一種凝膠封裝的藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞及其封裝方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物化工領(lǐng)域和生物能源領(lǐng)域。具體而言是一種凝膠封裝的藍(lán)細(xì)菌細(xì) 胞及其封裝方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 我國(guó)經(jīng)濟(jì)社會(huì)高速發(fā)展幾十年來(lái)，對(duì)化石能源的需求強(qiáng)勁；2013年我國(guó)石油表觀 消費(fèi)量達(dá)到4. 98億噸，對(duì)外依存度達(dá)58. 1%。同時(shí)，化石能源的大量使用，又造成了嚴(yán)重的 大氣環(huán)境污染問(wèn)題。我國(guó)政府已承諾到2020年單位國(guó)內(nèi)生產(chǎn)總值二氧化碳排放比2005年 下降40%~45%，非化石能源占一次能源消費(fèi)比重達(dá)到15%左右。而發(fā)展基于可再生生物質(zhì) 資源的生物燃料與化學(xué)品，可以減少對(duì)傳統(tǒng)化石能源的依賴，保障我國(guó)能源安全，同時(shí)降低 粉塵及CO 2凈排放量，符合國(guó)家發(fā)展新能源、節(jié)能減排的重大戰(zhàn)略需求。
[0003] 而基于可再生生物質(zhì)生產(chǎn)生物燃料和化學(xué)品，就是以光合生物在細(xì)胞內(nèi)積累的糖 類(lèi)和脂類(lèi)物質(zhì)為原料，通過(guò)物理、化學(xué)或生物的方法轉(zhuǎn)化為各種生物燃料和化學(xué)品。其研究 也經(jīng)歷了從最初以糧食作物為原料，到目前以非糧食作物為原料的發(fā)展歷程。作為農(nóng)業(yè)副 產(chǎn)物，纖維素生物質(zhì)具有含量豐富和分布廣泛等優(yōu)勢(shì)，被認(rèn)為是一種非常有前景的可再生 生物質(zhì)資源。但是，纖維素生物質(zhì)收集運(yùn)輸和分解糖化等環(huán)節(jié)高能耗和高成本的問(wèn)題又使 得利用纖維素生物質(zhì)生產(chǎn)生物燃料和化學(xué)品在短期內(nèi)難以產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。
[0004] 由于具有生長(zhǎng)迅速、環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)和遺傳改造系統(tǒng)成熟等優(yōu)勢(shì)，藍(lán)細(xì)菌（也稱藍(lán) 藻、藍(lán)綠藻）經(jīng)過(guò)基因工程改造后，能夠在單一細(xì)胞內(nèi)完成從太陽(yáng)能和二氧化碳到生物燃料 和化學(xué)品的轉(zhuǎn)化。通過(guò)國(guó)內(nèi)外多個(gè)研究小組的努力，基因工程藍(lán)細(xì)菌已經(jīng)能夠合成氫氣、乙 烯、異戊二烯、乙醇、丁醇、異丁醛、異丁醇、2, 3-丁二醇、2-甲基-1 丁醇、1，2-丙二醇、脂肪 酸、脂肪醇、脂肪烴、蔗糖、乳酸和3-羥基丁酸等多種生物燃料和化學(xué)品分子（Machado and Atsumi, 2012;Robertson et al·，2011;Tan et al. , 2012;Zadran and Levine, 2012) 〇 上 述相關(guān)研究證明了基因工程藍(lán)細(xì)菌合成生物燃料和化學(xué)品的可能性和巨大應(yīng)用潛力，也引 起了國(guó)際上學(xué)術(shù)界和工業(yè)界的高度關(guān)注。不過(guò)，產(chǎn)品產(chǎn)率不高、規(guī)模化培養(yǎng)技術(shù)不成熟以及 由此引起的生產(chǎn)成本過(guò)高，又成為限制了基因工程藍(lán)細(xì)菌合成生物燃料和化學(xué)品路線產(chǎn)業(yè) 化應(yīng)用的主要瓶頸問(wèn)題。
[0005] 為了提高藍(lán)細(xì)菌合成產(chǎn)物產(chǎn)量和降低生產(chǎn)成本，除了對(duì)生產(chǎn)菌株進(jìn)一步系統(tǒng)地代 謝工程改造之外，細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的優(yōu)化也必不可少。而在諸多培養(yǎng)優(yōu)化方法中，細(xì)胞凝膠 封裝（Sol-gel encapsulation)技術(shù)，能夠降低分離成本和簡(jiǎn)化批次培養(yǎng)過(guò)程，是一種有前 景的固定培養(yǎng)技術(shù)。細(xì)胞凝膠封裝技術(shù)是指在微生物培養(yǎng)之前利用瓊脂、硅膠或海藻酸等 物質(zhì)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行前處理，形成固態(tài)膠裝基質(zhì)，使得細(xì)胞被固定于基質(zhì)中；固定于膠裝基質(zhì)中 的細(xì)胞能夠從基質(zhì)外的培養(yǎng)液中獲得水、營(yíng)養(yǎng)鹽等支持生長(zhǎng)，而細(xì)胞分泌的各種產(chǎn)物也能 夠通過(guò)基質(zhì)孔隙擴(kuò)散到培養(yǎng)液中。在培養(yǎng)一段時(shí)間之后，通過(guò)簡(jiǎn)單的過(guò)濾等方法，即可將固 定于凝膠內(nèi)的細(xì)胞與其分泌的產(chǎn)物分離；而且通過(guò)向膠裝基質(zhì)中再次添加培養(yǎng)液又能夠?qū)?現(xiàn)批次培養(yǎng)。
[0006] 到目前為止，只有少量關(guān)于凝膠封裝技術(shù)應(yīng)用于藍(lán)細(xì)菌培養(yǎng)的研究被報(bào)道。英 國(guó)鄧迪大學(xué)的一個(gè)研究小組，利用海藻酸溶液封裝聚球藻（Synechococcus) PCC6714和 PCC6311細(xì)胞，并研究了封裝后的細(xì)胞在低滲脅迫時(shí)向胞外分泌相容性物質(zhì)--甘油葡萄 糖苷和自由氨基酸的現(xiàn)象（Reed et al.，1986)。而德國(guó)羅斯托克大學(xué)的Erdmann N.課題組 報(bào)道了他們利用瓊脂封裝技術(shù)對(duì)聚球藻PCC7942和堅(jiān)實(shí)微囊藻(Microcystis firma)細(xì)胞 進(jìn)行了固定，并分別研究了在不同鹽濃度脅迫下蔗糖和甘油葡萄糖苷的合成情況（Erdmann et al.，1992)。除了海藻酸和瓊脂膠封裝之外，研究最多的藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞凝膠封裝技術(shù)就是 硅膠封裝（Silica sol-gel encapsulation)技術(shù)。比利時(shí)Namur大學(xué)一個(gè)研究小組詳細(xì) 研究了不同硅膠前體和其他固定條件對(duì)聚球藻PCC6301，7002和7418細(xì)胞各種生理活動(dòng)的 影響（Rooke et al.，2008)。而美國(guó)俄勒R大學(xué)Roger L. Ely課題組篩選得到了對(duì)集胞藻 PCC6803產(chǎn)氫氣最佳的硅膠封裝條件，發(fā)現(xiàn)在這種條件下集胞藻PCC6803氫氣產(chǎn)量高于液 體培養(yǎng)的細(xì)胞（Dickson et al.，2009);也系統(tǒng)研究了硅膠封裝對(duì)集胞藻PCC6803轉(zhuǎn)錄組 的影響（Dickson et al·，2012)以及硅膠封裝條件下可溶性離子的擴(kuò)散情況（Dickson et al.，2013)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種凝膠封裝的藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞及其封裝方法和應(yīng)用。
[0008] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用技術(shù)方案為：
[0009] -種凝膠封裝的藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞，凝膠封裝的藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞包括能夠水合形成凝膠的物 質(zhì)和被封裝的藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞。
[0010] 所述的能夠水合形成凝膠的物質(zhì)為瓊脂（Agar)、海藻酸鈉、富含硅的溶液(如水合 的硅酸鈉溶液）或醇鹽(Alkoxide)前體。
[0011] 所述的藍(lán)細(xì)菌為集胞藻（Synechocystis sp. )PCC6803、聚球藻（Synechococcus) PCC7002、聚球藻（Synechococcus elongatus sp. )PCC7942、魚(yú)渥藻（Anabaena sp.) PCC7120、嗜熱聚球藻（Thermosynechococcus elongatus) BP-1 )、聚球藻 WH5701、聚球藻 CB0101、聚球藻CB0205、聚球藻RCC307、聚球藻WH7803、聚球藻RS9917、聚球藻CC9311、聚 球藻、聚球藻WH8016、聚球藻RS9916、聚球藻BL107、聚球藻CC9902、聚球藻WH8102、聚球 藻 CC9605、聚球藻 WH8109、聚球藻 PCC7335、Acaryochloris MBIC11017、Acaryochloris CCMEE5410、藍(lán)桿藻（Cyanothece) CCYOl 10、藍(lán)桿藻 ATCC51142、微鞘藻（Microcoleus) PCC7420、鞘絲藻（Lyngbya) PCC8106、節(jié)旋藻（Athrospira) CS-328、節(jié)旋藻 PCC8005、節(jié)旋藻 NIES-39,或上述藍(lán)細(xì)菌菌株經(jīng)過(guò)基因工程改造后能夠合成生物燃料和化學(xué)品的突變菌株。
[0012] 一種凝膠封裝的藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞的封裝方法，將經(jīng)培養(yǎng)的藍(lán)細(xì)菌與能夠水合形成凝膠 的物質(zhì)混合，而后封裝，即得到凝膠封裝的藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞。其中，經(jīng)培養(yǎng)的藍(lán)細(xì)菌培養(yǎng)至細(xì)胞 OD730=4 ~5。
[0013] 一種培養(yǎng)藍(lán)細(xì)菌的方法，將藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞封裝于凝膠內(nèi)，再加入活化藍(lán)細(xì)菌的液體 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；或通過(guò)替換或流加營(yíng)養(yǎng)鹽的方式實(shí)現(xiàn)半連續(xù)或連續(xù)培養(yǎng)，進(jìn)而獲得大量 的藍(lán)細(xì)菌分泌物。
[0014] 將所述獲得的藍(lán)細(xì)菌分泌物用于制備生物燃料或化學(xué)品中。
[0015] 所述的生物燃料和化學(xué)品為甘油葡萄糖苷、蔗糖、氫氣、乙烯、異戊二烯、乙醇、丁 醇、異丁醛、異丁醇、2, 3- 丁二醇、2-甲基-1 丁醇、1，2-丙二醇、脂肪酸、脂肪醇、脂肪烴、乳 酸或3-羥基丁酸。
[0016] 本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)：
[0017] 本發(fā)明利用將生產(chǎn)各種生物燃料和化學(xué)品的藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞封裝于凝膠內(nèi)，而不是直 接在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，不需離心或絮凝即可將分泌到培養(yǎng)基中的產(chǎn)物與細(xì)胞分離，有利 于批次或流式培養(yǎng)，能夠提高單位細(xì)胞產(chǎn)物產(chǎn)量和降低生產(chǎn)成本。
[0018] 本發(fā)明通過(guò)瓊脂凝膠封裝藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞后，細(xì)胞仍能夠生長(zhǎng)，而且能夠合成并分泌 產(chǎn)物；在簡(jiǎn)單過(guò)濾后更換培養(yǎng)基，細(xì)胞仍能在一定時(shí)間范圍內(nèi)保持穩(wěn)定的合成并分泌產(chǎn)物 的能力。通過(guò)該方法培養(yǎng)的藍(lán)細(xì)菌，相比于傳統(tǒng)的液體培養(yǎng)方式，總的產(chǎn)物產(chǎn)量更高、能夠 批次培養(yǎng)更多的周期，對(duì)優(yōu)化培養(yǎng)工藝和節(jié)約成本有十分重要的意義。
【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的在柱式光反應(yīng)器培養(yǎng)條件下比較普通液體培養(yǎng)和瓊 脂凝膠封裝培養(yǎng)方式差異的照片。每張照片中，左邊3個(gè)柱式光反應(yīng)器采用普通液體培養(yǎng) 方式培養(yǎng)；右邊3個(gè)柱式光反應(yīng)器采用瓊脂凝膠封裝培養(yǎng)方式。"剛完成接種狀態(tài)"，表示剛 完成接種時(shí)柱式光反應(yīng)器的照片；"0-6天"，為加入600mM NaCl脅迫后第0到6天柱式光 反應(yīng)器的照片。
[0020] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例提供的激光共聚焦顯微鏡觀察被瓊脂膠封裝的藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞 形態(tài)圖。藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞含有藻膽體，在595nm有自發(fā)熒光；利用此特點(diǎn)通過(guò)激光共聚焦顯微鏡 觀察凝膠內(nèi)的細(xì)胞形態(tài)。上面兩張圖為，掃描得到的全部照片疊加圖；左上圖，為剛剛被封 裝在瓊脂膠中的細(xì)胞；右上圖為鹽脅迫后第1天的細(xì)胞形態(tài)。下面兩張圖為，掃描得到的全 部照片三維重建得到的三維立體圖像；左下圖，為剛剛被封裝在瓊脂膠中的細(xì)胞；右下圖 為鹽脅迫后第1天的細(xì)胞形態(tài)。
[0021] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例提供的瓊脂膠封裝（Gel encapsulated)和液體培養(yǎng)方式 (Control) GG產(chǎn)量的比較圖。由實(shí)施例記載，將WD094細(xì)胞分別在瓊脂膠封裝和液體培養(yǎng) 方式下培養(yǎng)；在鹽脅迫第8天取樣測(cè)試比較兩種培養(yǎng)方式的GG產(chǎn)量。
[0022] 圖4為本發(fā)明實(shí)施例提供的低滲脅迫和替換培養(yǎng)基相結(jié)合的半連續(xù)培養(yǎng)模式下， 液體培養(yǎng)(對(duì)照組，白色填充柱形圖）和瓊脂膠封裝(實(shí)驗(yàn)組，灰色填充柱形圖）培養(yǎng)條件下 分泌到胞外的甘油葡萄糖苷（GG)產(chǎn)量比較圖。每個(gè)培養(yǎng)周期，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組GG的產(chǎn)量 都分為培養(yǎng)基中的GG以及低滲釋放出來(lái)的GG兩部分。"總和"，指的是對(duì)照組或?qū)嶒?yàn)組完 成所有生長(zhǎng)周期后GG總的產(chǎn)量。 具體實(shí)施例
[0023] 相關(guān)術(shù)語(yǔ)
[0024] 藍(lán)細(xì)菌(也稱為藍(lán)藻）是一類(lèi)光合自養(yǎng)的原核微生物，能夠通過(guò)光合作用利用太陽(yáng) 能，固定二氧化碳。基因工程改造后的藍(lán)細(xì)菌，能夠合成并分泌多種生物燃料和化學(xué)品，如 甘油葡萄糖苷、蔗糖、氫氣、乙烯、異戊二烯、乙醇、丁醇、異丁醛、異丁醇、2, 3-丁二醇、2-甲 基-1 丁醇、1，2-丙二醇、脂肪酸、脂肪醇、脂肪烴、乳酸或3-羥基丁酸。
[0025] 凝膠（