一種肝素化功能微球的制備方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及高分子材料表面改性的技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種肝素化功能微球的制備方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]流行病學(xué)研宄發(fā)現(xiàn)，當(dāng)血液中低密度脂蛋白(LDL)水平超出正常生理范圍時(shí)，心腦血管疾病的發(fā)病率就會(huì)升高，尤其是動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生，二者呈線性關(guān)系。近年來，血液凈化療法被認(rèn)為最能有效地降低LDL的水平，控制病情的進(jìn)程。基于吸附作用的血液灌流是LDL血液凈化治療的發(fā)展趨勢，而吸附劑是血液灌流的關(guān)鍵。若是吸附材料對LDL吸附的選擇性較差，血液相容性不好，會(huì)給治療的患者帶來很多的負(fù)面影響。肝素由于其本身自分子結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)象，具有較好的血液相容性，抗凝血，和對LDL的特異性作用，因此肝素改性血液凈化材料是目前研宄的熱點(diǎn)之一。物理吸附涂層法，是將肝素與明膠、瓊脂流體混合，冷卻，進(jìn)行物理性包埋(Ji_hye Lee, Young Jun Lee, Hyeong-jin Cho, Dong WanKim, Heungsoo Shin.Drug Delivery and Translat1nal Research，2015，5:146)，但是這種結(jié)合方式不穩(wěn)定，外界環(huán)境改變時(shí)，會(huì)出現(xiàn)肝素脫落的現(xiàn)象。離子鍵結(jié)合方式是通過肝素?cái)y帶大量的磺酸基和羧基的負(fù)電荷，與帶正電荷的陽離子材料形成離子鍵結(jié)合(岳秀麗，田文杰，楊今朝，馬放，任南琪.化學(xué)學(xué)報(bào)，2007，65:367)，當(dāng)環(huán)境改變時(shí)，靜電相互作用減弱，給臨床應(yīng)用帶來很大的問題。因此，目前研宄者們集中研宄采用共價(jià)鍵將肝素鍵合在功能材料上(鄭細(xì)鳴，黃小軍，徐志康.高分子學(xué)報(bào)，2011，7:791)。本發(fā)明通過肝素與聚甲基丙烯酸縮水甘油酯微球(CPGMA)上環(huán)氧基團(tuán)開環(huán)反應(yīng)將肝素鍵合至CPGMA上。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于提供一種新型的、制備工藝簡單的表面攜帶大量負(fù)電荷的肝素功能化吸附材料。在堿性催化條件下，交聯(lián)聚甲基丙烯酸縮水甘油酯微球表面的環(huán)氧基團(tuán)與肝素的羧基開環(huán)將肝素共價(jià)鍵合至CPGMA微球表面。肝素化的功能微球表面有大量的磺酸基團(tuán)和羧基，使其攜帶大量負(fù)電荷，能通過靜電相互作用吸附帶正電荷的堿性蛋白質(zhì)，如低密度脂蛋白，為血液凈化提供新的材料。本發(fā)明用堿性蛋白質(zhì)溶菌酶代替低密度脂蛋白進(jìn)行吸附實(shí)驗(yàn)，考察分析其在不同PH值和溫度條件下的飽和吸附量。該肝素化功能微球制備方法工藝簡單、具有很好地生物相容性和重復(fù)使用性。
[0004]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:一種肝素化功能微球的制備方法，按照如下的步驟進(jìn)行:
步驟一、將交聯(lián)聚甲基丙烯酸縮水甘油酯微球(CPGMA)浸泡在蒸餾水充分溶脹；步驟二、加入3.2?6.4倍交聯(lián)聚甲基丙烯酸縮水甘油酯微球質(zhì)量的肝素，再加入催化劑，升溫?cái)嚢枋钩浞职l(fā)生反應(yīng)；
步驟三、過濾得到反應(yīng)產(chǎn)物，用蒸餾水和乙醇反復(fù)洗滌，干燥后即得鍵合有肝素的功能化微球(CPGMA-heparin)。
[0005]作為一種優(yōu)選方式:步驟一所述在蒸餾水充分溶脹是指將交聯(lián)聚甲基丙烯酸縮水甘油酯微球浸泡在質(zhì)量為其本身90倍的蒸餾水中大于等于8小時(shí)。
[0006]作為一種優(yōu)選方式:步驟二中催化劑為氫氧化鈉，肝素的質(zhì)量是氫氧化鈉質(zhì)量的500 ?600 倍。
[0007]作為一種優(yōu)選方式:所述肝素表面攜帶高密度的負(fù)電荷，所述肝素的濃度為35.5?71.lg/L，升溫?cái)嚢枋钩浞职l(fā)生反應(yīng)是指升溫到65?95°C，反應(yīng)時(shí)間8?14小時(shí)。
[0008]一種權(quán)利要求1所述肝素化功能微球的應(yīng)用，用肝素化功能微球?qū)A性蛋白質(zhì)吸附。
[0009]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明首次通過交聯(lián)聚甲基丙烯酸縮水甘油酯微球表面的環(huán)氧基團(tuán)開環(huán)反應(yīng)將肝素鍵合至其表面，制得表面攜帶大量負(fù)電荷的肝素化功能微球。該反應(yīng)容易進(jìn)行，肝素鍵合量高，且產(chǎn)物后處理方便。該發(fā)明所制備的肝素功能化微球可以作為堿性蛋白質(zhì)的吸附材料，生物相容性好、飽和吸附量高，可以重復(fù)使用。本方法穩(wěn)定性好、工藝簡單。
【具體實(shí)施方式】
[0010]CPGMA具有良好的生物相容性和力學(xué)性能，在藥物、DNA的輸送方面實(shí)現(xiàn)很好地應(yīng)用。CPGMA分子鏈上含有大量環(huán)氧基團(tuán)，能與胺基、羧基等基團(tuán)發(fā)生開環(huán)反應(yīng)。肝素表面攜帶大量的羧基，能與CPGMA的環(huán)氧基團(tuán)發(fā)生開環(huán)反應(yīng)，將肝素鍵合至CPGMA微球表面制得CPGMA-heparin,既具有肝素的高負(fù)電性，又具有CPGMA和肝素的生物相容性，可以高飽和量的吸附LDL，以實(shí)現(xiàn)血液凈化。
[0011 ] 一種肝素化功能微球的制備方法:
實(shí)施例1:在裝有冷凝管、攪拌器和溫度計(jì)的四口瓶中，將0.5 g交聯(lián)聚甲基丙烯酸縮水甘油酯微球(CPGMA)浸泡在45 mL的蒸餾水中8小時(shí)，使充分溶脹，再加入1.6 g肝素和0.003 g催化劑氫氧化鈉。升溫至65°C，反應(yīng)8 h，抽濾，蒸餾水和乙醇反復(fù)洗滌，干燥后即得鍵合量為0.8 mmol/g的功能化微球CPGMA-heparin。
[0012]實(shí)施例2:在裝有冷凝管、攪拌器和溫度計(jì)的四口瓶中，將0.5 g交聯(lián)聚甲基丙烯酸縮水甘油酯微球(CPGMA)浸泡在45 mL的蒸餾水中8小時(shí)，使充分溶脹，再加入3.2 g肝素和0.006 g催化劑氫氧化鈉。升溫至85°C，反應(yīng)14 h，抽濾，蒸餾水和乙醇反復(fù)洗滌，干燥后即得鍵合量為0.96 mmol/g的功能化微球CPGMA_h印arin。
[0013]實(shí)施例3:在裝有冷凝管、攪拌器和溫度計(jì)的四口瓶中，將0.5 g交聯(lián)聚甲基丙烯酸縮水甘油酯微球(CPGMA)浸泡在45mL的蒸餾水中8小時(shí)，使充分溶脹，再加入2.4 g肝素和0.004 g催化劑氫氧化鈉。升溫至85°C，反應(yīng)12h，抽濾，蒸餾水和乙醇反復(fù)洗滌，干燥后即得鍵合量為0.92 mmol/g的功能化微球CPGMA_h印arin。
[0014]實(shí)施例4:在裝有冷凝管、攪拌器和溫度計(jì)的四口瓶中，將0.5 g交聯(lián)聚甲基丙烯酸縮水甘油酯微球(CPGMA)浸泡在45 mL的蒸餾水中8小時(shí)，使充分溶脹，再加入2.8 g肝素和0.005 g催化劑氫氧化鈉。升溫至95°C，反應(yīng)12 h，抽濾，蒸餾水和乙醇反復(fù)洗滌，干燥后即得鍵合量為0.86 mmol/g的功能化微球CPGMA_h印arin。
[0015]實(shí)施例5:在裝有溫度計(jì)和冷凝管的四口瓶中，將0.5 g交聯(lián)聚甲基丙烯酸縮水甘油酯微球(CPGMA)浸泡在45 mL的蒸餾水中8小時(shí)，使充分溶脹，再加入3.2 g肝素和0.006g催化劑氫氧化鈉。升溫至75°C，反應(yīng)10 h，抽濾，蒸餾水和乙醇反復(fù)洗滌，干燥后即得鍵合量為0.84 mmol/g的功能化微球CPGMA-heparin。
[0016]一種肝素化功能微球的應(yīng)用:
堿性蛋白質(zhì)低密度脂蛋白(LDL)分子呈正電性，分子中的BlOO結(jié)構(gòu)中含有特有的呈正電性的賴氨酸和精氨酸。而肝素化功能微球表面攜帶大量呈負(fù)電性的羧基和磺酸基團(tuán)。因此，呈正電性的LDL分子能與呈負(fù)電性的肝素功能化微球通過靜電相互作用而特異性結(jié)合。溶菌酶也是一種堿性蛋白質(zhì)，由129個(gè)氨基酸殘基組成，含有19個(gè)帶正電荷的氨基酸，等電點(diǎn)在PH=II左右，當(dāng)pH〈lI時(shí)，溶菌酶表面攜帶大量正電荷，實(shí)驗(yàn)中常用溶菌酶作為模型堿性蛋白質(zhì)。本發(fā)明一種肝素化功能微球的應(yīng)用，采用溶菌酶作為堿性蛋白模型物，或是LDL的類似物，測定制備的肝素功能化微球?qū)θ芫傅奈叫阅堋?br>[0017]實(shí)例6:在20°C的恒定溫度下，將25 mL濃度為12 mg/mL的溶菌酶溶液置于具塞錐形瓶中，調(diào)pH=8，加入準(zhǔn)確稱量的0.1 g的肝素功能化微球CPGMA-h印arin，在恒溫振蕩器中振蕩4 h，使結(jié)合達(dá)到平衡，采用紫外分光光度法測定上清液中溶菌酶的平衡濃度，計(jì)算肝素功能化微球CPGMA-h印arin對溶菌酶的飽和吸附量為654 mg/go
[0018]實(shí)例7:在20°C的恒定溫度下，將25 mL濃度為12 mg/mL的溶菌酶溶液置于具塞錐形瓶中，調(diào)pH=6，加入準(zhǔn)確稱量的0.1 g的肝素功能化微球CPGMA-h印arin，在恒溫振蕩器中振蕩4 h，使結(jié)合達(dá)到平衡，采用紫外分光光度法測定上清液中溶菌酶的平衡濃度，計(jì)算肝素功能化微球CPGMA-h印arin對溶菌酶的飽和吸附量為462 mg/go
[0019]實(shí)例8:在300C的恒定溫度下，將25 mL濃度為12mg/mL的溶菌酶溶液置于具塞錐形瓶中，調(diào)pH=8，加入準(zhǔn)確稱量的0.1 g的肝素功能化微球CPGMA-h印arin，在恒溫振蕩器中振蕩4 h，使結(jié)合達(dá)到平衡，采用紫外分光光度法測定上清液中溶菌酶的平衡濃度，計(jì)算肝素功能化微球CPGMA-h印arin對溶菌酶的飽和吸附量為551 mg/go
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種肝素化功能微球的制備方法，其特征在于按照如下的步驟進(jìn)行: 步驟一、將交聯(lián)聚甲基丙烯酸縮水甘油酯微球浸泡在蒸餾水充分溶脹； 步驟二、加入3.2?6.4倍交聯(lián)聚甲基丙烯酸縮水甘油酯微球質(zhì)量的肝素，再加入催化劑，升溫?cái)嚢枋钩浞职l(fā)生反應(yīng)； 步驟三、過濾得到反應(yīng)產(chǎn)物，用蒸餾水和乙醇反復(fù)洗滌，干燥后即得鍵合有肝素的功能化微球。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種肝素化功能微球的制備方法，其特征在于:步驟一所述在蒸餾水充分溶脹是指將交聯(lián)聚甲基丙烯酸縮水甘油酯微球浸泡在質(zhì)量為其本身90倍的蒸飽水中大于等于8小時(shí)。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種肝素化功能微球的制備方法，其特征在于:步驟二中催化劑為氫氧化鈉，肝素的質(zhì)量是氫氧化鈉質(zhì)量的500?600倍。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種肝素化功能微球的制備方法，其特征在于:所述肝素表面攜帶高密度的負(fù)電荷，所述肝素的濃度為35.5?71.lg/L，升溫?cái)嚢枋钩浞职l(fā)生反應(yīng)是指升溫到65?95°C，反應(yīng)時(shí)間8?14小時(shí)。5.一種權(quán)利要求1所述肝素化功能微球的應(yīng)用，其特征在于:用肝素化功能微球?qū)A性蛋白質(zhì)吸附。
【專利摘要】本發(fā)明涉及高分子材料表面改性的技術(shù)領(lǐng)域,特別是一種肝素化功能微球的制備方法及其應(yīng)用。一種肝素化功能微球的制備方法及其應(yīng)用，將交聯(lián)聚甲基丙烯酸縮水甘油酯微球浸泡在蒸餾水充分溶脹；加入3.2～6.4倍交聯(lián)聚甲基丙烯酸縮水甘油酯微球質(zhì)量的肝素，再加入催化劑，升溫?cái)嚢枋钩浞职l(fā)生反應(yīng)；過濾得到反應(yīng)產(chǎn)物，用蒸餾水和乙醇反復(fù)洗滌，干燥后即得鍵合有肝素的功能化微球。本發(fā)明還公開了用肝素化功能微球?qū)A性蛋白質(zhì)吸附的應(yīng)用。本發(fā)明所制備的肝素功能化微球可以作為堿性蛋白質(zhì)的吸附材料，生物相容性好、飽和吸附量高，可以重復(fù)使用。本方法穩(wěn)定性好、工藝簡單。
【IPC分類】C08G81/02, B01J20/30, B01J20/26, C08J7/12
【公開號】CN104927078
【申請?zhí)枴緾N201510222861
【發(fā)明人】門吉英, 陳建軍, 王蕊欣, 高寶嬌, 李歡
【申請人】中北大學(xué)
【公開日】2015年9月23日
【申請日】2015年5月5日