酸鎂用于提供二氧化碳供體，同時調(diào)控pH值6.46.8。(2)利用兩階段發(fā)酵產(chǎn)生的中間代謝產(chǎn)物有氧誘導(dǎo)細胞內(nèi)關(guān)鍵酶活；兩階段發(fā)酵結(jié)束時，培養(yǎng)基中無殘?zhí)?，碳源僅剩丁二酸、乙酸、丙酮酸等中間代謝產(chǎn)物，此時發(fā)酵培養(yǎng)基改通空氣或者氧氣，并維持>40%的溶氧，以中間代謝產(chǎn)物為碳源，培養(yǎng)>2h，誘導(dǎo)細胞內(nèi)生產(chǎn)丁二酸過程中的關(guān)鍵酶酶活。其中，所述的關(guān)鍵酶活所指的酶是磷酸烯醇式丙酮酸激酶(PCK)、異檸檬酸裂解酶(ICLR)、蘋果酸脫氫酶(MDH)、蘋果酸酶(ME)、富馬酸酶(FUM)、富馬酸還原酶(FRD)、丙酮酸脫氫酶(PDH)中的一種或者多種；(3)無菌收集菌體細胞，在新鮮培養(yǎng)基中厭氧生物轉(zhuǎn)化合成丁二酸。收集已有氧誘導(dǎo)的細胞菌液，離心或者膜過濾獲得細胞，并轉(zhuǎn)化新鮮培養(yǎng)基進行厭氧發(fā)酵。其中，本發(fā)明所述的方法在步驟(3)結(jié)束時可繼續(xù)有氧誘導(dǎo)并轉(zhuǎn)新鮮培養(yǎng)基生物轉(zhuǎn)化合成丁二酸，達到細胞重復(fù)循環(huán)利用的目的待步驟(3)中細胞葡萄糖的消耗速率下降至0.lgL—1h—、終止厭氧發(fā)酵并轉(zhuǎn)有氧誘導(dǎo)細胞，繼而實施步驟(3)。本發(fā)明的有益效果在于1、本發(fā)明的步驟(2)中，有機酸檢測表明丁二酸、乙酸能作為碳源被消耗，并有少量富馬酸、蘋果酸產(chǎn)生。酶活檢測表明丁二酸合成途徑中的關(guān)鍵酶活有210倍的提高；2、本發(fā)明的步驟(3)中，利用已提高胞內(nèi)酶活的細胞在新鮮培養(yǎng)基下生物轉(zhuǎn)化合成丁二酸，發(fā)酵結(jié)束時在丁二酸濃度可>60gL—1下，收率>0.92gg—、生產(chǎn)強度>2.8gL—1h—1;3、本發(fā)明的技術(shù)方案，在兩階段發(fā)酵結(jié)束時通過有氧短時間誘導(dǎo)細胞，并收集已提高胞內(nèi)關(guān)鍵酶活的細胞進一步厭氧轉(zhuǎn)化合成丁二酸，大幅度提高了細胞的比生產(chǎn)強度，同時有效延長了厭氧丁二酸的生產(chǎn)時間。圖l利用回收的細胞在新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)過程中葡萄糖、丁二酸、乙酸和細胞密度隨時間的變化曲線；圖2細胞多次回收連續(xù)生物轉(zhuǎn)化合成丁二酸過程葡萄糖、丁二酸、乙酸和細胞密度隨時間的變化曲線。具體實施例方式本發(fā)明中所述的培養(yǎng)基(l)LB種子液培養(yǎng)基酵母粉5gL—1;蛋白胨10gL—1;NaCl5gL—1;(2)JSM發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖40gL—1;檸檬酸3gL-1;Na2HP047H203gL-1;KH2P048gL—1;(NH4)2HP048gL—1;NH4C10.2gL—1;(NH4)2S040.75gL—1;MgS047H201.OOgL—1;CaCl22H2010.OmgL—1;ZnS047H200.5mgL—1;CuCl22H200.25mgL—1;MnS04*H202.5mg*L—1;CoCl2*6H201.75mg*L—1;H3B030.12mg;A12(S04)3xH201.77mg*L—1;Na2Mo042H200.5mgL—1;擰檬酸鐵16.lmgL—1;VB口OmgL—1;生物素2mgL—工。本發(fā)明所用的重組大腸桿菌EscherichiacoliAFP111來源于公開文獻(Mutationofth印tsGGeneResultsinIncreasedProductionofSuccinateinFermentationofGlucosebyEscherichiacoli，APPLIEDANDENVIRONMENTALMICROBIOLOGY,0099-2240/01/$04.0010D0I:10.1128/AEM.67.1.148-154)。下面的實施例對本發(fā)明作詳細說明，但對本發(fā)明沒有限制。實施例1本實施例說明在兩階段發(fā)酵結(jié)束后進行有氧誘導(dǎo)過程時，大腸桿菌AFPlll可以利用培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物(丁二酸、乙酸等)以維持細胞的生長及功能。其具體培養(yǎng)條件及步驟如下1、兩階段發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸先LB培養(yǎng)基活化菌體，按1%(v/v)接種量從凍存管接入三角瓶中，有氧培養(yǎng)菌體12h左右作為種子液；按接種量3%轉(zhuǎn)接JSM發(fā)酵培養(yǎng)基，添加葡萄糖至初始濃度為25g*L—、有氧培養(yǎng)至細胞干重在1012g*L—、培養(yǎng)過程溶氧維持在40%以上；改通C02氣體，進行厭氧發(fā)酵產(chǎn)酸，采用分批補加葡萄糖的方法，且最高濃度不超過50g*L—、同時添加堿式碳酸鎂用于提供二氧化碳供體，同時調(diào)控pH值在6.46.8之間。2、兩階段發(fā)酵結(jié)束時，檢測培養(yǎng)基中葡萄糖含量，確保已經(jīng)耗盡；同時，改通空氣或者純氧，使溶氧在40%以上，控制溫度在37t:，pH用20%鹽酸控制在7.0;3、分別取0h，lh，2h，3h的樣進行培養(yǎng)基成分分析，結(jié)果見表1;4、分別取0h，lh，2h，3h的樣進行胞內(nèi)關(guān)鍵酶活檢測，結(jié)果見表2。表1細胞誘導(dǎo)前后培養(yǎng)基中中間代謝產(chǎn)物的變化情況丁二酸富馬酸蘋果酸草酰乙酸檸檬酸丙酮酸乙酸(g-L-')(g.L-')(g丄-')(g丄")(g.L")(g-L-')(g'L")誘導(dǎo)0h72.20.010.020.121.750.063.54誘導(dǎo)1h67.22.802.561.032.810.041.87誘導(dǎo)2h63.83.814.720.723.360.031.45誘導(dǎo)3h61.24.656.150.473.590.041.49表2細胞誘導(dǎo)前后胞內(nèi)關(guān)鍵酶活的變化情況5<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注a代表數(shù)據(jù)均已實測值加上標準偏差b中PCK-磷酸烯醇式丙酮酸激酶；ME-蘋果酸酶；ICL_異擰檬酸裂解酶；FRD-富馬酸還原酶；MDH-蘋果酸脫氫酶實施例2本實施例利用已誘導(dǎo)提高合成丁二酸途徑中關(guān)鍵酶活的大腸桿菌AFPlll細胞，在新鮮培養(yǎng)基中發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸。其具體步驟如下1、兩階段發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸先LB培養(yǎng)基活化菌體，按1%(v/v)接種量從凍存管接入三角瓶中，有氧培養(yǎng)菌體12h左右作為種子液；按接種量3%轉(zhuǎn)接JSM發(fā)酵培養(yǎng)基，添加葡萄糖至初始濃度為25g*L—、有氧培養(yǎng)至細胞干重在1012g*L—、培養(yǎng)過程溶氧維持在40%以上；改通C02氣體，進行厭氧發(fā)酵產(chǎn)酸，采用分批補加葡萄糖的方法，且最高濃度不超過50gL—、同時添加堿式碳酸鎂用于提供二氧化碳供體，同時調(diào)控pH值6.46.8。2、兩階段發(fā)酵結(jié)束時，檢測培養(yǎng)基中葡萄糖含量，確保已經(jīng)耗盡；同時，改通空氣或者純氧，使溶氧在40%以上，控制溫度在37°C，pH用20%鹽酸控制在7.O，有氧誘導(dǎo)3h;3、無菌回收細胞，并轉(zhuǎn)化新鮮培養(yǎng)基，通0)2氣體，進行厭氧發(fā)酵產(chǎn)酸，采用分批補加葡萄糖的方法，且最高濃度不超過50gL—、同時添加堿式碳酸鎂用于提供二氧化碳供體，同時調(diào)控pH值6.46.8。發(fā)酵過程結(jié)果如圖l所示。實施例3本實施例利用已誘導(dǎo)提高合成丁二酸途徑中關(guān)鍵酶活的大腸桿菌AFPlll細胞，在新鮮培養(yǎng)基中循環(huán)利用細胞發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸。其具體步驟如下1、兩階段發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸先LB培養(yǎng)基活化菌體，按1%(v/v)接種量從凍存管接入三角瓶中，有氧培養(yǎng)菌體12h左右作為種子液；按接種量3%轉(zhuǎn)接JSM發(fā)酵培養(yǎng)基，添加葡萄糖至初始濃度為25g*L—、有氧培養(yǎng)至細胞干重在1012g*L—、培養(yǎng)過程溶氧維持在40%以上；改通C02氣體，進行厭氧發(fā)酵產(chǎn)酸，采用分批補加葡萄糖的方法，且最高濃度不超過50gL—、同時添加堿式碳酸鎂用于提供二氧化碳供體，同時調(diào)控pH值6.46.8。2、兩階段發(fā)酵結(jié)束時，檢測培養(yǎng)基中葡萄糖含量，確保已經(jīng)耗盡；同時，改通空氣或者純氧，使溶氧在40%以上，控制溫度在37°C，pH用20%鹽酸控制在7.O，有氧誘導(dǎo)3h;3、無菌回收細胞，并轉(zhuǎn)化新鮮培養(yǎng)基，通0)2氣體，進行厭氧發(fā)酵產(chǎn)酸，采用分批補加葡萄糖的方法，且最高濃度不超過50gL—、同時添加堿式碳酸鎂用于提供二氧化碳供體，同時調(diào)控pH值6.46.8。4、待厭氧發(fā)酵過程葡萄糖的消耗能力下降至0.2g*L—1*h—1時，檢測培養(yǎng)基中葡萄糖含量，確保已經(jīng)耗盡；同時，改通空氣或者純氧，使溶氧在40%以上，控制溫度在37°C，pH用20%鹽酸控制在7.0，有氧誘導(dǎo)3h。并無菌回收細胞，轉(zhuǎn)化新鮮培養(yǎng)基，通C02氣體，進行厭氧發(fā)酵產(chǎn)酸，采用分批補加葡萄糖的方法，且最高濃度不超過50gL—、同時添加堿式碳酸鎂用于提供二氧化碳供體，同時調(diào)控pH值6.46.8。重復(fù)操作步驟4兩次，過程結(jié)果如圖2所示。權(quán)利要求一種循環(huán)利用重組大腸桿菌細胞發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法，其特征在于包括以下步驟(1)利用重組大腸桿菌采用兩階段發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸；(2)利用兩階段發(fā)酵產(chǎn)生的中間代謝產(chǎn)物有氧誘導(dǎo)細胞內(nèi)關(guān)鍵酶活；(3)無菌收集菌體細胞，在新鮮培養(yǎng)基中厭氧生物轉(zhuǎn)化合成丁二酸。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于所述的步驟(1)中的兩階段發(fā)酵是指先有氧培養(yǎng)快速提高菌體密度，繼而轉(zhuǎn)厭氧發(fā)酵產(chǎn)丁二酸。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的具體步驟是首先用LB培養(yǎng)基活化菌體，按1%(v/v)接種量從凍存管接入三角瓶中，有氧培養(yǎng)菌體12h左右作為種子液；按接種量3%轉(zhuǎn)接JSM發(fā)酵培養(yǎng)基，添加葡萄糖至初始濃度為25gL—、有氧培養(yǎng)至細胞干重在1012gL—、培養(yǎng)過程溶氧維持在40%以上；改通C02氣體，進行厭氧發(fā)酵產(chǎn)酸，采用分批補加葡萄糖的方法，且最高濃度不超過50gL—、同時添加堿式碳酸鎂用于提供二氧化碳供體，同時調(diào)控pH值6.46.8。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的步驟(2)的具體步驟是兩階段發(fā)酵結(jié)束時，培養(yǎng)基中無殘?zhí)?，碳源僅剩中間代謝產(chǎn)物，此時發(fā)酵培養(yǎng)基改通空氣或者氧氣，并維持>40%的溶氧，以中間代謝產(chǎn)物為碳源，培養(yǎng)>2h，誘導(dǎo)細胞內(nèi)生產(chǎn)丁二酸過程中的關(guān)鍵酶酶活。5.根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于所述的步驟(2)中的誘導(dǎo)細胞內(nèi)關(guān)鍵酶活的酶是磷酸烯醇式丙酮酸激酶、異檸檬酸裂解酶、蘋果酸脫氫酶、蘋果酸酶、富馬酸酶、富馬酸還原酶、丙酮酸脫氫酶中的一種或者多種。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的步驟(3)的具體方法為收集已有氧誘導(dǎo)的細胞菌液，離心或者膜過濾獲得細胞，并轉(zhuǎn)化新鮮培養(yǎng)基進行厭氧發(fā)酵。7.根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于在步驟(3)結(jié)束時可繼續(xù)有氧誘導(dǎo)并轉(zhuǎn)新鮮培養(yǎng)基生物轉(zhuǎn)化合成丁二酸，達到細胞重復(fù)循環(huán)利用的目的。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于具體方法為待步驟(3)中細胞葡萄糖的消耗速率下降至0.lgL—1—、終止厭氧發(fā)酵并轉(zhuǎn)有氧誘導(dǎo)細胞，繼而實施步驟(3)。全文摘要本發(fā)明涉及一種循環(huán)利用重組大腸桿菌細胞發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法，其特征在于包括以下步驟采用產(chǎn)琥珀酸重組大腸桿菌先有氧培養(yǎng)菌體后厭氧產(chǎn)酸的兩階段發(fā)酵模式生產(chǎn)丁二酸；在兩階段發(fā)酵結(jié)束時，利用兩階段發(fā)酵過程產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物(丁二酸，乙酸，丙酮酸等)有氧誘導(dǎo)細胞；無菌收集菌體細胞，在新鮮培養(yǎng)基中厭氧生物轉(zhuǎn)化合成丁二酸；厭氧生物轉(zhuǎn)化結(jié)束后再次有氧誘導(dǎo)，并回收細胞在新鮮的培養(yǎng)基下繼續(xù)生物轉(zhuǎn)化合成丁二酸，實現(xiàn)循環(huán)利用細胞生物轉(zhuǎn)化合成丁二酸的目的。本發(fā)明技術(shù)方案解決了因有氧菌體培養(yǎng)過程消耗大量碳源及時間導(dǎo)致兩階段發(fā)酵整個過程丁二酸收率及生產(chǎn)強度偏低的問題。文檔編號C12P7/46GK101792778SQ20101013330公開日2010年8月4日申請日期2010年3月25日優(yōu)先權(quán)日2010年3月25日發(fā)明者姜岷,應(yīng)漢杰,歐陽平凱,陳可泉,韋萍,馬江鋒申請人:南京工業(yè)大學(xué)