浴酶切處理2h，電泳后分別回收兩個目的片段，溶于20ul ddH20。用T4DNA 連接酶進行連接，連接體系如下：
[0038]
[0039] 22°C連接lh，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)，涂布LB+AMP平板，37°C培養(yǎng)過夜后長出 單菌落，菌落PCR驗證連接正確的轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒送測序，測序正確后，即得到分別含有植 酸酶突變體PHYAT3和PHYAT5基因的重組載體pGAU-PHYAT3和pGAU-PHYAT5。
[0040] 采用上述同樣方法構(gòu)建得到含有植酸酶PHYA基因的重組載體pGAU-PHYA。
[0041] 實施例4植酸酶突變體的重組表達
[0042] 原生質(zhì)體制備：接種黑曲霉宿主于PDA+U平板，30°C培養(yǎng)5-7d ;割取2cmX2cm大 小的菌塊，接種于100mL液體PDA+U培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)24h生長菌絲體，用于轉(zhuǎn)化。將長 好的菌絲體過濾后，用20ml 1.2M硫酸鎂溶液重懸，加入0.2g溶菌酶。30°C、IOOrpm培養(yǎng) 2-3h。將裂解好的菌絲用2層擦鏡紙過濾，3000rpm離心10min獲得原生質(zhì)體。
[0043] 轉(zhuǎn)化：原生質(zhì)體用I. 2M山梨醇溶液清洗2遍，再用適量的山梨醇溶液重懸，使原 生質(zhì)體濃度達到1〇8。20〇111原生質(zhì)體中加入1〇111準備好的重組載體，加入5〇11125%的 PEG6000,冰浴20min，再加入2ml 25 %的PEG6000室溫放置5min，加入4ml山梨醇溶液顛倒 混勻。倒入50ml轉(zhuǎn)化上層培養(yǎng)基后，傾倒入4個轉(zhuǎn)化下層平板中，待上層培養(yǎng)基凝固后，于 30°C培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)5d。
[0044] 轉(zhuǎn)化子篩選：培養(yǎng)5d后，挑取長出的菌落，點種到轉(zhuǎn)化下層平板進行復篩，30°C培 養(yǎng)2d。將正常生長的轉(zhuǎn)化子分別接種到新鮮的PDA平板，30°C培養(yǎng)5-7d。每個轉(zhuǎn)化子割取 2cmX 2cm大小的菌塊，分別接種于50ml液體搖瓶培養(yǎng)基中發(fā)酵，32°C培養(yǎng)5d，每天加入適 量氨水，控制PH在4. 5左右。培養(yǎng)5d后，離心菌體獲得上清液即為粗酶液，進行蛋白電泳 檢測，篩選出有明顯蛋白條帶表達的陽性轉(zhuǎn)化子。申請人將篩選到的其中一個重組表達植 酸酶PHYA的陽性轉(zhuǎn)化子命名為黑曲霉Phya(Aspergillus niger Phya), -個重組表達植 酸酶突變體PHYAT3的陽性轉(zhuǎn)化子命名為黑曲霉Phyat3 (Aspergillus niger Phyat3)，一 個重組表達植酸酶突變體PHYAT5的陽性轉(zhuǎn)化子命名為黑曲霉Phyat5 (Aspergillus niger Phyat5)〇
[0045] 將黑曲霉Phya、黑曲霉Phyat3和黑曲霉Phyat5的發(fā)酵上清液進行植酸酶酶活檢 測，同時以黑曲霉宿主菌發(fā)酵上清液做對照。結(jié)果表明：黑曲霉宿主菌的發(fā)酵上清液酶活 僅為8. 4U/ml，而黑曲霉Phya、黑曲霉Phyat3和黑曲霉Phyat5的發(fā)酵上清液酶活分別為 168U/ml、136U/ml和110U/ml。從而進一步說明，本發(fā)明構(gòu)建的重組菌黑曲霉Phya、黑曲霉 Phyat3和黑曲霉Phyat5能分別重組表達植酸酶PHYA、PHYAT3和PHYAT5。
[0046] (1)植酸酶酶活單位的定義
[0047] 在37°C、pH值為5. 0的條件下，每分鐘從濃度為5mg/ml的植酸鈉溶液中釋放 I μ mol無機磷所需要的酶量即為一個酶活力單位U。
[0048] (2)酶活測定方法
[0049] 取4ml濃度為7. 5mmol/L的植酸鈉溶液（pH5. 00. 25mol/L乙酸緩沖液配制），加入 到比色管中，37°C平衡5min，再加入2ml經(jīng)pH5. 00. 25mol/L乙酸緩沖液適當稀釋并經(jīng)37°C 平衡好的植酸酶酶液，混勻于37°C精確保溫反應30min。反應結(jié)束后，加入4ml終止液（2 份硝酸溶液（硝酸：水=1:2)、1份100g/L鉬酸銨溶液、1份2. 35g/L釩酸銨溶液），混勻以 終止反應。然后室溫放置IOmin顯色，分光光度計415nm處測定吸光值。
[0050] 酶活計算公式：
[0051] U= (A-A0-0.00 16) XF/(0. 0415X30)
[0052] 式中：A為樣品的吸光值Λ為空白樣品的吸光值；F為實際樣液反應前的總稀釋 倍數(shù)；30為酶解反應時間，min。
[0053] 實施例6酶學性質(zhì)分析
[0054] 1、最適作用pH分析
[0055] 采用 pH 值分別為 2. 0、2. 5、3. 0、4. 0、5. 0、5. 5、6. 0、6. 5、7. 0、8. 0 的緩沖液，分別將 黑曲霉Phya、黑曲霉Phyat3和黑曲霉Phyat5發(fā)酵上清液進行稀釋測定，植酸鈉也分別用對 應PH值的緩沖液配制，在37°C下進行植酸酶活力測定，計算酶活，以最高酶活為100%，計 算相對酶活，做pH-相對酶活曲線。
[0056] 結(jié)果如圖1所示，野生型植酸酶PHYA的最適反應pH為5. 5,當pH為6. 5時植酸 酶PHYA的相對酶活迅速降低至30 %，而當pH高于7. 0時，其酶活幾乎降為0 ;而植酸酶突 變體PHYAT3和PHYAT5的最適反應pH均為6. 5,在pH6. 5-7. 0范圍內(nèi)，能保持80%以上的 酶活水平，當口!1為8.0時，？!^413和？!^415仍能分別保持20%和35%的酶活，取得了意 料不到的技術(shù)效果。
[0057] 2、最適作用溫度分析
[0058] 分別在 30°C、35°C、40°C、45°C、50°C、55°C、60°C、65°C、70°C，pH5. 0 條件下，測定 黑曲霉Phya、黑曲霉Phyat 3和黑曲霉Phyat 5發(fā)酵上清液的植酸酶活力，以最高酶活為 100 %，計算相對酶活，做溫度-相對酶活曲線。結(jié)果如圖2所示，野生型植酸酶PHYA的最適 反應溫度為55°C，而植酸酶突變體ΡΗΥΑΤ3和ΡΗΥΑΤ5的最適反應溫度與野生型植酸酶PHYA 一致。
[0059] 綜上，與野生型植酸酶相比，本發(fā)明篩選到的兩個植酸酶突變體PHYAT3和PHYAT5 在中性范圍內(nèi)的酶活水平得到顯著提高，最適反應溫度未發(fā)生明顯的變化。所述植酸酶突 變體可廣泛應用于水產(chǎn)飼料中，從而有利于減少飼料中無機磷酸鹽的添加，降低養(yǎng)殖成本， 同時還能有效減少水產(chǎn)動物糞磷對環(huán)境的污染。
【主權(quán)項】
1. 一種植酸酶，其特征在于，所述的植酸酶的氨基酸序列為SEQIDNO:1。2. 編碼權(quán)利要求1所述的植酸酶的基因。3. 如權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列為SEQIDNO:2。4. 一種植酸酶突變體，其特征在于，所述植酸酶突變體的氨基酸序列為SEQIDNO:5。5. -種基因，其特征在于，所述的基因編碼權(quán)利要求4所述的植酸酶突變體。6. 如權(quán)利要求5所述的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列為SEQIDNO:6。7. -種重組質(zhì)粒，所述的重組質(zhì)粒攜帶有權(quán)利要求5所述的基因。8. -種重組黑曲霉，其特征在于，所述的重組黑曲霉轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染有權(quán)利要求7所述的重 組質(zhì)粒。9. 權(quán)利要求4所述的植酸酶突變體在制備水產(chǎn)飼料中的應用。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種新型中性植酸酶，通過隨機突變的方法對植酸酶PHYA進行改造，獲得一種突變體蛋白，其氨基酸序列為SEQ ID NO：5。本發(fā)明篩選到的植酸酶突變體PHYAT5最適反應pH為6.5，在pH6.5-7.0范圍內(nèi)，能保持80％以上的酶活，當pH為8.0時，仍能保持35％的酶活，取得了意料不到的技術(shù)效果。與野生型相比，植酸酶突變體PHYAT5在中性范圍內(nèi)的酶活水平得到顯著提高，最適反應溫度未發(fā)生明顯變化。所述植酸酶突變體可廣泛應用于水產(chǎn)飼料中，從而有利于減少飼料中無機磷酸鹽的添加，降低養(yǎng)殖成本，同時還能有效減少水產(chǎn)動物糞磷對環(huán)境的污染。
【IPC分類】C12N9/16, C12N1/15, C12R1/685, A23K1/165, C12N15/80, A23K1/18, C12N15/55
【公開號】CN104911161
【申請?zhí)枴緾N201510405775
【發(fā)明人】徐曉東, 張霞, 吳秀秀, 王華明
【申請人】青島瑪斯特生物技術(shù)有限公司
【公開日】2015年9月16日
【申請日】2015年7月10日