0035]4)利用濃度2g/L氫氧化鈉溶液中和，透析，凍干，得到最終高分子量兩性離子透明質(zhì)酸多糖dHA-72。用高效液相凝膠色譜檢測(cè)其分子量為110kD(圖2)。
[0036]5)通過將去乙?；该髻|(zhì)酸再乙?；姆椒ǖ玫搅讼嗨品肿恿康耐该髻|(zhì)酸，用于活性的比較。具體為將凍干多糖溶于含5%的乙酸酐的飽和碳酸氫鈉溶液中，常溫?cái)嚢璺磻?yīng)30min，透析，凍干得HA-72。用高效液相凝膠色譜檢測(cè)其分子量為120kD(圖3)
[0037]實(shí)施例2多糖脾淋巴細(xì)胞的增值作用
[0038]I)脾淋巴細(xì)胞的獲得:取5只B6小鼠，充氮?dú)馓幩溃?0%酒精浸泡lOmin，無菌條件下剖開小鼠腹腔取脾，用注射器內(nèi)芯研磨過70微米的篩網(wǎng)，PBS液沖洗，再過40微米篩網(wǎng)，收集分離的脾細(xì)胞懸液分成五管，1000r/min離心5min，棄上清。每個(gè)離心管加氯化銨紅細(xì)胞裂解液12mL，混勻脾細(xì)胞，靜置5-6min，待紅細(xì)胞完全破碎，1000r/min離心5min，棄上清去除紅細(xì)胞，PBS洗1-2遍，用RPM1-1640(含10%胎牛血清)重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞濃度為8?10 X 16個(gè)/mL ；
[0039]2)藥物刺激脾細(xì)胞增值實(shí)驗(yàn):將獲得的脾淋巴細(xì)胞混合均勻，加入到96孔板中，每孔加90微升，然后分別加10微升PBS，HA-72 (lmg/mL)和dHA-72 (lmg/mL)，每組做六個(gè)平行孔，37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h，每孔加10微升MTT (5mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4h，離心，去掉上清，每孔加入200微升二甲基亞砜，用酶標(biāo)儀在570nm測(cè)定吸光度；
[0040]3)藥物與ConA和LPS協(xié)同刺激脾細(xì)胞中T，B細(xì)胞的增值:同步驟2)，將獲得的脾細(xì)胞鋪板，加藥，然后分別加 PBS，Con 和 LPS，Con+HA-72 (lmg/mL)，LPS+HA-72 (lmg/mL)，Con+dHA-72 (lmg/mL)，LPS+dHA-72 (lmg/mL)，每組做六個(gè)平行孔，培養(yǎng) 48h，加 MTT，培養(yǎng) 4h，加DMS0，測(cè)定吸光度。
[0041]4)根據(jù)吸光度作圖，比較藥物對(duì)脾細(xì)胞的增值作用，如圖4所示，結(jié)果顯示HA-72和dHA-72對(duì)脾細(xì)胞均有增值作用，而且兩性離子化透明質(zhì)酸dHA-72的作用明顯強(qiáng)于HA-72。此外，HA-72和dHA-72可以協(xié)同ConA和LPS刺激脾細(xì)胞增殖。
[0042]實(shí)施例3用TLR2-/-和TLR4-/-缺陷鼠做脾細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)
[0043]I)脾淋巴細(xì)胞的獲得同實(shí)施例2，分別獲得TLR2-/-和TLR4-/-以及其對(duì)照小鼠B6和BlO的脾細(xì)胞；
[0044]2)藥物刺激脾細(xì)胞增值實(shí)驗(yàn):同實(shí)施例2鋪板加藥，培養(yǎng)，檢測(cè)；
[0045]3)根據(jù)吸光度作圖，計(jì)算增殖率，比較藥物對(duì)脾細(xì)胞的增值作用是否依賴于TLR2或者TLR4途徑，如圖5所示，結(jié)果顯示HA-72對(duì)脾淋巴細(xì)胞的增值依賴于TLR4途徑，然而dHA-72對(duì)脾淋巴細(xì)胞的增值依賴于TLR2途徑。
[0046]實(shí)施例4多糖對(duì)CD3+T細(xì)胞增值作用
[0047]I)脾細(xì)胞的獲取步驟同實(shí)施例2 ；
[0048]2)CFSE染色:準(zhǔn)備單個(gè)細(xì)胞懸液，PBS洗兩次，洗掉血清，用預(yù)熱的PBS調(diào)整細(xì)胞濃度到5?1X 16個(gè)/mL，加CFSE到終濃度3微摩，混合，37°C避光培養(yǎng)lOmin，停止，加入4?5倍體積預(yù)冷的1640完全培養(yǎng)基，冰浴5min，用完全培養(yǎng)基洗滌三次，終止反應(yīng)；
[0049]3)鋪板，加藥:預(yù)染好的細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度到I X 16個(gè)/mL，加入到96孔板中，每孔加90微升，然后分別加10微升PBS，HA-72 (lmg/mL)和dHA-72 (lmg/mL)，37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h，收集細(xì)胞，PBS洗滌，ant1-⑶3+抗體4攝氏度避光染色30min，離心去掉多余的抗體，PBS洗滌3次，并加入I毫升PBS重懸細(xì)胞，流失細(xì)胞儀檢測(cè)⑶3+T細(xì)胞的增值。
[0050]4)如圖6所示，對(duì)結(jié)果進(jìn)行處理和分析，可以得出結(jié)論HA-72和dHA_72能夠促進(jìn)⑶3+T細(xì)胞增值，且作用相當(dāng)。
[0051]實(shí)施例5多糖對(duì)⑶19B細(xì)胞增值作用
[0052]I)脾細(xì)胞的獲取步驟同實(shí)施例2 ；
[0053]2) CFSE染色同案例4 ;
[0054]3)鋪板，加藥:預(yù)染好的細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度到I X 16個(gè)/mL，加入到96孔板中，每孔加90微升，然后分別加10微升PBS，HA-72 (lmg/mL)和dHA-72 (lmg/mL)，37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h，收集細(xì)胞，PBS洗滌，ant1-⑶19抗體4攝氏度避光染色30min，離心去掉多余的抗體，PBS洗滌3次，并加入I毫升PBS重懸細(xì)胞，流失細(xì)胞儀檢測(cè)⑶19B細(xì)胞的增值；
[0055]4)如圖7所示，對(duì)結(jié)果進(jìn)行處理和分析，可以得出結(jié)論HA-72和dHA_72能夠促進(jìn)⑶19B細(xì)胞增值，且dHA-72的促增值作用明顯強(qiáng)于HA-72。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種高分子量去乙?；该髻|(zhì)酸的制備方法，其特征在于包括以下步驟: 1)無水肼的制備 在30mL —水合肼中加入12g氫氧化鉀，4°C過夜，取上清，加入12g氫氧化鈉，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，加熱回流2h，收集蒸餾液，得到無水肼； 2)將透明質(zhì)酸用含無水肼溶解，脫氧氮?dú)獗Ｗo(hù)后在60°C反應(yīng)72h; 3)反應(yīng)產(chǎn)物用冷乙醇沉淀，沉淀溶于濃度5%的冰乙酸中，加入濃度為5g/L的碘酸，4°C放置2h ； 4)利用濃度2g/L氫氧化鈉溶液中和，透析，凍干，得到最終高分子量兩性離子透明質(zhì)酸多糖。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高分子量去乙?；该髻|(zhì)酸的制備方法，其特征在于:步驟(I)中所得無水肼的純度為90?94%。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高分子量去乙酰化透明質(zhì)酸的制備方法，其特征在于:步驟(2)中所述的無水肼含有重量質(zhì)量濃度I %的硫酸聯(lián)氨。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高分子量去乙?；该髻|(zhì)酸的制備方法，其特征在于:步驟(3)中過量的碘酸通過加入濃度57%氫碘酸，通過乙醚萃取去掉生成的碘。5.權(quán)利要求1制備方法所得高分子量去乙?；该髻|(zhì)酸在制備治療免疫疾性疾病藥物中的應(yīng)用。6.根據(jù)權(quán)利要求5的應(yīng)用，其特征在于:所述的免疫性疾病為原發(fā)性免疫缺陷病、繼發(fā)性免疫缺陷病、自身免疫疾病或急性感染。7.根據(jù)權(quán)利要求5的應(yīng)用，其特征在于:所述的藥物為片劑、膠囊劑、顆粒劑、糖漿劑、凍干粉針劑或注射液。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高分子量去乙酰化透明質(zhì)酸的制備方法及其應(yīng)用，通過將透明質(zhì)酸用含1％硫酸聯(lián)氨的無水肼溶解，脫氧氮?dú)獗Ｗo(hù)后在60℃反應(yīng)72h，反應(yīng)產(chǎn)物用冷乙醇沉淀，沉淀溶于5％的冰乙酸中，加入0.5M的碘酸，4℃放置2h,過量的碘酸通過加入57％氫碘酸。再通過乙醚萃取去掉生成的碘，中和，凍干既得。本發(fā)明中的兩性離子透明質(zhì)酸多糖用于免疫疾病的用途，療效顯著，無副作用。
【IPC分類】A61P37/00, C08B37/08
【公開號(hào)】CN104910294
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510309912
【發(fā)明人】段金友, 張武霞, 李鵬, 王冬冬
【申請(qǐng)人】西北農(nóng)林科技大學(xué)
【公開日】2015年9月16日
【申請(qǐng)日】2015年6月5日