一種高分子量去乙?；该髻|(zhì)酸的制備方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于多糖修飾技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高分子量去乙?；该髻|(zhì)酸的制備方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]多糖是由單糖連接而成的多聚物，人們對多糖的初始研宄可追溯到1936年Shear對多糖抗腫瘤活性的發(fā)現(xiàn)。至50年代，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)一些真菌多糖和高等植物多糖具有明顯的抑瘤活性。70年代以來，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)多糖及糖復(fù)合物參與和介導(dǎo)了細(xì)胞各種生命現(xiàn)象的調(diào)節(jié)，特別是免疫功能的調(diào)節(jié)。
[0003]透明質(zhì)酸(Hyaluronic acid，HA)是由乙酰氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸通過β _1，4和β_1，3交替連接而成的酸性多糖，是構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞間質(zhì)的主要成分之一，是細(xì)胞間的填充物，對于皮膚的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能起著重要的作用平均相對分子質(zhì)量為105?107。1934年Meyer和Palmer從牛眼玻璃體中首次分離出透明質(zhì)酸，這是個(gè)以葡萄糖胺和葡萄糖酸為最小單位的粘性多糖、廣泛存在于哺乳動(dòng)物的水晶體，關(guān)節(jié)液、臍帶兒中。在非哺乳動(dòng)物中主要存在于公雞的雞冠，魚皮、蠶的胃腔壁和連鎖球菌的夾膜中。由于透明質(zhì)酸具有保濕、修護(hù)、營養(yǎng)等作用，對皮膚有良好的親合性且使用安全，其在醫(yī)藥、化妝品、食品等領(lǐng)域有廣泛而獨(dú)特的應(yīng)用價(jià)值。透明質(zhì)酸以其獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)在機(jī)體內(nèi)顯示出多種重要的生理功能。
[0004]透明質(zhì)酸大量存在于人體的結(jié)締組織及真皮層中，在老年人體內(nèi)經(jīng)特有的去乙酰化酶脫乙?；揎椇?，實(shí)際上形成了去乙?；该髻|(zhì)酸兩性離子多糖，其與兩性離子多糖，PSA和SPl有著類似的。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，與青年人相比，老齡人體內(nèi)存在更多的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，其在阻止老齡化過程中因細(xì)胞碎肩累積而誘發(fā)的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。目前尚不清楚老齡人體內(nèi)特有的這種內(nèi)源性兩性離子多糖是否與該年齡群體富含調(diào)節(jié)性T細(xì)胞現(xiàn)象有關(guān)。
[0005]現(xiàn)有的透明質(zhì)酸的去乙?；姆椒ò溲趸c去乙酰化以及水合肼去乙?；?，通過實(shí)驗(yàn)證明，氫氧化鈉的方法由于堿性太強(qiáng)，高濃度的氫氧化鈉同意造成糖苷鍵的急劇斷裂，無法得到高分子量的產(chǎn)物，而低濃度的氫氧化鈉又無法取得很好的去乙?；Ч?，同樣，水合肼的去乙酰化效果也不是很理想，無法得到高去乙酰化高分子量的兩性離子化透明質(zhì)酸。因此，我們發(fā)明了一種有效的方法來克服這一難題。并將其應(yīng)用于免疫治療，實(shí)驗(yàn)顯示有良好的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明針對現(xiàn)有透明質(zhì)酸去乙酰化技術(shù)手段存在的缺陷，提出一種有效的高分子量去乙酰化透明質(zhì)酸的制備方法，該兩性離子多糖具有激活巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子以及促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖的作用，且效果顯著，無副作用。
[0007]本發(fā)明具體通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0008]一種高分子量去乙?；该髻|(zhì)酸的制備方法，包括以下步驟:
[0009]I)無水肼的制備
[0010]在30mL —水合肼中加入12g氫氧化鉀，4°C過夜，取上清，加入12g氫氧化鈉，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，加熱回流2h，收集蒸餾液，得到無水肼；
[0011]2)將透明質(zhì)酸用含無水肼溶解，脫氧氮?dú)獗Ｗo(hù)后在60°C反應(yīng)72h ;
[0012]3)反應(yīng)產(chǎn)物用冷乙醇沉淀，沉淀溶于濃度5%的冰乙酸中，加入濃度為5g/L的碘酸，4°C放置2h ;
[0013]4)利用濃度2g/L氫氧化鈉溶液中和，透析，凍干，得到最終高分子量兩性離子透明質(zhì)酸多糖。
[0014]本發(fā)明步驟⑴中所得無水肼的純度為90?94%。
[0015]本發(fā)明步驟⑵中所述的無水肼含有重量質(zhì)量濃度I %的硫酸聯(lián)氨。
[0016]本發(fā)明步驟(3)中過量的碘酸通過加入濃度57%氫碘酸，通過乙醚萃取去掉生成的碘。
[0017]本發(fā)明的另一目的在于上述所得高分子量去乙?；该髻|(zhì)酸在制備治療免疫性疾病藥物中的應(yīng)用。
[0018]本發(fā)明所述的免疫性疾病為原發(fā)性免疫缺陷病、繼發(fā)性免疫缺陷病、自身免疫疾病或急性感染。
[0019]本發(fā)明所述的藥物可以按需要加工成任何醫(yī)藥上可接受的劑型，其中較優(yōu)選的劑型為片劑、膠囊劑、顆粒劑、糖漿劑、凍干粉針劑或注射液。其配制可由通常的本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的加工方法制備，即將高分子量去乙?；该髻|(zhì)酸與液體溶劑或固體載體混合后，再加入填充劑、粘合劑、潤濕劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、溶劑、表明活性劑、香味劑、防腐劑、潤滑劑、甜味劑或色素中的一種或幾種。
[0020]本發(fā)明所述的藥物可以由使用者在使用前經(jīng)稀釋或直接使用。
[0021]本發(fā)明的有益效果為:不同分子量的透明質(zhì)酸多糖在體內(nèi)具有不同的生物功能，在疾病狀況下也會(huì)發(fā)生降解，而且透明質(zhì)酸的去乙?；潭入S著年齡的增長逐漸增加，所以獲得高分子量的去乙?；该髻|(zhì)酸有著重要的意義?，F(xiàn)有的透明質(zhì)酸的去乙?；姆椒o法取得很好的去乙?；Ч?。本發(fā)明的去乙酰化的方法過程易于操作，時(shí)間短，最重要的是能夠同時(shí)滿足高分子量高去乙?；囊?，從而對其生物活性及應(yīng)用的研宄。
【附圖說明】
[0022]圖1是本發(fā)明高分子量去乙?；该髻|(zhì)酸的合成路線；
[0023]圖2是本發(fā)明高分子量去乙?；该髻|(zhì)酸dHA-72的高效液相凝膠色譜圖；
[0024]圖3是本發(fā)明再乙酰化的透明質(zhì)酸HA-72的高效液相凝膠色譜圖；
[0025]圖4是高分子量去乙?；该髻|(zhì)酸dHA-72和再乙酰化的透明質(zhì)酸HA-72單獨(dú)以及在ConA和LPS存在下對脾細(xì)胞的增值作用；A為dHA_72、HA-72, LPS單獨(dú)對脾細(xì)胞的增值作用為在ConA和LPS存在下對脾細(xì)胞的增值作用；
[0026]圖5是dHA-72和HA-72對脾細(xì)胞的增值作用；A為小鼠B6脾細(xì)胞的增值作用；B為小鼠BlO脾細(xì)胞的增值作用；
[0027]圖6 是對 CD3+T 細(xì)胞的作用；A 為 PBS ；B 為 ConA ；C 為 HA-72 ；D 為 dHA-72 ；
[0028]圖7是對CD19B細(xì)胞的增值作用；A為PBS ；B為LPS ；C為HA-72 ；D為dHA-72。
【具體實(shí)施方式】
[0029]下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明，以下所述，僅是對本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非對本發(fā)明做其他形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容加以變更為同等變化的等效實(shí)施例。凡是未脫離本發(fā)明方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對以下實(shí)施例所做的任何簡單修改或等同變化，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0030]實(shí)施例1高分子量去乙?；该髻|(zhì)酸的制備
[0031]如圖1所示，一種高分子量去乙?；嗵堑闹苽浞椒ǎ唧w包括以下步驟:
[0032]I)無水肼的制備:30mL—水合肼加入12克氫氧化鉀，4°C過夜，取上清，加入12克氫氧化鈉，氮?dú)獗Ｗo(hù)，加熱回流2小時(shí)，改為蒸餾裝置，收集蒸餾液，得到90-94%的無水肼。
[0033]2)將透明質(zhì)酸用含重量質(zhì)量濃度I %的硫酸聯(lián)氨的無水肼溶解，脫氧氮?dú)獗Ｗo(hù)后在60°C反應(yīng)72h ；
[0034]3)反應(yīng)產(chǎn)物用冷乙醇沉淀，沉淀溶于濃度5%的冰乙酸中，加入濃度為5g/L的碘酸，4°C放置2h，過量的碘酸通過加入濃度57%氫碘酸，通過乙醚萃取去掉生成的碘；
[