一種中性植酸酶及其在水產(chǎn)飼料中應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體內(nèi)容涉及一種中性植酸酶突變體及其在水產(chǎn) 飼料中的應(yīng)用。 技術(shù)背景
[0002] 磷是魚類所必需的重要礦物元素之一，魚體對磷的需要量高于其他礦物元素但飼 料中過量的磷被認為是造成水體富營養(yǎng)化的重要因素之一。因此，通過提高魚類對原料中 磷的利用率，適當(dāng)調(diào)整飼料中磷的含量，使其更接近魚的需要量，來降低養(yǎng)殖魚類磷的排放 量，是減少水環(huán)境污染的重要途徑。
[0003] 植酸酶作為一種由微生物發(fā)酵生產(chǎn)的酶制劑，可分解植酸和植酸鹽，促進飼料中 植酸和植酸鹽的分解，使磷、磷酸根結(jié)合的內(nèi)源性酶和其它營養(yǎng)素得以釋放和利用，減少糞 磷對環(huán)境的污染，節(jié)省無機磷酸鹽的添加。多項研宄證明，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中植酸酶替代部分磷 酸二氫鈣表現(xiàn)出了較好的養(yǎng)殖效果和環(huán)境效益。羅琳等（2007)在基本花鱸試驗研宄表明 用中性植酸酶部分替代磷酸二氫鈣是完全可行的，并得出中性植酸酶l〇〇〇U/kg替代80% 左右的磷酸二氫鈣綜合生長效果最佳，也證明中性植酸酶存在一定的廣譜應(yīng)用性。近期研 宄還表明中性植酸酶在有胃和無胃水產(chǎn)動物均表現(xiàn)較好性能，可以在水產(chǎn)動物胃腸道中釋 放大量的有效磷。
[0004] 但當(dāng)前市場上的植酸酶以酸性植酸酶為主，在pH 2. 5和5. 5條件下活性最高，而 在無胃水產(chǎn)動物消化道中，由于沒有胃酸的分泌，消化道中PH約呈中性，不利于酸性植酸 酶發(fā)揮作用。因此目前急需開發(fā)一種在中性PH范圍內(nèi)具有較高酶活的植酸酶。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)問題，提供了一種新型中性植酸酶及其應(yīng)用。本發(fā)明通過 隨機突變的方法對植酸酶PHYA進行改造，獲得一種突變體蛋白，其pH適用范圍更偏向中性 條件，有利于其在水產(chǎn)飼料中的廣泛應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明一方面提供了一種植酸酶，其氨基酸序列為SEQ ID NO :1。
[0007] 所述植酸酶的一種編碼基因的核苷酸序列為SEQ ID NO :2。
[0008] 本發(fā)明另一方面提供了一種植酸酶突變體，是氨基酸序列為SEQ ID NO :1的植酸 酶的突變獲得的，其一種氨基酸序列為SEQ ID NO :3或5,對應(yīng)的編碼核苷酸序列為SEQ ID NO :4、6〇
[0009] 本發(fā)明另一方面提供攜帶有編碼序列為SEQ ID NO :3或5的植酸酶突變體基因的 質(zhì)粒。
[0010] 本發(fā)明再一方面提供了一種重組黑曲霉，是將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)入黑曲霉中構(gòu)建得到 的。
[0011] 本發(fā)明還提供了上述植酸酶突變體在水產(chǎn)飼料中應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明篩選到的植酸酶突變體PHYAT5最適反應(yīng)pH為6. 5,在pH6. 5-7. 0范圍內(nèi)， 能保持80%以上的酶活，當(dāng)pH為8. O時，仍能保持35%的酶活，取得了意料不到的技術(shù)效 果。與野生型相比，植酸酶突變體PHYAT5在中性范圍內(nèi)的酶活水平得到顯著提高，最適反 應(yīng)溫度未發(fā)生明顯變化。所述植酸酶突變體可廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)飼料中，從而有利于減少飼 料中無機磷酸鹽的添加，降低養(yǎng)殖成本，同時還能有效減少水產(chǎn)動物糞磷對環(huán)境的污染。
【附圖說明】
[0013] 圖1為植酸酶PHYA、PHYAT3和PHYAT5的pH-相對酶活曲線圖；
[0014] 圖2為植酸酶PHYA、PHYAT3和PHYAT5的溫度-相對酶活曲線圖。
【具體實施方式】
[0015] 本發(fā)明用到了遺傳工程和分子生物學(xué)領(lǐng)域使用的常規(guī)技術(shù)和方法，例如 MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed. (Sambrook,2001)和 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Ausubel, 2003)中所記載的方法。這些一般性參考文獻 提供了本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的定義和方法。但是，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以在本發(fā)明所記載 的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，采用本領(lǐng)域其它常規(guī)的方法、實驗方案和試劑，而不限于本發(fā)明具體 實施例的限定。
[0016] 下面結(jié)合【具體實施方式】對本發(fā)明進行詳細描述。
[0017] 實施例1植酸酶基因的獲得
[0018] 根據(jù)公共基因數(shù)據(jù)庫中的基因序列，優(yōu)化了合成基因的密碼子并人工合成來源于 黑曲霉（Aspergillus niger)的植酸酶基因 PHYA (序列為SEQ ID NO :2)，其編碼的氨基酸 序列為 SEQ ID NO :1。
[0019] PCR引物和反應(yīng)條件如下：
[0020] 引物 I(F) :GCGCGAATTCATGAGCTTCCGGTCCCTG
[0021] 引物 2 (R) : TAAAGCGGCCGCTTAGGCGAAGCACTCGGC
[0022] 反應(yīng)條件為：94°C變性5min ;然后94°C變性30s，56°C復(fù)性30s，72°C延伸I. 5min， 30個循環(huán)后，72°C保溫10min。瓊脂糖電泳結(jié)果顯示，PHYA基因大小為1395bp。
[0023] 實施例2植酸酶突變體的構(gòu)建及篩選
[0024] 為了提高植酸酶PHYA的在中性條件下的酶活水平，申請人通過定向進化技術(shù)對 該酶進行了大量突變的篩選。
[0025] 以PHYA基因為模板，以實施例1所述引物1、2用GeneMorph II隨機突變PCR試 劑盒（Stratagene)進行PCR擴增，膠回收PCR產(chǎn)物，EcoRI、NotI進行酶切處理后與經(jīng)同樣 酶切后的pET21a載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 (DE3)中，涂布于LB+Amp平板，37°C倒置 培養(yǎng)，待轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)后，用牙簽逐個挑至96孔板，每個孔中加入150ul含有0.1 mM IPTG的 LB+Amp培養(yǎng)基，37°C 220rpm培養(yǎng)6h左右，離心棄上清，菌體用pH 5. 0的緩沖液重懸，反復(fù) 凍融破壁，獲得含有植酸酶突變子的大腸桿菌細胞裂解液。
[0026] 分別取出40 μ 1裂解液至兩塊新的96孔板，其中一塊稀釋到pH 5. 0的緩沖液中， 另一塊稀釋到PH 7. 0的緩沖液中，分別加入相同pH值的20 μ 1底物，于37°C反應(yīng)30min 后，加入40ul終止液混勻以終止反應(yīng)，室溫放置IOmin顯色，分光光度計415nm處測定吸光 值。實驗結(jié)果顯示：大部分植酸酶突變體在PH 5. 0條件下的酶活高于在pH 7. 0條件下的 酶活，只有少數(shù)突變體在pH 7. O條件下酶活高于在pH 5. O條件下的酶活，還有一些突變體 在pH 5.0和pH7. O條件下的酶活水平比突變前均大幅下降。申請人通過對在pH 7. O條件 下的酶活水平顯著高于在pH 5. 0條件下酶活的突變體進行DNA測序，最終獲得了能提高植 酸酶PHYA在中性pH范圍內(nèi)酶活水平的突變組合：S87R、G159K、S198D三點突變體和A66P、 N102R、S189R、S190P、T270K 五點突變體。
[0027] 將S87R、G159K、S198D三點突變體命名為PHYAT3,其氨基酸序列為SEQ ID NO :3， 其編碼核苷酸序列為SEQ ID NO :4。
[0028] 將A66P、N102R、S189R、S190P、T270K五點突變體命名為PHYAT5,其氨基酸序列為 SEQ ID NO :5,其編碼核苷酸序列為SEQ ID NO :6。
[0029] 實施例3重組表達載體的構(gòu)建
[0030] 利用PCR分別擴增植酸酶突變體PHYAT3和PHYAT5的基因片段，引物兩端引入 XbaI位點。引物序列如下：
[0031] 引物 3(F) ：GCTCTAGAATGAGCTTCCGGTCCCTG
[0032] 引物 4(R) ：GCTCTAGATTAGGCGAAGCACTCGGC
[0033] PCR反應(yīng)條件為：94°C變性5min ;然后94°C變性3〇8,56°0復(fù)性3〇8,72°0延伸 I. 5min，30個循環(huán)后，72°C保溫lOmin。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，PHYAT3、PHYAT5基因為 大小1395bp的片段。
[0034] 將上述獲得的植酸酶突變體PHYAT3和PHYAT5基因片段與表達載體pGAU分別進 行限制性內(nèi)切酶XbaI單酶切，酶切條件如下：
[0037] 37°C水