專利名稱：用于產(chǎn)生乙酰透明質(zhì)酸的改良的方法和手段的制作方法
專利說明用于產(chǎn)生乙酰透明質(zhì)酸的改良的方法和手段 本發(fā)明涉及合成增加的乙酰透明質(zhì)酸量的植物細(xì)胞和植物，以及用于制備這類植物的方法，也涉及借助于這些植物細(xì)胞或植物制備乙酰透明質(zhì)酸的方法。在此，與野生型植物細(xì)胞或野生型植物相比較，根據(jù)本發(fā)明的植物細(xì)胞或經(jīng)遺傳修飾的植物具有乙酰透明質(zhì)酸合成酶活性和額外的增加的谷氨酰胺果糖6-磷酸酰胺轉(zhuǎn)移酶(GFAT)活性和增加的UDP葡萄糖脫氫酶(UDP-Glc-DH)活性。此外，本發(fā)明還涉及具有增加的乙酰透明質(zhì)酸合成的植物在制備乙酰透明質(zhì)酸和含有乙酰透明質(zhì)酸的食物或飼料中的應(yīng)用。
乙酰透明質(zhì)酸是是天然存在的無支鏈的線性粘多糖(葡糖胺聚糖)，其由交替的葡糖醛酸和N-乙?；?葡糖胺構(gòu)成。乙酰透明質(zhì)酸的結(jié)構(gòu)單元由二糖葡糖醛酸-β-1，3-N-乙酰基-葡糖胺組成。在乙酰透明質(zhì)酸中，這些重復(fù)單元通過β-1，4鍵彼此相連。
在藥學(xué)中，經(jīng)常使用術(shù)語透明質(zhì)酸。由于在大多數(shù)情況中乙酰透明質(zhì)酸作為聚陰離子而不是作為游離酸存在，因此在下文，優(yōu)選使用術(shù)語乙酰透明質(zhì)酸，但是每個(gè)術(shù)語都應(yīng)理解為包含這兩類分子形式。
乙酰透明質(zhì)酸具有不尋常的理化特性，例如，諸如聚電解質(zhì)的特性、粘彈性質(zhì)、高度結(jié)合水的能力、凝膠形成的特性等，這些連同乙酰透明質(zhì)酸的其它特性描述于Lapcik等的綜述文章中(1998，chemical Reviews98(8)，2663-2684)。
乙酰透明質(zhì)酸是脊椎動物的胞外結(jié)締組織和體液的成分。在人類中，透明質(zhì)酸由所有體細(xì)胞的細(xì)胞膜合成，尤其是間充質(zhì)細(xì)胞，并且普遍存在于體內(nèi)，其中在結(jié)締組織、胞外基質(zhì)、臍帶、關(guān)節(jié)液、軟骨組織、皮膚和眼的玻璃體中濃度尤其地高(Bernhard Gebauer，1998，Inaugural-Dissertation，Virchow-Klinikum Medizinische

Charitéder Humboldt

zu Berlin；Fraser等，1997，Journal of InternalMedicine 242，27-33)。
最近，也在非脊椎動物生物體(軟體動物)中發(fā)現(xiàn)了乙酰透明質(zhì)酸(Volpi和Maccari，2003，Biochimie 85，619-625)。
此外，由于乙酰透明質(zhì)酸是非免疫原性物質(zhì)，因此一些致病性革蘭氏陽性細(xì)菌(A和C組鏈球菌(Streptococcus))和革蘭氏陰性細(xì)菌(巴斯德氏菌(Pasteurella))合成乙酰透明質(zhì)酸作為外泌多糖，以保護(hù)這些細(xì)菌抵抗其宿主免疫系統(tǒng)的攻擊。
感染小球藻(Chlorella)屬單細(xì)胞綠藻的病毒(其中有些在草履蟲(Paramecium)物種中作為內(nèi)共生體存在)在病毒感染后賦予單細(xì)胞綠藻合成乙酰透明質(zhì)酸的能力(Graves等，1999，Virology 257，15-23)。然而，合成乙酰透明質(zhì)酸的能力不是所討論藻類特有的特征。藻類合成乙酰透明質(zhì)酸的能力是由病毒感染介導(dǎo)的，所述病毒基因組具有編碼乙酰透明質(zhì)酸合成酶的序列(DeAngelis，1997，Science 278，1800-1803)。此外，病毒基因組含有編碼UDP-葡萄糖脫氫酶(UDP-Glc-DH)和谷氨酰胺果糖6-磷酸酰胺轉(zhuǎn)移酶(GFTA)的序列。UDP-Glc-DH催化用作乙酰透明質(zhì)酸合成酶底物的UDP-葡糖醛酸的合成。GFTA將6-磷酸果糖和谷氨酰胺轉(zhuǎn)換成葡糖胺6-磷酸，其為在例如細(xì)茵的乙酰透明質(zhì)酸合成的代謝路徑中的重要代謝產(chǎn)物。兩個(gè)algeal基因都編碼活性蛋白質(zhì)，它們象病毒的乙酰透明質(zhì)酸合成酶一樣，在病毒感染的早期同時(shí)轉(zhuǎn)錄(DeAngelis等，1997，Science 278，1800-1803，Graves等，1999，Virology 257，15-23)。具有谷氨酰胺6-磷酸果糖酰胺轉(zhuǎn)移酶(GFTA)活性的蛋白的活性既不能在沒有感染病毒的細(xì)胞提取物中檢測到，也不能在病毒感染的細(xì)胞中檢測到(Landstein等，1998，Virology 250，388-396)。因此，在病毒感染的小球藻細(xì)胞中用于乙酰透明質(zhì)酸合成的UDP-Glc-DH和GFAT表達(dá)的作用，以及它們是否為乙酰透明質(zhì)酸合成所需，是不為所知的。
天然存在的植物本身在它們的基因組中沒有任何編碼催化乙酰透明質(zhì)酸合成的蛋白質(zhì)的核酸，盡管已描述并表征了大量植物碳水化合物，但是迄今尚不可能在未感染的天然存在的植物中檢測到乙酰透明質(zhì)酸或與乙酰透明質(zhì)酸相關(guān)的分子(Graves等，1999，Virology 257，15-23)。
乙酰透明質(zhì)酸合成的催化是通過單一的膜整合或膜結(jié)合酶乙酰透明質(zhì)酸合成酶而實(shí)現(xiàn)的。可將迄今已研究的乙酰透明質(zhì)酸合成酶分成兩組I類乙酰透明質(zhì)酸合成酶和II類乙酰透明質(zhì)酸合成酶(DeAngelis，1999，CMLS，Cellular and Molecular Life Sciences 56，670-682)。
通過所鑒定的同工酶進(jìn)一步對脊椎動物的乙酰透明質(zhì)酸合成酶進(jìn)行了區(qū)分。使用阿拉伯?dāng)?shù)字按照它們的鑒定順序命名不同的同工酶(例如，hsHAS1、hsHAS2、hsHAS3)。
將合成的乙酰透明質(zhì)酸分子穿過細(xì)胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)移到細(xì)胞周圍介質(zhì)的機(jī)制還沒有完全被闡明。較早的假說認(rèn)為穿過細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)是通過乙酰透明質(zhì)酸合成酶本身實(shí)現(xiàn)的。然而，較新的結(jié)果表明乙酰透明質(zhì)酸穿過細(xì)胞質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)通過由負(fù)責(zé)這一行為的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行能量依賴的轉(zhuǎn)運(yùn)完成。因此，通過突變產(chǎn)生了鏈球菌株，該菌株中主動轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的合成被抑制了。這一菌株與相應(yīng)的野生型細(xì)菌菌株相比較，合成了較少的乙酰透明質(zhì)酸(Ouskova等，2004，Glycobiology 14(10)，931-938)?？梢酝普摚谌顺衫w維細(xì)胞中，借助于特異抑制已知轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的試劑，有可能減少乙酰透明質(zhì)酸的產(chǎn)量和乙酰透明質(zhì)酸合成酶的活性(Prehm和Schumacher，2004，Biochemical Pharmacology 68，1401-1410)。目前還不知道其中在植物中存在的能夠轉(zhuǎn)運(yùn)乙酰透明質(zhì)酸的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的量(如果有的話)。
乙酰透明質(zhì)酸不尋常的特性提供了在各領(lǐng)域應(yīng)用的許多可能性，例如，諸如在藥物、化妝品工業(yè)、在食品和飼料的生產(chǎn)方面、在技術(shù)應(yīng)用(例如潤滑劑)方面等等。當(dāng)前使用乙酰透明質(zhì)酸的最重要的應(yīng)用是在醫(yī)學(xué)和化妝品領(lǐng)域(見，例如，Lapcik等，1998，Chemical Reviews 98(8)，2663-2684，Goa和Benfield，1994，Drugs 47(3)，536-566)。
在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，當(dāng)前含乙酰透明質(zhì)酸的產(chǎn)品用于關(guān)節(jié)病的關(guān)節(jié)內(nèi)治療以及眼外科的眼藥。乙酰透明質(zhì)酸也用于治療賽馬的關(guān)節(jié)病。另外，透明質(zhì)酸是某些鼻科藥的成分，例如以眼滴劑和鼻劑的形式，用于濕潤干燥的粘膜。使用含乙酰透明質(zhì)酸的注射用溶液作為止痛藥和抗風(fēng)濕藥。含乙酰透明質(zhì)酸或衍生的乙酰透明質(zhì)酸的貼劑被用于傷口愈合。至于皮膚病，使用含乙酰透明質(zhì)酸的凝膠植入物在整形外科中用于糾正皮膚變形。
對于藥學(xué)應(yīng)用，優(yōu)選使用具有高分子量的乙酰透明質(zhì)酸。
在化妝醫(yī)藥領(lǐng)域，乙酰透明質(zhì)酸制品屬于最適宜的皮膚填充材料。通過在有限的時(shí)間期間注射乙酰透明質(zhì)酸，可消除皺紋或增加唇厚。
在化妝產(chǎn)品中，特別是在皮膚霜?jiǎng)┖突瘖y水中，由于其高的水結(jié)合能力，乙酰透明質(zhì)酸常常用作濕潤劑。
此外，還以所謂的營養(yǎng)保健品(nutraceuticals)(食物補(bǔ)充物)銷售含乙酰透明質(zhì)酸的制品，其也可在動物(例如狗、馬)中用于關(guān)節(jié)病的預(yù)防和緩解。
用于商業(yè)目的的乙酰透明質(zhì)酸目前從動物組織(公雞雞冠)中分離或使用細(xì)菌培養(yǎng)物發(fā)酵制備。
US 4,141,973描述了從公雞雞冠或者可選地從臍帶中分離乙酰透明質(zhì)酸的方法。除了乙酰透明質(zhì)酸，動物組織(例如公雞雞冠、臍帶)也含有與乙酰透明質(zhì)酸有關(guān)的其他粘多糖，如硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸角質(zhì)素、硫酸乙酰肝素和肝素。此外，動物生物體含有特異性結(jié)合乙酰透明質(zhì)酸的蛋白質(zhì)(透明質(zhì)酸粘素(hyaladherin))，并且其對于生物體中的大多數(shù)不同的功能是必需的，例如，諸如肝臟中乙酰透明質(zhì)酸的降解，乙酰透明質(zhì)酸作為前導(dǎo)結(jié)構(gòu)用于細(xì)胞遷移、調(diào)控胞吞的功能、乙酰透明質(zhì)酸在細(xì)胞表面的錨定或乙酰透明質(zhì)酸網(wǎng)絡(luò)的形成(Turley，1991，Adv Drug DeliveryRev 7，257 ff.；Laurent和Fraser，1992，F(xiàn)ASEB J.6，183 ff.；Stamenkovic和Aruffo，1993，Methods Enzymol.245，195 ff；Knudson和Knudson，1993，F(xiàn)ASEB 7，1233 ff.)。
用于通過細(xì)菌生產(chǎn)乙酰透明質(zhì)酸的鏈球菌菌株全部是致病性細(xì)菌。在培養(yǎng)期間，這些細(xì)菌也產(chǎn)生釋放到培養(yǎng)基中的(熱原性)外毒素和溶血素(鏈球菌溶血素，特別是α-和β-溶血素)(Kilian，MStreptococcus andEnterococcus.在Medical Microbiology中.Greenwood，D.；Slack，RCA；Peutherer，J.F.(編輯).第16章.Churchill Livingstone，Edinburgh，UK174-188頁，2002，ISBN 0443070776)。這使得通過鏈球菌菌株所制備的乙酰透明質(zhì)酸的純化和分離更為困難。特別是對于藥物應(yīng)用，制劑中外毒素和溶血素的存在是個(gè)問題。
US4,801,539描述了通過誘變的細(xì)菌菌株(獸疫鏈球菌(Streptococcuszooedemicus))發(fā)酵制備乙酰透明質(zhì)酸。所使用的誘變的細(xì)菌菌株不再合成β-溶血素。產(chǎn)量達(dá)到每升培養(yǎng)物3.6克乙酰透明質(zhì)酸。
EP 0694616描述了培養(yǎng)獸疫鏈球菌或馬鏈球菌(Streptococcus equi)的方法，其中，在所使用的培養(yǎng)條件下無鏈球菌溶血素，但合成了增產(chǎn)的乙酰透明質(zhì)酸。產(chǎn)量達(dá)到每升培養(yǎng)物3.5克乙酰透明質(zhì)酸。
在培養(yǎng)期間，鏈球菌菌株將透明質(zhì)酸酶釋放到培養(yǎng)基中，結(jié)果在該生產(chǎn)系統(tǒng)中，在純化期間也降低了分子量。在US 4,782,046描述了使用透明質(zhì)酸酶陰性鏈球菌菌株或使用在培養(yǎng)期間抑制透明質(zhì)酸酶產(chǎn)生的生產(chǎn)乙酰透明質(zhì)酸的方法。所達(dá)到的產(chǎn)量高達(dá)每升培養(yǎng)物2.5克乙酰透明質(zhì)酸，所達(dá)到的最大平均分子量是3.8×106Da，分子量分布在2.4×106至4.0×106。
US 20030175902和WO 03 054163描述了通過在枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)中異源表達(dá)類馬鏈球菌(Streptococcus equisimilis)乙酰透明質(zhì)酸合成酶制備乙酰透明質(zhì)酸。為了實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)足夠量的乙酰透明質(zhì)酸，除了乙酰透明質(zhì)酸合成酶的異源表達(dá)，也需要在芽孢桿菌(Bacillus)細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)UDP-葡萄糖脫氫酶。US 20030175902和WO 03 054163沒有陳述在借助于枯草芽孢桿菌的生產(chǎn)中所獲得的乙酰透明質(zhì)酸的絕對量。所達(dá)到的最大平均分子量是約4.2×106。然而，該平均分子量僅是重組芽孢桿菌株所達(dá)到的，其中將編碼類馬鏈球菌乙酰透明質(zhì)酸合成酶的基因和編碼枯草芽孢桿菌UDP-葡萄糖脫氫酶的基因整合到amyQ啟動子控制下的枯草芽孢桿菌基因組中，其中同時(shí)使枯草芽孢桿菌內(nèi)源的cxpY基因(其編碼細(xì)胞色素P450氧化酶)失活。
WO 05 012529描述了用來自感染小球藻的病毒的編碼乙酰透明質(zhì)酸合成酶的核酸分子轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因煙草植物的制備。在WO 05 012529中，一方面利用了小球藻病毒株CVHI1的乙酰透明質(zhì)酸合成酶的編碼核酸序列，以及在另一方面，利用了小球藻病毒株CVKA1轉(zhuǎn)化煙草植物。只有在用從小球藻病毒株CVKA1分離的編碼乙酰透明質(zhì)酸的核酸序列轉(zhuǎn)化的植物中才能證實(shí)有乙酰透明質(zhì)酸的合成。對于用從小球藻病毒株CVHI1分離的編碼乙酰透明質(zhì)酸的核酸序列轉(zhuǎn)化的煙草植物，不可能在相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因植物中檢測到乙酰透明質(zhì)酸。在WO 05 012529中唯一能夠生產(chǎn)乙酰透明質(zhì)酸的轉(zhuǎn)基因植物合成乙酰透明質(zhì)酸的量被陳述為大約是每ml測定的體積4.2μg乙酰透明質(zhì)酸，考慮到進(jìn)行所討論實(shí)驗(yàn)的說明，該量大約對應(yīng)于每克植物材料鮮重產(chǎn)生至多12μg的乙酰透明質(zhì)酸的量。
乙酰透明質(zhì)酸合成酶催化從起始物UDP-N-乙酰-葡糖胺和UDP-葡糖醛酸合成乙酰透明質(zhì)酸。兩種提到的起始物都存在于植物細(xì)胞中。
在植物細(xì)胞中，UDP-葡糖醛酸是合成抗壞血酸的多個(gè)途徑之一的代謝物(Lorence等，2004，Plant Physiol 134，1200-1205)以及是在植物細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成的細(xì)胞壁成分果膠和半纖維素合成的關(guān)鍵代謝物(Reiter，1998，Plant Physiol Biochem 36(1)，167-176)。最重要的和最經(jīng)常存在的果膠單體是用UDP-葡糖醛酸合成的D-半乳糖醛酸(2004，H.W.Heldt，″PlantBiochemistry″，第3版，Academic Press，ISBN 0120883910)。此外，尤其也可能用UDP-葡糖醛酸合成UDP-木糖、UDP-阿拉伯糖、UDP-半乳糖醛酸和UDP-芹菜糖、以及用于半纖維素和果膠合成的代謝物(Seitz等，2000，Plant Journal，21(6)，537-546)。在植物細(xì)胞中，可以通過己醣磷酸代謝(尤其包括通過UDP-Glc-DH將UDP-葡萄糖轉(zhuǎn)換到UDP-葡糖醛酸)，或通過氧化肌醇代謝(包括通過葡萄糖醛酸1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶將葡萄糖醛酸1-磷酸轉(zhuǎn)換到UDP-葡糖醛酸的)合成UDP-葡糖醛酸酸。合成葡萄糖醛酸的兩個(gè)代謝途徑顯示出彼此獨(dú)立存在并且在擬南芥(Arabidopsis)植物的不同組織/生長階段是可選擇的(Seitz等，2000，Plant Journal 21(6)，537-546)。所提到的兩個(gè)代謝途徑(己醣磷酸或氧化肌醇代謝)分別對UDP-葡糖醛酸合成的貢獻(xiàn)還沒有被闡明(

2005，PlantBiosystems 139(1)，46-49)。
酶UDP-Glc-DH催化UDP-葡萄糖到UDP-葡糖醛酸的轉(zhuǎn)換。Samac等(2004，Applied Biochemistry and Biotechnology 113-116，HumanaPress，編輯Ashok Mulehandani，1167-1182)描述了在苜蓿(Alfalfa)韌皮部細(xì)胞中大豆UDP-Glc-DH的組織特異性過量表達(dá)，目的是增加在這些植物莖中的果膠含量。與相應(yīng)的野生型植物相比較，UDP-Glc-DH的活性增加了200％以上；然而，相應(yīng)植物生產(chǎn)的果膠量低于相應(yīng)野生型植物生產(chǎn)的果膠量。所討論的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞壁部分中的木糖和鼠李糖單體的量增加了，而細(xì)胞壁部分的甘露糖單體的量減少了。
在擬南芥(Arabidosis)植物中UDP-Glc-DH的組成型過量表達(dá)導(dǎo)致了所討論的植物與相應(yīng)的野生型植物相比的異常生長和矮小植物表型。與相應(yīng)的野生型植物相比較，相應(yīng)植物的細(xì)胞壁部分含有增加的甘露糖和半乳糖的量和減少的木糖、阿拉伯糖和糖醛酸的量(Roman，2004，″對多糖生物合成中UDP-Glc-DH作用的研究(Studies on The Role of UDP-Glc-DHin Polysaccharide Biosynthesis)″，博士論文，Acta UniversitatisUpsaliensis，ISBN 91-554-6088-7，ISSN 0282-7476)。因此，這些結(jié)果至少部分地否定了Samac等的結(jié)果(2004，Applied Biochemistry andBiotechnology 113-116，Humana Press，Editor Ashok Mulehandani，1167-1182)，Samac等在相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因植物的細(xì)胞壁部分檢測到了減少的甘露糖的量和增加的木糖的量。
為在植物細(xì)胞中合成UDP-N-乙酰葡糖胺，WO 98 35047描述了一種代謝途徑，其中葡糖胺被許多連續(xù)的酶催化反應(yīng)步驟轉(zhuǎn)換為UDP-N-乙酰葡糖胺，這些反應(yīng)步驟有代謝物N-乙酰-葡糖胺，N-乙酰-葡糖胺6-磷酸，N-乙酰-葡糖胺1-磷酸的生成?？蛇x擇的代謝途徑包含果糖6-磷酸和谷氨酰胺生成葡糖胺6-磷酸的反應(yīng)，葡糖胺6-磷酸隨后被一些連續(xù)的酶催化反應(yīng)步驟轉(zhuǎn)換到UDP-N-乙酰葡糖胺，這些反應(yīng)步驟有代謝物葡糖胺-1磷酸和N-乙酰-葡糖胺1-磷酸的生成。果糖6-磷酸和谷氨酰胺生成葡糖胺6-磷酸的轉(zhuǎn)換通過具有谷氨酰胺果糖6-磷酸酰胺轉(zhuǎn)移酶(GFAT)活性的蛋白催化(Mayer等，1968，Plant Physiol.43，1097-1107)。
WO 00 11192描述了在轉(zhuǎn)基因玉米中的胚乳特異性的玉米核酸分子的過量表達(dá)，其編碼具有GFAT酶活性的蛋白，目的是在具有2-氨基-葡糖酐分子的植物中合成陽離子淀粉。根據(jù)WO 00 11192的說明書，描述的代謝途徑會導(dǎo)致2-氨基-葡糖酐被摻入淀粉中，尤其包括UDP-葡糖胺被淀粉合成酶和/或糖原合成酶摻入到淀粉中。據(jù)說能在所討論的轉(zhuǎn)基因玉米植物胚乳的面粉中檢測到增加的UDP-葡糖胺的量，該植物過量表達(dá)了與質(zhì)體信號肽翻譯地融合的編碼具有GFAT(酶的)活性的蛋白的核酸分子。當(dāng)具有GFAT(酶的)活性的蛋白在沒有信號肽而表達(dá)時(shí)，能在相應(yīng)的來自玉米胚乳組織的面粉中檢測到增加的葡糖胺1-磷酸的量。在轉(zhuǎn)基因植物中不可能檢測到陽離子淀粉。
由于細(xì)菌必需在昂貴可控的培養(yǎng)條件下在密封的無菌容器中發(fā)酵(見，例如，US 4,897,349)，因此通過發(fā)酵細(xì)菌菌株生產(chǎn)乙酰透明質(zhì)酸成本高。此外，可通過細(xì)菌菌株的發(fā)酵所生產(chǎn)的乙酰透明質(zhì)酸的量受每種情況下存在的生產(chǎn)設(shè)備的限制。這方面也必需考慮，由于物理規(guī)律，發(fā)酵罐不能建成具有非常大的培養(yǎng)體積。這里特別提到的是，在大發(fā)酵罐中，如果有的話，從外面所加入的物質(zhì)(例如細(xì)菌的必需營養(yǎng)源、調(diào)節(jié)pH的試劑、氧)與有效生產(chǎn)所需培養(yǎng)基的均勻混合只有用大量技術(shù)花費(fèi)才可確保。
由于在動物組織中存在特異性結(jié)合乙酰透明質(zhì)酸的其它粘多糖和蛋白質(zhì)，因此從動物生物體中純化乙酰透明質(zhì)酸很復(fù)雜。在患者中，使用被動物蛋白質(zhì)污染的含乙酰透明質(zhì)酸的藥物制品可導(dǎo)致對機(jī)體有害的免疫反應(yīng)(US 4,141,973)，特別是如果患者對動物蛋白質(zhì)(例如雞卵清蛋白)過敏。此外，可從動物組織中獲得的滿意質(zhì)量和純度的乙酰透明質(zhì)酸的量(產(chǎn)率)低(公雞雞冠0.079％w/w，EP 0144019，US 4,782,046)，這必需加工大量動物組織。從動物組織中分離乙酰透明質(zhì)酸的另一個(gè)問題在于，由于動物組織也含有降解乙酰透明質(zhì)酸的酶(透明質(zhì)酸酶)，純化期間乙酰透明質(zhì)酸的分子量降低了。
除了所提到的透明質(zhì)酸酶和外毒素，鏈球菌菌株也產(chǎn)生內(nèi)毒素，當(dāng)存在于藥學(xué)產(chǎn)品中時(shí)，其危及患者的健康。在科學(xué)研究中，證明甚至市場上含乙酰透明質(zhì)酸的藥物產(chǎn)品含有可檢測量的細(xì)菌內(nèi)毒素(Dick等，2003，Eur J Opthalmol.13(2)，176-184)。借助于鏈球菌菌株所生產(chǎn)的乙酰透明質(zhì)酸的另一個(gè)缺點(diǎn)是，分離的乙酰透明質(zhì)酸具有比從公雞雞冠中分離的乙酰透明質(zhì)酸更低的分子量(Lapcik等1998，Chemical Reviews 98(8)，2663-2684)。US 20030134393描述了鏈球菌菌株用于生產(chǎn)乙酰透明質(zhì)酸的用途，其合成特大的乙酰透明質(zhì)酸囊(超囊化)。發(fā)酵后所分離的乙酰透明質(zhì)酸的分子量為9.1×106Da。然而，產(chǎn)率僅每升350mg。
通過細(xì)菌發(fā)酵或通過從動物組織分離生產(chǎn)乙酰透明質(zhì)酸的一些缺點(diǎn)可以通過用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)乙酰透明質(zhì)酸來避免；然而，目前達(dá)到的能用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)的乙酰透明質(zhì)酸的量需要相對很大的栽培面積以生產(chǎn)相對大量的乙酰透明質(zhì)酸。此外，從具有較低乙酰透明質(zhì)酸含量的植物中分離或純化乙酰透明質(zhì)酸被認(rèn)為比從具有較高乙酰透明質(zhì)酸含量的植物中分離或純化乙酰透明質(zhì)酸更復(fù)雜和更昂貴。
盡管乙酰透明質(zhì)酸具有不尋常的特性，但是由于其稀缺價(jià)高，即使可能的話，也是很少用于工業(yè)應(yīng)用。
因此，本發(fā)明的目的是提供允許供應(yīng)足夠量和質(zhì)量的乙酰透明質(zhì)酸并且可提供甚至用于工業(yè)應(yīng)用和在食物和飼料領(lǐng)域中應(yīng)用的乙酰透明質(zhì)酸的手段和方法。
該目的通過權(quán)利要求中所概述的實(shí)施方案實(shí)現(xiàn)。
因此，本發(fā)明涉及具有穩(wěn)定地整合到其基因組中的編碼乙酰透明質(zhì)酸合成酶核酸分子的經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞或經(jīng)遺傳修飾的植物；與相應(yīng)的沒有經(jīng)遺傳修飾的野生型植物細(xì)胞或沒有經(jīng)遺傳修飾的野生型植物相比較，其中所述的植物細(xì)胞或所述的植物額外地具有增加的具有谷氨酰胺果糖-6磷酸酰胺轉(zhuǎn)移酶(GFAT)(酶的)活性的蛋白的活性和增加的具有UDP-葡萄糖脫氫酶(UDP-Glc-DH)(酶的)活性的蛋白的活性。
在此，根據(jù)本發(fā)明的經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞或根據(jù)本發(fā)明的經(jīng)遺傳修飾的植物的遺傳修飾可以是任何遺傳修飾，其能導(dǎo)致編碼乙酰透明質(zhì)酸合成酶的核酸分子穩(wěn)定的整合進(jìn)植物細(xì)胞或植物，以及與相應(yīng)的沒有經(jīng)遺傳修飾的野生型植物細(xì)胞或沒有經(jīng)遺傳修飾的野生型植物相比較，其能增加在經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞或經(jīng)遺傳修飾的植物中具有GFAT(酶的)活性的蛋白的活性和具有UDP-Glc-DH(酶的)活性的蛋白的活性。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“野生型植物細(xì)胞”應(yīng)理解為用作根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞制備中的起始材料的植物細(xì)胞，即，除了引入并導(dǎo)致編碼乙酰透明質(zhì)酸合成酶的核酸分子的穩(wěn)定整合及增加具有GFAT活性的蛋白的活性和具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的活性的遺傳修飾外，它們的遺傳信息與根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞一致。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“野生型植物”應(yīng)理解為作為根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物制備中的起始材料的植物，即，除了引入并導(dǎo)致編碼乙酰透明質(zhì)酸合成酶核酸分子的穩(wěn)定整合及增加具有GFAT活性的蛋白的活性和具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的活性的遺傳修飾外，它們的遺傳信息與根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物一致。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“相應(yīng)的”意思是，當(dāng)比較多個(gè)對象時(shí)，相互比較的所討論對象處于相同條件下。在本發(fā)明的上下文中，在野生型植物細(xì)胞或野生型植物上下文中的術(shù)語“相應(yīng)的”是指相互比較的植物細(xì)胞或植物在相同的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)的以及它們具有相同的(栽培)年齡。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“乙酰透明質(zhì)酸合成酶”(EC 2.4.1.212)應(yīng)理解為是指由底物UDP-葡糖醛酸(UDP-GlcA)和N-乙酰-葡糖胺(UDP-GlcNAc)合成乙酰透明質(zhì)酸的蛋白質(zhì)。根據(jù)下列反應(yīng)式催化乙酰透明質(zhì)酸合成 nUDP-GlcA+nUDP-GlcNAc→β-1，4-[GlcA-β-1，3-GlcNAc]n+2nUDP 特別是對于下列生物體已經(jīng)描述了編碼乙酰透明質(zhì)酸合成酶的核酸分子和相應(yīng)的蛋白質(zhì)序列兔(家兔(Oryctolagus cuniculus))ocHas2(EMBLAB055978.1，US 20030235893)，ocHas3(EMBL AB055979.1，US20030235893)；狒狒(獵神狒狒(Papio anubis))paHas1(EMBLAY463695.1)；蛙(非洲爪蟾(Xenopus laevis))xlHas1(EMBL M22249.1，US20030235893)，xlHas2(DG42)(EMBL AF168465.1)，xlHas3(EMBLAY302252.1)；人(智人(Homo sapiens))hsHAS1(EMBL D84424.1，US20030235893)，hsHAS2(EMBL U54804.1，US 20030235893)，hsHAS3(EMBL AF232772.1，US 20030235893)；小鼠(小家鼠(Mus musculus))mmHas1(EMBL D82964.1，US 20030235893)，mmHAS2(EMBL U52524.2，US 20030235893)，mmHas3(EMBL U86408.2，US 20030235893)；牛(普通牛(Bos taurus))btHas2(EMBL AJ004951.1，US 20030235893)；雞(紅原雞(Gallυs gallus))ggHas2(EMBL AF106940.1，US 20030235893)；大鼠(褐家鼠(Rattus norvegicus))rnHas 1(rnHas 1(EMBL AB097568.1，Itano等，2004，J.Biol.Chem.279(18)18679-18678)，rnHas2(EMBL AF008201.1)；rnHas 3(NCBI NM_172319.1，Itano等，2004，J.Biol.Chem.279(18)18679-18678)、馬(家馬(Equυs caballus))ecHAS2(EMBL AY056582.1，Gl23428486)、豬(小型豬(Sus scrofa))sscHAS2(NCBI NM_214053.1，Gl47522921)，sscHas 3(EMBLAB159675)、斑馬魚(Danio rerio)brHas1(EMBL AY437407)，brHas2(EMBL AF190742.1)brHas3(EMBLAF190743.1)；多殺巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)pmHas(EMBLAF036004.2)；釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)spHas(EMBL，L20853.1，L21187.1，US 6,455,304，US 20030235893)；馬鏈球菌(Streptococcus equis)seHas(EMBL AF347022.1，AY173078.1)、乳鏈球菌(Streptococcus uberis)suHasA(EMBL AJ242946.2，US 20030235893)、類馬鏈球菌(Streptococcus equisimilis)seqHas(EMBL AF023876.1，US20030235893)；硫磺礦硫化葉菌假(Sulfolobus solfataricus)ssHAS(US20030235893)、Sulfolobus tokodaii stHas(AP000988.1)、綠草履蟲小球藻(Paramecium bursaria Chlorella)病毒1，cvHAS(EMBL U42580.3，PB42580，US 20030235893)。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“UDP-葡萄糖脫氫酶(UDP-Glc-DH)”(E.C.1.1.1.22)應(yīng)理解為由UDP-葡萄糖(UDP-Glc)和NAD+合成UDP-葡萄糖醛酸(UDP-GlcA)和NADH的蛋白。催化作用根據(jù)下列反應(yīng)式進(jìn)行 UDP-Glc+2NAD+-→UDP-GlcA+2NADH 在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“谷氨酰胺果糖6-磷酸酰胺轉(zhuǎn)移酶(GFAT)”(E.C.2.6.1.16)(在專門的文獻(xiàn)中也被稱為葡糖胺合成酶)應(yīng)該理解為由起始物谷氨酰胺和果糖6-磷酸(Fruc-6-P)合成葡糖胺6-磷酸(GlcN-6-P)的蛋白。催化作用根據(jù)下列反應(yīng)式進(jìn)行 谷氨酰胺+Fruc-6-P→GlcN-6-P+谷氨酸 特別在動物生物體中，能證明有兩種不同的具有GFAT(酶的)活性的蛋白的同工型(在文獻(xiàn)中分別稱為GFAT-1和GFAT-2)。Hu等(2004，J.Biol.Chem.279(29)，29988-29993)描述了來自小鼠的各個(gè)蛋白的區(qū)別除了所討論的具有谷氨酰胺果糖6-磷酸酰胺轉(zhuǎn)移酶1(GFAT-1)和谷氨酰胺果糖6-磷酸酰胺轉(zhuǎn)移酶2(GFAT-2)活性的蛋白在組織特異性表達(dá)上的區(qū)別外，還顯示兩種同工型都受到通過cAMP-依賴的蛋白激酶的磷酸化調(diào)節(jié)。具有GFAT-1(酶的)活性的蛋白的活性通過所討論的氨基酸序列中的保守絲氨酸殘基(小鼠GFAT-1絲氨酸205，GenBank登錄號AF334736.1)的磷酸化而被抑制；而具有GFAT-2(酶的)活性的蛋白的活性通過所討論的氨基酸序列中的保守絲氨酸殘基(小鼠GFAT-2絲氨酸202GenBank登錄號NM_013529)的磷酸化而增強(qiáng)。具有GFAT-1活性的蛋白和具有GFAT-2活性的蛋白兩者都受到UDP-N-乙酰葡糖胺濃度依賴方式的抑制；然而，與具有GFAT-1活性的蛋白(被UDP-N-乙酰葡糖胺最多降低活性約51％或80％)相比較，具有GFAT-2活性的蛋白被UDP-N-乙酰葡糖胺的抑制較低(被UDP-N-乙酰葡糖胺最大降低活性約15％)。有跡象表明，在動物機(jī)體中具有GFAT-1活性的蛋白的抑制是基于這樣的事實(shí)，即在升高的UDP-N-乙酰葡糖胺濃度下，會有所討論蛋白的O-葡萄糖-N-乙酰葡糖胺糖基化。目前還沒有完全弄清楚通過O-糖基化對蛋白質(zhì)活性調(diào)節(jié)是否也發(fā)生在植物細(xì)胞中(Huber和Hardin，2004，Current Opinion in Plant Biotechnology 7，318-322)。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“谷氨酰胺果糖6-磷酸酰胺轉(zhuǎn)移酶1(GFAT-1)”應(yīng)該理解為具有GFAT活性并且它的活性受到通過cAMP-依賴的蛋白激酶的磷酸化抑制的蛋白。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“谷氨酰胺果糖6-磷酸酰胺轉(zhuǎn)移酶2(GFAT-2)”應(yīng)該理解為具有GFAT活性并且受到通過cAMP-依賴的蛋白激酶的磷酸化激活的蛋白。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“谷氨酰胺果糖6-磷酸酰胺轉(zhuǎn)移酶(GFAT)”被用作廣泛的術(shù)語，包括所有具有GFAT活性的蛋白。因此，它也包括在文獻(xiàn)中稱為“谷氨酰胺果糖6-磷酸酰胺轉(zhuǎn)移酶1(GFAT-1)”或“谷氨酰胺果糖6-磷酸酰胺轉(zhuǎn)移酶2(GFAT-2)”的蛋白，但不限于此。
在本發(fā)明上下文中，術(shù)語“具有GFAT(酶的)活性的蛋白增加的活性”意思是編碼具有GFAT活性的蛋白的內(nèi)源基因增加的表達(dá)和/或編碼具有GFAT活性的蛋白的轉(zhuǎn)錄本增加的量和/或在細(xì)胞中具有GFAT活性的蛋白增加的量和/或在細(xì)胞中具有GFAT活性的蛋白增加的酶活性。
在本發(fā)明上下文中，術(shù)語“具有UDP-Glc-DH(酶的)活性的蛋白增加的活性”意思是編碼具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的內(nèi)源基因增加的表達(dá)和/或編碼具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的轉(zhuǎn)錄本增加的量和/或在細(xì)胞中具有UDP-Glc-DH活性的蛋白增加的量和/或在細(xì)胞中具有UDP-Glc-DH活性的蛋白增加的酶活性。
在每種情況下遇到的根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞或根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物，至少在上面所提到的一種情況下意思是增加了具有GFAT(酶的)活性的蛋白和具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的酶活性。
例如可以通過測定編碼具有GFAT活性的蛋白或編碼具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的轉(zhuǎn)錄本的量，例如通過Northern印跡分析或RT-PCR，來檢測增加的表達(dá)。這里，增加優(yōu)選的意思是，與相應(yīng)的沒有經(jīng)遺傳修飾的野生型植物細(xì)胞或沒有經(jīng)遺傳修飾的野生型植物相比較，轉(zhuǎn)錄本量增加至少50％，特別地至少70％，優(yōu)選地至少85％以及特別優(yōu)選地至少100％。編碼具有GFAT活性的蛋白或編碼具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的轉(zhuǎn)錄本量的增加的也指，沒有能檢測得到的編碼具有GFAT活性的蛋白或編碼具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的轉(zhuǎn)錄本的量的植物或植物細(xì)胞在根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行遺傳修飾后，具有可以檢測得到的編碼具有GFAT活性的蛋白和/或編碼具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的轉(zhuǎn)錄本的量。
例如可以通過免疫學(xué)方法，諸如Western印跡分析、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附分析)或RIA(放射免疫分析)，來檢測具有GFAT活性的蛋白或具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的量的增加，這些量的增加能導(dǎo)致在所討論的植物中的這些蛋白活性的增加。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員已知制備特異性的與特定蛋白反應(yīng)(即特異的結(jié)合到所述蛋白)的抗體的方法(見，例如，Lottspeich和Zorbas(編輯)，1998，Bioanalytik[Bioanalysis]，Spektrumakad.Verlag，Heidelberg，Berlin，ISBN 3-8274-0041-4)。一些公司(如Eurogentec，Belgium)以定購的方式提供制備這類抗體的服務(wù)。這里，蛋白的量增加優(yōu)選的意思是，與相應(yīng)的沒有經(jīng)遺傳修飾的野生型植物細(xì)胞或沒有經(jīng)遺傳修飾的野生型植物相比較，具有GFAT活性的蛋白和/或具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的量的增加至少50％，特別地至少70％，優(yōu)選地至少85％以及特別優(yōu)選地至少100％。具有GFAT活性的蛋白和/或具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的量的增加也意思是指，沒有能檢測得到的具有GFAT活性的蛋白的量和/或沒有能檢測得到的具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的量的植物或植物細(xì)胞在根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行遺傳修飾后，具有可以檢測得到具有GFAT活性的蛋白的量和/或可檢測得到具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的量。
在植物提取物中具有GFAT活性的蛋白增加的活性可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的方法來測定，如，Samac等(2004，Applied Biochemistry andBiotechnology 113-116，Humana Press，Ashok Mulehandani編輯，1167-1182，ISSN 0273-2289)的方法。一般方法第6項(xiàng)中給出了測定具有GFAT活性的蛋白的活性量的優(yōu)選方法。
在植物提取物中具有UDP-Glc-DH活性的蛋白增加的活性可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的方法來測定，例如在WO 00 11192中描述的方法。一般方法第7項(xiàng)中給出了測定具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的活性量的優(yōu)選方法。
具有GFAT活性的蛋白或具有UDP-Glc-DH活性的蛋白(酶的)活性的增加量的優(yōu)選意思是，與相應(yīng)的沒有經(jīng)遺傳修飾的野生型植物細(xì)胞或沒有經(jīng)遺傳修飾的野生型植物相比較，此類蛋白活性的增加至少為50％，優(yōu)選地至少70％，特別優(yōu)選地至少85％以及尤其優(yōu)選地至少100％。具有GFAT活性的蛋白和/或具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的(酶的)活性量的增加也意思是指，沒有能檢測得到的具有GFAT活性的蛋白的量和/或沒有能檢測得到具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的活性的植物或植物細(xì)胞在根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行遺傳修飾后，具有可以檢測得到的具有GFAT活性的蛋白的量和/或可以檢測得到的具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的量。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“基因組”應(yīng)理解為指植物細(xì)胞中存在的全部遺傳物質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，除了細(xì)胞核之外，其它區(qū)室(例如，質(zhì)體、線粒體)也含有遺傳物質(zhì)。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“穩(wěn)定整合的核酸分子”應(yīng)理解為指核酸分子整合到植物的基因組內(nèi)。穩(wěn)定整合的核酸分子的特征是，在相應(yīng)整合位點(diǎn)的復(fù)制期間，其連同與整合位點(diǎn)相連的宿主的核酸序列一起增殖，結(jié)果被復(fù)制的DNA鏈上的整合位點(diǎn)被與作為復(fù)制模板的鏈上的序列相同的核酸序列環(huán)繞。
可利用大量技術(shù)將核酸分子穩(wěn)定地整合到宿主植物細(xì)胞中。這些技術(shù)包括使用根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)或發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenes)作為轉(zhuǎn)化工具以T-DNA轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，原生質(zhì)體融合，DNA注射、電穿孔，使用生物射彈法引入DNA以及其他選擇(綜述見″Transgenic Plants″，Leandro編輯，Humana Press 2004，ISBN1-59259-827-7)。
已經(jīng)深入地研究了使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化并且充分描述于EP 120516；Hoekema，The Binary Plant Vector System OffsetdrukkerijKanters B.V.Alblasserdam(1985)，V章；Fraley等，Crit.Rev.Plant Sci.4，1-46和An等EMBO J.4，(1985)，277-287。用于轉(zhuǎn)化馬鈴薯的方法，參見例如Rocha-Sosa等，EMBO J.8，(1989)，29-33；用于轉(zhuǎn)化番茄植物的方法，參見例如US 5,565,347。
也描述了單子葉植物的轉(zhuǎn)化，使用基于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的載體(Chan等，Plant MoI.Biol.22，(1993)，491-506；Hiei等，Plant J.6，(1994)271-282；Deng等，中國科學(xué)(Science in China)33，(1990)，28-34；Wilmink等，PlantCell Reports 11，(1992)，76-80；May等，Bio/Technology 13，(1995)，486-492；Conner and Domisse，Int.J.Plant Sci.153(1992)，550-555；Ritchie等，Transgenic Res.2，(1993)，252-265)。轉(zhuǎn)化單子葉植物的可選系統(tǒng)是使用生物射彈法的轉(zhuǎn)化(Wan和Lemaux，Plant Physiol.104，(1994)，37-48；Vasil等，Bio/Technology 11(1993)，1553-1558；Ritala等，Plant MoI.Biol.24，(1994)，317-325；Spencer等，Theor.Appl.Genet.79，(1990)，625-631)，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，部分滲透化處理過的細(xì)胞的電穿孔，用玻璃纖維導(dǎo)入DNA。特別是在文獻(xiàn)中多次描述了玉米的轉(zhuǎn)化(參見例如，WO95/06128，EP0513849，EP0465875，EP0292435；Fromm等，Biotechnology 8，(1990)，833-844；Gordon-Kamm等，Plant Cell 2，(1990)，603-618；Koziel等，Biotechnology11(1993)，194-200；Moroc等，Theor.Appl.Genet.80，(1990)，721-726)。也描述了其它禾本科植物，例如，諸如，柳枝稷(Panicum virgatum)的轉(zhuǎn)化(Richards等，2001，Plant Cell Reporters 20，48-54)。
也描述了其它谷類植物種的成功轉(zhuǎn)化，例如，大麥(Wan和Lemaux，見上；Ritala等，見上；Krens等，Nature 296，(1982)，72-74)和小麥(Nehra等，Plant J.5，(1994)，285-297；Becker等，1994，Plant Journal 5，299-307)。所有上述的方法都適合于本發(fā)明的上下文。
與現(xiàn)有技術(shù)相比較，根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞或根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物的優(yōu)點(diǎn)是比只具有乙酰透明質(zhì)酸合成酶活性的植物產(chǎn)生更高的乙酰透明質(zhì)酸的量。由于從具有更高乙酰透明質(zhì)酸含量的植物中分離乙酰透明質(zhì)酸較不復(fù)雜和有較高的成本效率，這允許以低成本生產(chǎn)乙酰透明質(zhì)酸。此外，與現(xiàn)有技術(shù)中描述的植物相比較，使用根本發(fā)明的經(jīng)遺傳修飾的植物需要更小的栽培面積以生產(chǎn)乙酰透明質(zhì)酸。這使得可能提供甚至工業(yè)應(yīng)用的足夠量的乙酰透明質(zhì)酸，而目前由于它的缺乏和高價(jià)格沒有用于工業(yè)。病毒感染的小球藻(Chlorella)屬植物生物體不適合生產(chǎn)相對大量的乙酰透明質(zhì)酸。在乙酰透明質(zhì)酸的生產(chǎn)中，病毒感染的藻類具有的缺陷在于合成乙酰透明質(zhì)酸所需的基因沒有穩(wěn)定整合到它們的基因組中(Van Etten和Meints，1999，Annu.Rev.Microbiol.53，447-494)，所以，為生產(chǎn)乙酰透明質(zhì)酸，需要重復(fù)地進(jìn)行病毒感染。因此，也不可能分離持續(xù)合成所需質(zhì)量和數(shù)量的乙酰透明質(zhì)酸的單個(gè)小球藻細(xì)胞。此外，在病毒感染的小球藻藻類中，只在有限的時(shí)間段內(nèi)合成乙酰透明質(zhì)酸，以及由于病毒引起的裂解，僅僅在感染約8小時(shí)后，藻類就會被殺死(Van Etten等，2002，Arch Virol 147，1479-1516)。相反地，本發(fā)明提供的優(yōu)點(diǎn)是，根據(jù)本發(fā)明的經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞或根據(jù)本發(fā)明的經(jīng)遺傳修飾的植物可以通過非限制的無性繁殖或有性繁殖進(jìn)行繁殖，以及它們持續(xù)的生產(chǎn)乙酰透明質(zhì)酸。
WO 05 012529描述的具有編碼乙酰透明質(zhì)酸合成酶的核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物合成相對小量的乙酰透明質(zhì)酸。相反地，本發(fā)明提供的優(yōu)點(diǎn)是，根據(jù)本發(fā)明的經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞或根據(jù)本發(fā)明的經(jīng)遺傳修飾的植物合成相當(dāng)更高量的乙酰透明質(zhì)酸。
因此，本發(fā)明也提供了合成乙酰透明質(zhì)酸的根據(jù)本發(fā)明的經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞或根據(jù)本發(fā)明的經(jīng)遺傳修飾的植物。根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞或根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物每克植物材料鮮重(FW)優(yōu)選地合成至少100，優(yōu)選地至少600，特別優(yōu)選地至少1000和尤其優(yōu)選地至少1500μg乙酰透明質(zhì)酸。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞或根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物每克鮮重合成最多25000μg乙酰透明質(zhì)酸，優(yōu)選的每克鮮重最多20000μg乙酰透明質(zhì)酸，特別優(yōu)選的每克鮮重最多15000μg乙酰透明質(zhì)酸，尤其優(yōu)選的最多每克鮮重10000μg乙酰透明質(zhì)酸以及最優(yōu)選的每克鮮重最多6500μg乙酰透明質(zhì)酸。
為測定根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞或根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物關(guān)于鮮重的乙酰透明質(zhì)酸含量，優(yōu)選使用一般方法第2項(xiàng)描述的植物材料加工的方法和一般方法第4項(xiàng)描述的測定乙酰透明質(zhì)酸量的方法。
本發(fā)明也提供根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞或根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物，其每克植物材料干重(DW)合成至少1000，優(yōu)選的至少2000，特別優(yōu)選的至少4000，尤其優(yōu)選的至少5000μg乙酰透明質(zhì)酸。為測定根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞或根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物關(guān)于干重的乙酰透明質(zhì)酸含量，優(yōu)選使用實(shí)施例13k)描述的植物材料的加工方法和一般方法第4項(xiàng)描述的測定乙酰透明質(zhì)酸量的方法。
已觀察到，在發(fā)育期間，乙酰透明質(zhì)酸聚集在植物組織中；所以，根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞或根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物關(guān)于鮮重或關(guān)于干重的乙酰透明質(zhì)酸的量特別優(yōu)選的在所討論的植物細(xì)胞或所討論的植物收獲期間或收獲前數(shù)天(一或兩天)測定。在此，對于乙酰透明質(zhì)酸的量，特別利用了植物材料(例如塊莖、種子、葉子)，其用于進(jìn)一步加工。
合成乙酰透明質(zhì)酸的根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞或根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物可以通過分離它們合成的乙酰透明質(zhì)酸并驗(yàn)證其結(jié)構(gòu)以鑒定。
由于植物組織具有不含有透明質(zhì)酸酶的優(yōu)點(diǎn)，可以使用簡單和快速的分離方法來確定根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞或根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物中乙酰透明質(zhì)酸的存在。為此，向?qū)⒁獧z查的植物組織中添加水，然后將植物組織用機(jī)器粉碎(例如借助于，珠磨機(jī)、Warring攪拌機(jī)、榨汁機(jī)等)。如果需要的話，然后可向懸浮液中添加更多的水，接著通過離心或過濾除去細(xì)胞碎片和不溶于水的成分。然后可使用例如特異性結(jié)合乙酰透明質(zhì)酸的蛋白質(zhì)，證明離心后所獲得的上清液中是否存在乙酰透明質(zhì)酸。例如，在US 5,019,498中描述了借助于特異性結(jié)合乙酰透明質(zhì)酸的蛋白質(zhì)檢測乙酰透明質(zhì)酸的方法?？赏ㄟ^商業(yè)途徑獲得實(shí)施US 5,019,498中所述方法的檢驗(yàn)試劑盒(例如，Corgenix，Inc.，Colorado，USA的透明質(zhì)酸(HA)檢驗(yàn)試劑盒，Prod.No.029-001)；也見一般方法第4項(xiàng))。平行地，也可最初用透明質(zhì)酸酶消化所獲得的離心上清液的等分試樣，然后如上所述，借助于特異性結(jié)合乙酰透明質(zhì)酸的蛋白質(zhì)確定是否存在乙酰透明質(zhì)酸。通過平行批次中透明質(zhì)酸酶的作用，降解其中存在的乙酰透明質(zhì)酸，所以完全降解后，不再可能檢測到顯著量的乙酰透明質(zhì)酸。
此外，也可使用其它分析方法進(jìn)一步證實(shí)離心上清液中是否存在乙酰透明質(zhì)酸，例如，諸如IR、NMR或質(zhì)譜分析法。
如上面已討論的那樣，目前還不清楚在植物中用于合成UDP-葡萄糖醛酸采用哪條代謝途徑(己糖磷酸或氧化肌醇代謝途徑)，也不清楚兩種代謝途徑是否依賴植物的組織和/或發(fā)育階段對UDP-葡萄糖醛酸的合成做了不同量的貢獻(xiàn)。此外，在轉(zhuǎn)基因植物中過量表達(dá)UDP-Glc-DH沒有導(dǎo)致一致的結(jié)果，而且采用這種方法也不可能達(dá)到增加細(xì)胞壁中果膠含量的目的。此外，具有UDP-Glc-DH活性的蛋白活性的調(diào)節(jié)受到UDP-木糖的抑制。源自原核生物(Campbell等，1997，J.Biol.Chem.272(6)，3416-3422；Schiller等，1973，Biochim.Biophys Acta 293(1)，1-10)、動物生物體(Balduini等，1970，Biochem.J.120(4)，719-724)和植物(Hinterberg，2002，Plant Physiol.Biochem.40，1011-1017)的相關(guān)蛋白都證實(shí)了這一點(diǎn)。并且，來自具有UDP-Glc-DH活性的蛋白催化的反應(yīng)的產(chǎn)物葡萄糖醛酸和NADH是調(diào)節(jié)具有GFAT活性的蛋白活性的抑制劑(Campbell等，1997，J.Biol.Chem.272(6)，3416-3422，Ordman和Kirkwood，1977，Biochim BiophysActa 482(1)25-32；Turner和Botha，2002，Archives of Biochem.Biophys.407，209-216)。
在谷物中過量表達(dá)與質(zhì)體信號肽翻譯地融合的具有GFAT(酶的)活性的蛋白導(dǎo)致了UDP-葡糖胺含量的增加，以及在谷物中具有GFAT(酶的)活性的蛋白的胞質(zhì)過量表達(dá)導(dǎo)致了地面上胚乳組織中葡糖胺1-磷酸含量的增加。然而，UDP-葡糖胺和葡糖胺1-磷酸不是通過乙酰透明質(zhì)酸合成酶合成乙酰透明質(zhì)酸的起始材料。此外，已知葡糖胺對植物細(xì)胞有細(xì)胞毒性作用(Roberts等，1971，Plant Physiol.48，36-42)，以及如果在植物細(xì)胞中存在相對高的濃度，它會被轉(zhuǎn)化為葡糖胺6-磷酸。葡糖胺6-磷酸同樣對植物細(xì)胞有毒(WO 98 35047，US 6,444,878)。此外，已知具有GFAT活性的蛋白受到合成UDP-N-乙酰-葡糖胺另外的代謝途徑形成的代謝物以抑制方式的調(diào)節(jié)。從真核生物中(動物和植物生物體)分離的具有GFAT活性的蛋白受到例如UDP-N-乙酰-葡糖胺的抑制，其中所述UDP-N-乙酰-葡糖胺是乙酰透明質(zhì)酸合成酶的兩個(gè)底物之一(Kornfeld，1967，J.Biol.Chem.242(13)，3135-3141；Graack等，2001，Biochem.J.360，401-412；Mayer等，1968，Plant Physiol.43，1097-1107)。具有GFAT活性的細(xì)菌蛋白受到GFAT催化的反應(yīng)的直接反應(yīng)產(chǎn)物葡糖胺-6-磷酸的抑制(Deng等，2005，Metabolic Engineering 7，201-214)。
文獻(xiàn)沒有顯示有什么能限制在植物細(xì)胞中合成乙酰透明質(zhì)酸的量。
因此，驚奇的發(fā)現(xiàn)，與(只)具有乙酰透明質(zhì)酸合成酶活性的經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞或經(jīng)遺傳修飾的植物相比較，具有編碼乙酰透明質(zhì)酸合成酶的核酸分子和具有額外增加的GFAT活性和增加的UDP-Glc-DH活性的經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞或經(jīng)遺傳修飾的植物生產(chǎn)顯著更高量的乙酰透明質(zhì)酸。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞和經(jīng)遺傳修飾的植物，其中，與(只)具有乙酰透明質(zhì)酸合成酶活性的經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞或經(jīng)遺傳修飾的植物相比較，或與具有乙酰透明質(zhì)酸合成酶活性但具有GFAT活性的蛋白沒有增加的活性以及具有UDP-Glc-DH活性的蛋白沒有增加的活性的經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞或經(jīng)遺傳修飾的植物相比較，能產(chǎn)生增加的乙酰透明質(zhì)酸的量。優(yōu)選地，與相應(yīng)地(只)具有乙酰透明質(zhì)酸合成酶活性的經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞或經(jīng)遺傳修飾的植物相比較，根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞或根據(jù)本發(fā)明的經(jīng)遺傳修飾的植物的關(guān)于植物材料鮮重的乙酰透明質(zhì)酸產(chǎn)量高至少1.5倍，優(yōu)選的至少5倍，特別優(yōu)選的至少7.5倍以及尤其優(yōu)選的至少10倍。為檢測在根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞或根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物中關(guān)于植物材料鮮重的乙酰透明質(zhì)酸含量的增加，優(yōu)選的將根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞或根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物與相應(yīng)的(只)具有活性乙酰透明質(zhì)酸合成酶的植物細(xì)胞或植物比較，其中應(yīng)該比較植物細(xì)胞或植物相同的材料(例如葉子，塊莖)，取得這些材料的植物細(xì)胞或植物應(yīng)該在相同的條件下培養(yǎng)，以及應(yīng)該比較具有可比較的年齡(發(fā)育階段)的植物材料的乙酰透明質(zhì)酸含量。例如，不能將植物的幼葉和其它植物的老葉相比較。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“(只)具有乙酰透明質(zhì)酸合成酶活性的植物細(xì)胞或植物”應(yīng)該理解為經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞或經(jīng)遺傳修飾的植物，其中遺傳修飾在于與相應(yīng)的沒有經(jīng)遺傳修飾的野生型植物細(xì)胞或沒有經(jīng)遺傳修飾的野生型植物相比較，其包含編碼乙酰透明質(zhì)酸合成酶的核酸分子。
特別地，“(只)具有乙酰透明質(zhì)酸合成酶活性的植物細(xì)胞或植物”的特征在于它們合成乙酰透明質(zhì)酸以及除了將編碼乙酰透明質(zhì)酸合成酶的核酸分子導(dǎo)入到?jīng)]有經(jīng)遺傳修飾的野生型植物細(xì)胞或沒有經(jīng)遺傳修飾的野生型植物之外，沒有其它額外的遺傳修飾。優(yōu)選地，這類植物具有GFAT活性的蛋白沒有增加的活性，具有UDP-Glc-DH活性的蛋白也沒有增加的活性。
可以借助于上面已描述過的方法測定植物細(xì)胞或植物生產(chǎn)的乙酰透明質(zhì)酸的量，例如使用商業(yè)化測試試劑盒(例如Corgenix，Inc.，Colorado，USA的透明質(zhì)酸(HA)檢測試劑盒，Prod.No.029-001)。在本發(fā)明上下文中測定植物細(xì)胞或植物中乙酰透明質(zhì)酸含量的優(yōu)選的方法描述于一般方法第4項(xiàng)。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞或根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物分別是合成乙酰透明質(zhì)酸的綠色陸生植物的細(xì)胞或綠色陸生植物。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“綠色陸生植物(胚生植物)”應(yīng)理解為如在Strasburger，“Lehrbuch der Botanik”植物學(xué)的教科書，34版，Spektrum Akad.Verl.，1999，(ISBN 3-8274-0779-6)中所定義的那樣。
本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案涉及根據(jù)本發(fā)明遺傳修飾的多細(xì)胞植物的植物細(xì)胞或者根據(jù)本發(fā)明遺傳修飾多細(xì)胞生物體的植物。因此，該實(shí)施方案涉及不是源自單細(xì)胞植物(原生生物)或者不是原生生物的植物細(xì)胞或植物。
根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞或根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物原則上可以分別是任何植物種類(即，單子葉植物和雙子葉植物)的植物細(xì)胞和植物。優(yōu)選的是作物植物，即人們?yōu)槲桂B(yǎng)人類和動物或生產(chǎn)生物量和/或?yàn)榧夹g(shù)或工業(yè)目的制備底物而栽培的植物(例如谷物、稻、小麥、紫花苜蓿、黑麥、燕麥、大麥、木薯、馬鈴薯、番茄、柳枝稷(Panicum virgatum)、西米、綠豆、豆類、高粱、胡蘿卜、茄子、蘿卜、含油種子油菜、大豆、花生、黃瓜、南瓜、甜瓜、韭、大蒜、卷心菜、菠菜、白薯、蘆筍、夏南瓜、萵苣、朝鮮薊、甜玉米、歐洲防風(fēng)草、鴉蔥、菊芋、香蕉、甜菜、甘蔗、甜菜根、莖椰菜、卷心菜、洋蔥、黃色甜菜、蒲公英、草莓、蘋果、杏、李子、桃、葡萄藤、花椰菜、芹菜、甜柿子椒類、瑞典蕪菁、大黃)。特別優(yōu)選的是番茄或馬鈴薯植物。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明遺傳修飾的植物細(xì)胞或根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物，其中編碼乙酰透明質(zhì)酸合成酶的核酸分子的特征在于其編碼病毒乙酰透明質(zhì)酸合成酶。編碼乙酰透明質(zhì)酸合成酶的核酸分子優(yōu)選地編碼感染藻類的病毒的乙酰透明質(zhì)酸合成酶。
至于感染藻類的病毒，編碼乙酰透明質(zhì)酸合成酶的核酸分子優(yōu)選地編碼感染小球藻的病毒的乙酰透明質(zhì)酸合成酶，特別優(yōu)選的是綠草履蟲小球藻病毒1的乙酰透明質(zhì)酸合成酶以及尤其優(yōu)選地綠草履蟲小球藻病毒株H1的乙酰透明質(zhì)酸合成酶。
在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明遺傳修飾的植物細(xì)胞或根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物，其中編碼乙酰透明質(zhì)酸的核酸分子的特征在于，與編碼乙酰透明質(zhì)酸合成酶的來源生物體的乙酰透明質(zhì)酸合成酶的核酸分子的密碼子相比較，編碼乙酰透明質(zhì)酸合成酶的核酸分子的密碼子被修飾。特別優(yōu)選地，如此修飾乙酰透明質(zhì)酸合成酶的密碼子，從而它們適應(yīng)將它們整合到的基因組中的植物細(xì)胞或植物的密碼子的使用頻率。
由于遺傳密碼的簡并性，氨基酸可由一個(gè)或多個(gè)密碼子編碼。在不同的生物體中，以不同頻率使用編碼氨基酸的密碼子。使編碼核酸序列的密碼子適于它們在植物細(xì)胞或在植物中(其中將要表達(dá)的序列被整合到其基因組中)使用的頻率，可有助于在特定的植物細(xì)胞或植物中增加所翻譯蛋白質(zhì)的量和/或有助于所討論mRNA的穩(wěn)定。對于所討論植物細(xì)胞或植物中密碼子使用的頻率，可由本領(lǐng)域技術(shù)人員在所討論生物體盡可能多的編碼核酸序列中檢查用于編碼某個(gè)氨基酸的某些密碼子的頻率來確定。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知某些生物體的密碼子的使用頻率，并且能使用計(jì)算機(jī)程序以簡單和快速的方式確定。合適的計(jì)算機(jī)程序是公眾可獲得的并且特別在因特網(wǎng)上免費(fèi)提供(例如http://gcua.schoedl.de/；http://www.kazusa.or.jp/codon/；http://www.entelechon.com/eng/cutanalysis.html)。
可通過體外誘變或者優(yōu)選地通過基因序列的從頭合成，使編碼核酸序列的密碼子適于它們在植物細(xì)胞或在植物中(其中將要表達(dá)的序列被整合到其基因組中)使用的頻率。核酸序列從頭合成的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。例如，可通過最初合成單個(gè)核酸寡核苷酸，將這些與其互補(bǔ)的寡核苷酸雜交，使得它們形成DNA雙鏈，然后連接分別的雙鏈寡核苷酸，獲得期望的核酸序列，從而完成從頭合成。也可將核酸序列(包括密碼子使用頻率針對某個(gè)靶生物體的調(diào)適)的從頭合成交給提供該服務(wù)的公司(Entelechon GmbH，Regensburg，德國)。
編碼乙酰透明質(zhì)酸合成酶的核酸分子優(yōu)選的特征是其編碼的乙酰透明質(zhì)酸合成酶的氨基酸序列至少70％，優(yōu)選的至少80％，優(yōu)選的至少90％，尤其優(yōu)選的至少95％以及最優(yōu)選的至少98％與SEQ ID NO 2所示氨基酸序列同一。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼乙酰透明質(zhì)酸合成酶的核酸分子的特征是它編碼具有SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的乙酰透明質(zhì)酸合成酶。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，編碼乙酰透明質(zhì)酸合成酶的核酸分子至少70％，優(yōu)選的至少80％，優(yōu)選的至少90％，尤其優(yōu)選的至少95％以及最優(yōu)選的至少98％與SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 3所示核酸序列同一。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼乙酰透明質(zhì)酸合成酶的核酸分子的特征是它具有SEQ ID NO 3所示核酸序列。
根據(jù)布達(dá)佩斯條約，含有編碼綠草履蟲小球藻病毒乙酰透明質(zhì)酸合成酶的合成核酸分子的質(zhì)粒IC 341-222于2004年8月25日保藏在位于德國，馬斯切爾奧德爾韋格1b，38124布勞恩斯魏格的德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Mascheroder Weg 1b，38124Brunswick，Germany)，保藏號為DSM16664。SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列可從整合到質(zhì)粒IC 341-222中的核酸序列的編碼區(qū)衍生，并且編碼綠草履蟲小球藻病毒的乙酰透明質(zhì)酸合成酶。
因此，本發(fā)明也涉及根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞或者根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物，其中編碼乙酰透明質(zhì)酸合成酶的核酸分子的特征是，其編碼氨基酸序列可從插入到質(zhì)粒DSM16664中的核酸序列的編碼區(qū)中衍生的蛋白質(zhì)，或者它編碼的蛋白至少70％，優(yōu)選的至少80％，優(yōu)選的至少90％，尤其優(yōu)選的至少95％以及最優(yōu)選的至少98％的氨基酸序列與可從插入到質(zhì)粒DSM16664中的核酸序列的編碼區(qū)中衍生的氨基酸序列同一。
本發(fā)明也涉及根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞或者根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物，其中編碼乙酰透明質(zhì)酸合成酶的核酸分子的特征是，它是整合到質(zhì)粒DSM16664中的編碼乙酰透明質(zhì)酸合成酶的核酸序列，或至少70％，優(yōu)選的至少80％，優(yōu)選的至少90％，尤其優(yōu)選的至少95％以及最優(yōu)選的至少98％與整合到質(zhì)粒DSM16664中的核酸序列同一。
本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞或者根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物，特征是它們具有穩(wěn)定整合到它們基因組的一個(gè)外源核酸分子或者穩(wěn)定整合到它們基因組的多個(gè)外源核酸分子，與相應(yīng)的沒有經(jīng)遺傳修飾的野生型植物細(xì)胞或相應(yīng)的沒有經(jīng)遺傳修飾的野生型植物相比較，所述的一個(gè)外源核酸分子或所述的多個(gè)外源核酸分子增加具有GFAT活性的蛋白的活性以及增加具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的活性。
它可以是單個(gè)的外源核酸分子，通過整合到根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞或者根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物中，與相應(yīng)的野生型植物細(xì)胞或野生型植物相比較，增加具有GFAT活性的蛋白的活性，并同時(shí)增加具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的活性。然而，也可是是多個(gè)外源核酸分子，與相應(yīng)的野生型植物細(xì)胞或野生型植物相比較，一個(gè)外源核酸分子增加具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的活性并且另一個(gè)外源核酸分子增加具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的活性。如果多個(gè)外源核酸分子整合到根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞或者根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物，兩個(gè)外源核酸分子可以一起在植物細(xì)胞或植物的基因組的同一位置，或者它們也可以位于植物細(xì)胞或植物的基因組的不同的位置(例如在不同的染色體上或不同的染色體區(qū))。因此，外源核酸分子可以是根據(jù)孟德爾定律以聯(lián)合基因座或以偶聯(lián)的基因座遺傳，或者它們也可以根據(jù)孟德爾定律以彼此獨(dú)立的分別的基因座遺傳。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“外源核酸分子”應(yīng)該理解為這樣的分子，它不在相應(yīng)的野生型植物細(xì)胞中天然存在；或者它也不會在野生型植物細(xì)胞中在具體空間重排中天然存在；或者它存在于野生型植物細(xì)胞的基因組的位置中，但它不天然存在于這里。優(yōu)選的，外源核酸分子是包含多個(gè)元件的重組分子，這些元件的結(jié)合或特定的空間重排不會在植物細(xì)胞中自然發(fā)生。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“重組的核酸分子”因該理解為指含有多個(gè)核酸分子的核酸分子，這些核酸分子不會如同在重組的核酸分子中存在的那樣以聯(lián)合方式天然存在。因此，重組的核酸分子可以是，除編碼乙酰透明質(zhì)酸合成酶和/或具有GFAT活性的蛋白和/或具有UDP-Glc-DH活性的蛋白質(zhì)的核酸分子之外，還含有不與所提到的核酸分子天然聯(lián)合存在的核酸序列。所提到的與編碼乙酰透明質(zhì)酸合成酶或具有GFAT活性的蛋白和/或具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的核酸分子聯(lián)合存在于重組的核酸分子上的其它核酸序列可以是任何序列。例如，它們可以是植物基因組的核酸序列。所提到的其它核酸序列優(yōu)選是調(diào)控序列(啟動子，終止信號，增強(qiáng)子)，特別優(yōu)選在植物組織中有活性的調(diào)控序列，尤其優(yōu)選組織特異的在植物組織中有活性的調(diào)控序列。產(chǎn)生重組核酸分子的方法為所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員所知，包含遺傳工程方法，例如，諸如，通過連接反應(yīng)使核酸分子連接，遺傳重組或核酸分子的從頭合成。(見，例如，Sambrok等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第3版(2001)Cold SpringHarbour Laboratory Press，Cold Spring Harbour，NY.ISBN0879695773，Ausubel等，Short Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons；第5版(2002)，ISBN0471250929). 具有穩(wěn)定地整合入其基因組的一個(gè)外源核酸分子或穩(wěn)定地整合入其基因組的多個(gè)外源核酸分子(外源核酸分子編碼乙酰透明質(zhì)酸合成酶，以及與相應(yīng)的沒有經(jīng)遺傳修飾的野生型植物細(xì)胞或沒有經(jīng)遺傳修飾的野生型植物相比較，它們增加具有GFAT活性的蛋白的活性和增加具有UDP-Glc-DH的活性蛋白的活性)的經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞或經(jīng)遺傳修飾的植物可以分別與所述的野生型植物細(xì)胞或野生型植物相區(qū)分，尤其是通過這樣一個(gè)事實(shí)，即它們分別含有不天然存在于野生型植物細(xì)胞和野生型植物的外源核酸分子，或者該分子整合到根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物或根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞的基因組的位置中，它們分別不會在野生型植物細(xì)胞和野生型植物中存在在該位置，即在不同的基因組環(huán)境中。此外，這樣的根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞和根據(jù)本發(fā)明遺傳修飾植物可以分別與沒有經(jīng)遺傳修飾的野生型植物細(xì)胞和沒有經(jīng)遺傳修飾的野生型植物相區(qū)分，因?yàn)楦鶕?jù)需要，它們除了包含天然存在于野生型植物細(xì)胞或野生型植物的分子的拷貝外，還包含至少一個(gè)拷貝穩(wěn)定地整合入其基因組的外源核酸分子。如果引入根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞或根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物的外源核酸分子是已經(jīng)天然存在于野生型植物細(xì)胞或野生型植物的分子的附加拷貝，根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞和根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物可以分別與野生型植物細(xì)胞和野生型植物相區(qū)別，特別通過這樣一個(gè)事實(shí)，即該附加拷貝/這些附加拷貝位于基因組的某一位置，而在野生型植物細(xì)胞和野生型植物中它/它們分別不會定位于此。
可以通過遺傳學(xué)方法和/或分子生物學(xué)方法證明核酸分子穩(wěn)定整合到植物細(xì)胞或植物的基因組中。核酸分子穩(wěn)定整合到植物細(xì)胞基因組或植物基因組的特征是，在遺傳了所述核酸分子的后代中，穩(wěn)定整合的核酸分子存在于與親代相同的基因組環(huán)境中?？墒褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法證明植物細(xì)胞的基因組內(nèi)或植物的基因組內(nèi)存在核酸序列的穩(wěn)定整合，特別是借助于RFLP分析(限制性片段長度多態(tài)性)的Southern印跡分析(Nam等.，1989，The Plant Cell 1，699-705；Leister和Dean，1993，The PlantJournal 4(4)，745-750)，用基于PCR的方法，例如，諸如擴(kuò)增片段長度差異的分析(擴(kuò)增片段長度多態(tài)性，AFLP)(Castiglioni等，1998，Genetics 149，2039-2056；Meksem等，2001，Molecular Genetics and Genomics 265，207-214；Meyer等，1998，Molecular and General Genetics 259，150-160)或者使用借助于限制性核酸內(nèi)切酶切割的擴(kuò)增片段(切割擴(kuò)增的多態(tài)序列，CAPS)(Konieczny和Ausubel，1993，The Plant Journal 4，403-410；Jarvis等.，1994，Plant Molecular Biology 24，685-687；Bachem等，1996，The PlantJournal 9(5)，745-753)。
原則上，外源核酸分子可以是任何在植物細(xì)胞或植物中增加具有GFAT活性的蛋白的活性和/或具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的活性的核酸分子。
在本發(fā)明的上下文中，也可以通過插入誘變(綜述Thorneycroft等，2001，Journal of experimental Botany 52(361)，1593-1601)制備根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞或根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物。在本發(fā)明的上下文中，插入誘變應(yīng)理解為特別是指將轉(zhuǎn)座子或轉(zhuǎn)移DNA(T-DNA)插入到基因或基因附近區(qū)域，所述基因編碼具有GFAT活性的蛋白和/或編碼具有UDP-Glc-DH活性的蛋白，由此在所討論的細(xì)胞中增加具有GFAT活性的蛋白的活性和/或具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的活性。
轉(zhuǎn)座子可以是在細(xì)胞中天然存在的轉(zhuǎn)座子(內(nèi)源轉(zhuǎn)座子)或不在所述細(xì)胞中天然存在但通過遺傳工程(例如，諸如，細(xì)胞轉(zhuǎn)化)引入到細(xì)胞中的轉(zhuǎn)座子(異源轉(zhuǎn)座子)。通過轉(zhuǎn)座子修飾基因表達(dá)已為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。Ramachandran和Sundaresan(2001，Plant Physiology andBiochemistry 39，234-252)給出了在植物生物技術(shù)中利用內(nèi)源或異源轉(zhuǎn)座子作為工具的綜述。
T-DNA插入誘變基于這樣一個(gè)事實(shí)，即農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的某些部分(T-DNA)可以整合到植物細(xì)胞基因組中。整合到植物基因組的位置是不固定的，可以整合到任何位置。如果T-DNA整合到表現(xiàn)出基因功能的染色體區(qū)段或其附近，就可能導(dǎo)致基因表達(dá)的增加，由此也可以改變所討論的基因編碼的蛋白的活性。
插入到基因組的序列(特別是轉(zhuǎn)座子或T-DNA)的特征是，它們包含導(dǎo)致激活編碼具有GFAT活性的蛋白和/或編碼具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的基因的調(diào)控序列的序列(“激活標(biāo)簽”)。優(yōu)選的，插入到基因組的序列(特別是轉(zhuǎn)座子或T-DNA)的特征是，它們整合到植物細(xì)胞或植物基因組中編碼具有GFAT活性的蛋白和/或編碼具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的內(nèi)源核酸分子附近。
例如可以利用激活標(biāo)簽方法(見，例如，Walden等，Plant J.(1991)，281-288；Walden等，Plant MoI.Biol.26(1994)，1521-1528)產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞或根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物。這一方法基于通過增強(qiáng)子序列對內(nèi)源啟動子的激活，例如，諸如，花椰菜花葉病毒(cauliflower mosaic virus)35S RNA啟動子的增強(qiáng)子或章魚堿合成酶增強(qiáng)子。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“T-DNA激活標(biāo)簽”因該理解為含有增強(qiáng)子序列的T-DNA片段，并且通過將其整合到植物細(xì)胞基因組中，增加具有GFAT活性的蛋白和/或具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的活性。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“轉(zhuǎn)座子激活標(biāo)簽”因該理解為指含有增強(qiáng)子序列的轉(zhuǎn)座子，并且通過將其整合到植物細(xì)胞基因組中，增加具有GFAT活性的蛋白和/或具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的活性。
本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案涉及到根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞或根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物，其特征在于至少一個(gè)外源核酸分子編碼具有GFAT(酶的)活性的蛋白或至少一個(gè)外源核酸分子編碼具有UDP-Glc-DH(酶的)活性的蛋白。
本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案涉及到根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞或根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物，其特征在于，第一外源核酸分子編碼具有GFAT(酶的)活性的蛋白，第二外源核酸分子編碼具有UDP-Glc-DH(酶的)活性的蛋白。
根據(jù)本發(fā)明，編碼具有GFAT(酶的)活性的蛋白的外源核酸分子可以來源于任何生物體；優(yōu)選地，所述核酸分子來源于細(xì)菌、真菌、動物、植物或病毒，特別優(yōu)選的來源于哺乳動物或細(xì)菌，以及尤其優(yōu)選的來源于小鼠或大腸桿菌(Escherichia coli)。
對于來源于動物生物體的編碼具有GFAT(酶的)活性的蛋白的外源核酸分子，優(yōu)選利用編碼具有GFAT-2(酶的)活性的蛋白的外源核酸分子；特別優(yōu)選的具有GFAT-2(酶的)活性的蛋白來源于小鼠。
對于病毒，編碼具有GFAT(酶的)活性的蛋白的外源核酸分子優(yōu)選來源于感染藻類的病毒，優(yōu)選來源于感染小球藻屬藻類的病毒，特別優(yōu)選的來源于綠草履蟲小球藻病毒，以及尤其優(yōu)選的來源于綠草履蟲小球藻病毒H1病毒株。
代替天然存在的編碼具有GFAT(酶的)活性的蛋白的核酸分子，還可以將通過誘變產(chǎn)生的核酸分子整合到根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞或根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物，其中所述的誘變的外源核酸分子的特征在于它編碼具有GFAT(酶的)活性的蛋白，該蛋白具有降低的被代謝物(例如葡糖胺代謝)的抑制。Deng等在制備具有大腸桿菌的GFAT(酶的)活性的蛋白的示范方法中描述了這類誘變的核酸分子的制備(2005，Metabolic Engineering 7，201-214；WO 04 003175)。例如，Hu等描述了具有小鼠的GFAT活性的蛋白的突變體(2004，J.Biol.Chem.279(29)，29988-29993)。
根據(jù)本發(fā)明，編碼具有UDP-Glc-DH(酶的)活性的蛋白的外源核酸分子可以來源于任何生物體；優(yōu)選地，所述核酸分子來源于細(xì)菌、真菌、動物、植物或病毒，特別優(yōu)選的來源于細(xì)菌、植物或病毒，尤其優(yōu)選的來源于病毒。
對于病毒，編碼具有UDP-Glc-DH(酶的)活性的蛋白的外源核酸分子優(yōu)選來源于感染藻類的病毒，優(yōu)選來源于感染小球藻屬藻類的病毒，特別優(yōu)選的來源于綠草履蟲小球藻病毒，以及尤其優(yōu)選的來源于綠草履蟲小球藻病毒H1病毒株。
代替天然存在的編碼具有UDP-Glc-DH(酶的)活性的蛋白的核酸分子，還可以將通過誘變產(chǎn)生的核酸分子整合到根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞或根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物，其中所述的誘變的外源核酸分子的特征在于它編碼具有UDP-Glc-DH(酶的)活性的蛋白，該蛋白具有降低的被代謝物(例如葡糖醛酸代謝)的抑制。
編碼具有GFAT活性的蛋白的核酸分子已為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知并在文獻(xiàn)中得以描述。因此，已描述的編碼具有GFAT活性的蛋白的核酸分子來自于病毒，例如小球藻病毒k2(EMBL登錄號AB107976.l)；來自于細(xì)菌，例如大腸桿菌(Dutka-Malen，1988，Biochemie 70(2)，287-290；EMBL登錄號L1o328.1)；來自于真菌，例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(EMBL登錄號AF334737.1，watzele等，1989，J.Biol.Chem.264，8753-8758)、黑曲霉(Aspergillus niger)(EMBL登錄號AY594332.1)、白色念珠菌(candida albicans)(EMBL登錄號X94753.1)；來自于昆蟲，例如埃及伊蚊(Aedes aegyti)(Kato等，2002，Insect.Biol.11(3)，207，216；EMBL登錄號AF399922.1)、果蠅(Drosophila melangaster)(GFAT-1:EMBL登錄號Y18627.1，GFAT-2:NCBI登錄號NM_143360.2)；來自于草菇(Volvariella volvacea)藻類(EMBL登錄號AY661466.1)；來自于脊椎動物，例如智人(Homo sapiens)(GFAT-1:EMBL登錄號AF334737.1；GFAT-2:NCBI登錄號BC0000l2.2，Oki等，1999，Genomics 57(2)，227-34)；小家鼠(Mus mvsculus)(GFAT-1:EMBL登錄號AF334736.1；GFAT-2:EMBL登錄號AB016780.1)；或來自于植物，例如擬南芥(Arabidopsis thaliana)(EMBL登錄號AP001297.1；cds NCBI登錄號BAB03027.1)。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞或根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物，其中編碼具有GFAT活性的蛋白的外源核酸分子選自 a)編碼具有SEQ ID NO 8所示氨基酸序列的蛋白或具有SEQ ID NO10所示氨基酸序列的蛋白或具有SEQ ID NO 12所示氨基酸序列的蛋白的核酸分子； b)編碼蛋白的核酸分子，所述蛋白的序列至少60％，優(yōu)選的至少80％，優(yōu)選的至少90％，尤其優(yōu)選的至少95％以及最優(yōu)選的至少98％與SEQID NO 8、SEQ ID NO 10或SEQ ID NO 12所示氨基酸序列同一； c)包含SEQ ID NO 7所示核苷酸序列或與其互補(bǔ)的序列、SEQ ID NO9所示核苷酸序列或與其互補(bǔ)的序列、SEQ ID NO 11所示核苷酸序列或與其互補(bǔ)的序列或SEQ ID NO 13所示核苷酸序列或與其互補(bǔ)的序列的核酸分子； d)至少70％，優(yōu)選的至少80％，優(yōu)選的至少90％，尤其優(yōu)選的至少95％以及最優(yōu)選的至少98％與a)或c)中所述核酸序列同一的核酸分子； e)在嚴(yán)格條件下與a)或c)所述核酸序列的至少一條鏈雜交的核酸分子； f)由于遺傳密碼子的簡并性，其核苷酸序列與a)或c)所提到的核酸分子序列不同的核酸分子；以及 g)核酸分子，其是a)，b)，c)，d)，e)或f)中所提到的核酸分子的片段、等位基因變體和/或衍生物。
編碼具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的核酸分子在文獻(xiàn)中得以描述并已為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。因此，已描述的編碼具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的核酸分子來自于病毒，例如小球藻病毒1(NCBI登錄號NC_000852.3)；來自于細(xì)菌，例如大腸桿菌(EMBL登錄號AF176356.1)；來自于真菌，例如黑曲霉(EMBL登錄號AY594332.1)、新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)(EMBL ace AF405548.1)；來自于昆蟲，例如果蠅(EMBL登錄號AF001310.1)；來自于脊椎動物，例如智人(EMBL登錄號AF061016.1)、小家鼠(EMBL登錄號AF061017.1)、普通牛(Bostaurus)(EMBL登錄號AF095792.1)、非洲爪蟾(Xenopυs laevis)(EMBL登錄號AY762616.1)或來自于植物，例如白楊(EMBL登錄號AF053973.1)、芋頭(Colocasia esculenta)(EMBL登錄號AY222335.1)、杜氏藻(Dunaliella salina)(EMBL登錄號AY795899.1)、大豆(Glycinemax)(EMBL登錄號U53418.1)。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞或根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物，其中編碼具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的外源核酸分子選自 a)編碼具有SEQ ID NO 5所示氨基酸序列的蛋白的核酸分子； b)編碼蛋白的核酸分子，所述該蛋白的序列至少60％，優(yōu)選的至少80％，優(yōu)選的至少90％，尤其優(yōu)選的至少95％以及最優(yōu)選的至少98％與SEQ ID NO 5所示氨基酸序列同一； c)包含SEQ ID NO 4所示核苷酸序列或與其互補(bǔ)的序列或SEQ IDNO 6所示核苷酸序列或與其互補(bǔ)的序列的核酸分子； d)至少70％，優(yōu)選的至少80％，優(yōu)選的至少90％，尤其優(yōu)選的至少95％以及最優(yōu)選的至少98％與a)或c)中所述核酸序列同一的核酸分子； e)在嚴(yán)格條件下與a)或c)所述核酸序列的至少一條鏈雜交的核酸分子； f)由于遺傳密碼子的簡并性，其核苷酸序列與a)或c)所提到的核酸分子序列不同的核酸分子；以及 g)核酸分子，其是a)，b)，c)，d)，e)或f)中所提到的核酸分子的片段、等位基因變體和/或衍生物。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“雜交”意思是在常規(guī)雜交條件下的雜交，優(yōu)選的在嚴(yán)格條件下，例如Sambrook等(Molecular Cloning，ALaboratory Manual，第二版.(1989)Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，NY)描述的那樣。特別優(yōu)選地，“雜交”意思是在以下條件下的雜交 雜交緩沖液 2×SSC；10×登哈特溶液(Denhardt solution)(Fikoll400+PEG+BSA；比例1∶1∶1)；0.1％SDS；5mM EDTA；50mMNa2HPO4；250μg/ml鯡魚(herring)精子DNA；50μg/ml tRNA；或25M磷酸鈉緩沖液pH 7.2；1mM EDTA；7％SDS 雜交溫度T＝65至68℃ 洗滌緩沖液0.1×SSC；0.1％SDS 洗滌溫度T＝65至68℃ 與編碼具有UDP-Glc-DH活性或具有GFAT活性的蛋白的核酸分子雜交的核酸分子可以源自任何生物體；因此，它們可以來源于細(xì)菌、真菌、動物、植物或病毒。
與編碼具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的核酸分子雜交的核酸分子優(yōu)選的來源于感染藻類的病毒，優(yōu)選的感染小球藻屬藻類的病毒，特別優(yōu)選的綠草履蟲小球藻病毒以及尤其優(yōu)選的綠草履蟲小球藻病毒H1病毒株。
與編碼具有GFAT活性的蛋白的核酸分子雜交的核酸分子優(yōu)選的來源于哺乳動物、植物或細(xì)菌，并且尤其優(yōu)選的來自小鼠或大腸桿菌。
與編碼具有GFAT-1或GFAT-2活性的蛋白的核酸分子雜交的核酸分子優(yōu)選的來源于真核生物，特別優(yōu)選的它們來源于動物生物體，尤其優(yōu)選的來源于小鼠。
與所提到的分子雜交的核酸分子可以分離自例如基因組文庫或cDNA文庫。這些核酸分子可以用所提到的核酸分子或這些分子的一部分或這些分子的反向互補(bǔ)序列來鑒定和分離，例如通過根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法的雜交(見，例如，Sambrook等，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)或用PCR擴(kuò)增。
可以利用例如具有正好的或基本上的SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 6所示核苷酸序列或這些序列的一部分的核酸分子作為用于分離編碼具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的核酸序列的雜交樣本。
可以利用例如具有正好的或基本上的SEQ ID NO 7或SEQ ID NO 9或SEQ ID NO 11或SEQ ID NO 13所示核苷酸序列或這些序列的一部分的核酸分子作為用于分離編碼具有GFAT活性的蛋白的核酸序列的雜交樣本。
用作雜交樣本的片段也可以是用通常的合成技術(shù)制備的合成片段或寡核苷酸，其序列與本發(fā)明上下文描述的核酸分子基本上同一。一旦鑒定和分離了與本發(fā)明上下文所述核酸序列雜交的基因，就應(yīng)該確定其序列并應(yīng)該分析這一序列編碼的蛋白質(zhì)是否是具有GFAT、GFAT-1或GFAT-2活性或UDP-Glc-DH活性的蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，并且尤其在文獻(xiàn)中描述了怎樣確定蛋白是否具有GFAT的活性的方法(例如Mayer等，1968，Plant Physiol.43，1097-1107；Deng等，2005，Metabolic Engineering7，201-214)、GFAT-1或GFAT-2的活性的方法(例如Hu等，2004，J.Biol.Chem.279(29)，29988-29993)或UDP-Glc-DH的活性的方法(例如De Luca等，1976，Connective Tissue Research 4，247-254；Bar-Peled等，2004，Biochem.J.381，131-136；Turner和Botha，2002，Archives Biochem.Biophys.407，209-216)。
與本發(fā)明上下文描述的核酸分子雜交的分子特別包含所提到的核酸分子的片段、衍生物和等位基因變體。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“衍生物”的意思是這些分子的序列在一個(gè)或多個(gè)位置上與上面描述的核酸分子序列有區(qū)別并與這些序列高度同一。與上面所述的核酸分子的區(qū)別可以是，例如，因?yàn)閯h除、增加、替換、插入或重組。
與本發(fā)明上下文中，術(shù)語“同一性”的意思是與核酸分子的編碼區(qū)全長或編碼蛋白的氨基酸序列全長具有至少60％，特別的至少70％同一性，優(yōu)選的至少80％，特別優(yōu)選的至少90％以及尤其優(yōu)選的至少95％的序列同一性。與本發(fā)明上下文中，術(shù)語“同一性”應(yīng)理解為與其它蛋白/核酸相同的氨基酸/核苷酸數(shù)目，用百分?jǐn)?shù)表示。優(yōu)選的，借助于計(jì)算機(jī)程序，將另外的蛋白質(zhì)/核酸，通過與SEQ ID NO 5所示氨基酸序列相比較確定與具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的同一性；通過與SEQ ID NO 4或SEQ IDNO 6所示核酸序列相比較確定與編碼具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的核酸分子的同一性；通過與SEQ ID NO 8或SEQ ID NO 10或SEQ ID NO12所示氨基酸序列相比較確定與具有GFAT活性的蛋白的同一性以及通過與SEQ ID NO 7或SEQ ID NO 9或SEQ ID NO 11或SEQ ID NO 13所示核酸序列相比較確定與編碼具有GFAT活性的蛋白的核酸分子的同一性。如果相互比較的序列長度不同，通過確定較短序列與較長序列共有的氨基酸數(shù)目的百分比來確定同一性。優(yōu)選的，使用已知并公眾可獲得的計(jì)算機(jī)程序ClustalW(Thompson等，Nucleic Acids Research 22(1994)，4673-4680)來確定同一性。ClustalW是由European Molecular BiologyLaboratory，Meyerhofstrasse 1，D 69117 Heidelberg，Germany的JulieThompson(Thompson@EMBL-Heidelberg.DE)和Toby Gibson(Gibson@EMBL-Heidelberg.DE)而讓公眾可獲得的。ClustalW可以在不同的互聯(lián)網(wǎng)頁面上下載，尤其是從IGBMC(Institut de Génétique et deBiologie Moléculaire et Cellulaire，B.P.163，67404 Illkirch Cedex，F(xiàn)rance；ftp://ftp-igbmc.u-strasbg.fr/pub/)和從EBI(ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/software/)和EBI的所有鏡像互聯(lián)網(wǎng)頁面(EuropeanBioinformatics Institute，Wellcome Trust Genome Campus，Hinxton，Cambridge CB101SD，UK)。
優(yōu)選的，應(yīng)用1.8版本的ClustalW計(jì)算機(jī)程序來確定本發(fā)明上下文描述的蛋白和其它蛋白之間的同一性。在此，按以下設(shè)置參數(shù)KTUPLE＝1，TOPDIAG＝5，窗口＝5，PAIRGAP＝3，GAPOPEN＝10，GAPEXTEND＝0.05，GAPDIST＝8，MAXDIV＝40，矩陣＝GONNET，ENDGAPS(OFF)，NOPGAP，NOHGAP。
優(yōu)選的，應(yīng)用1.8版本的ClustalW計(jì)算機(jī)程序來確定例如本發(fā)明上下文描述的核酸分子的核苷酸序列和其它核酸分子的核苷酸序列之間的同一性。在此，按以下設(shè)置參數(shù) KTUPLE＝2，TOPDIAGS＝4，PAIRGAP＝5，DNA矩陣IUB，GAPOPEN＝10，GAPEXT＝5，MAXDIV＝40，TRANSITIONS未權(quán)重的。
同一性還指所討論的核酸分子或它們編碼的蛋白之間存在功能和/或結(jié)構(gòu)的等同。與上面描述的分子同源并代表這些分子的衍生物的核酸分子一般是是表現(xiàn)出具有相同生物學(xué)功能修飾的這些分子的變化。它們可以是天然存在的變化，例如來自于其它物種的序列，或者是突變，其中這些突變可以是以自然方式或通過靶向誘變引入而發(fā)生的。此外，變化還可以是合成產(chǎn)生的序列。等位基因變體可以是天然存在的變體或合成產(chǎn)生的變體或通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的變體。衍生物的特殊形式是，例如，由于遺傳密碼的簡并性而與本發(fā)明上下文中描述的核酸分子不同的核酸分子。
編碼具有GFAT或UDP-Glc-DH活性的蛋白的核酸分子的不同衍生物具有某些共同的特征。它們可以是，例如，生物學(xué)活性或酶的活性、底物特異性、分子量、免疫反應(yīng)性、構(gòu)象等，也可以是物理性質(zhì)，例如，諸如，在凝膠電泳中的運(yùn)動性質(zhì)、色譜行為、沉淀系數(shù)、溶解度、分光性質(zhì)、穩(wěn)定性、最佳pH、最佳溫度等。具有GFAT或UDP-Glc-DH活性的蛋白的優(yōu)選性質(zhì)已為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，已經(jīng)在上面提到并在此以類似的方式應(yīng)用。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞或根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物，其中編碼具有GFAT(酶的)活性的蛋白或編碼具有UDP-Glc-DH(酶的)活性的蛋白的核酸分子的特征是，所述的核酸分子的密碼子不同于編碼親代生物體的所述具有GFAT(酶的)活性的蛋白或編碼親代生物體的所述具有UDP-Glc-DH(酶的)活性的蛋白的核酸分子的密碼子。特別優(yōu)選的，編碼具有GFAT(酶的)活性的蛋白或編碼具有UDP-Glc-DH(酶的)活性的蛋白的核酸分子的密碼子被改變以適應(yīng)植物細(xì)胞或植物(它們整合或?qū)⒁系皆撝参锏幕蚪M中)的密碼子使用頻率。
此外，本發(fā)明還提供根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞或根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物，其中將穩(wěn)定整合到植物細(xì)胞或植物基因組的編碼乙酰透明質(zhì)酸合成酶和/或編碼具有GFAT(酶的)活性的蛋白和/或編碼具有UDP-Glc-DH(酶的)活性的蛋白的外源核酸分子與在植物細(xì)胞中起始轉(zhuǎn)錄的調(diào)控元件(啟動子)連接。它們可以是同源或異源啟動子。啟動子可以是組成型的、組織特異性的、發(fā)育特異性的或由外界因素調(diào)控的(例如使用化學(xué)物質(zhì)后，通過非生物因素作用，諸如熱和/或冷、干旱、疾病等)。這里，整合到根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞或根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物的基因組且編碼乙酰透明質(zhì)酸合成酶或具有GFAT(酶的)活性的蛋白或具有UDP-Glc-DH(酶的)活性的蛋白的核酸分子可以在每種情況下都與相同的啟動子連接，或者分別的序列可以與不同的啟動子連接。這里，以任何組合的二或三種不同的啟動子可以在每種情況下與相關(guān)的在根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞或根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物中編碼乙酰透明質(zhì)酸合成酶或具有GFAT(酶的)活性的蛋白或具有UDP-Glc-DH(酶的)活性的蛋白的外源核酸分子連接。
本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案涉及根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞或根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物，其中選自編碼乙酰透明質(zhì)酸合成酶或具有GFAT(酶的)活性的蛋白或具有UDP-Glc-DH(酶的)活性的蛋白的核酸分子的至少一個(gè)外源核酸分子，特別優(yōu)選的至少兩個(gè)外源核酸分子，尤其優(yōu)選的至少三個(gè)外源核酸分子，與組織特異性啟動子連接。優(yōu)選的組織特異性啟動子是在植物的塊莖、果實(shí)或種子細(xì)胞或葉子中特異性起始轉(zhuǎn)錄的啟動子。
為表達(dá)編碼乙酰透明質(zhì)酸合成酶或具有GFAT(酶的)活性的蛋白或具有UDP-Glc-DH(酶的)活性的蛋白的核酸分子，優(yōu)選地將這些與確保在植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的調(diào)控DNA序列連接。這些特別地包括啟動子。通常，在植物細(xì)胞中有活性的任一啟動子都適合于表達(dá)。
這里，可以選擇啟動子使得表達(dá)組成型地進(jìn)行，或僅在某種組織中、在植物發(fā)育的某個(gè)時(shí)間點(diǎn)或者在由外界因素所決定的時(shí)間點(diǎn)發(fā)生。對于植物和對于核酸分子這兩者而言，啟動子可以是同源的或異源的。
合適的啟動子有，例如，用于組成型表達(dá)的花椰菜花葉病毒的35S RNA的啟動子或谷物或洋丁香屬(Cestrum)YLCV(黃葉卷曲病毒)的遍在蛋白啟動子(WO 01 73087；Stavolone等，2003，Plant MoI.Biol.53，703-713)、用于在馬鈴薯中塊莖特異性表達(dá)的patatin基因啟動子B33(Rocha-Sosa等，EMBO J.8(1989)，23-29)或者番茄的果實(shí)特異性啟動子，例如，諸如番茄多聚半乳糖醛酸酶啟動子(Montgomery等，1993，Plant Cell 5，1049-1062)或番茄E8啟動子(Metha等，2002，Nature Biotechnol.20(6)，613-618)或桃子ACC氧化酶啟動子(Moon和Callahan，2004，J．Experimental Botany 55(402)，1519-1528)，或者確保僅在有光合活性的組織中表達(dá)的啟動子，例如ST-LS1啟動予(stockhaus等，Proc.Natl.Acad．Sci.USA 84(1987)，7943-7947；Stockhaus等，EMBO J.8(1989)，2445-2451)，或者用于胚乳特異性表達(dá)的小麥HMWG啟動子、USP啟動子、菜豆球蛋白啟動子、谷物的玉米醇溶蛋白基因啟動子(Pedersen等，Cell 29(1982)，1015-1026；Quatroccio等，Plant MoI.Biol.15(1990)，81-93)、谷蛋白啟動子(Leisy等，Plant MoI.Biol.14(1990)，41-50；Zheng等，Plant J.4(1993)，357-366；Yoshihara等，F(xiàn)EBS Lett．383(1996)，213-218)，或者shrunken-1啟動子(Werr等，EMBO J.4(1985)，1373-1380)、球蛋白啟動子(Nakase等，1996，Gene 170(2)，223-226)或醇溶蛋白啟動子(Qu und Takaiwa，2004，Plant Biotechnology Journal 2(2)，113-125)。然而，也可能使用僅在由外界因素所決定的時(shí)間點(diǎn)被活化的啟動子(見例如，WO9307279)。這里，對允許簡單誘導(dǎo)的熱休克蛋白的啟動子可能具有特別的興趣。此外，還可能使用種子特異性啟動子，例如，諸如蠶豆(Vicia faba)的USP啟動子，其確保在蠶豆和其它植物中的種子特異性表達(dá)(Fiedler等，Plant Mol.Biol.22(1993)，669-679；

等，Mol.Gen.Genet.225(1991)，459-467)。
也可以使用在感染藻類的病毒的基因組中存在的啟動子用于在植物中表達(dá)核酸序列(Mitra等，1994，Biochem．Biophys Res Commun 204(1)，187-194；Mitra和Higgins，1994，Plant Mol Biol 26(1)，85-93，Van Etten等，2002，Arch Virol 147，1479-1516)。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“組織特異性”應(yīng)理解為指表現(xiàn)(例如，轉(zhuǎn)錄的起始)基本局限于某種組織。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“塊莖、果實(shí)或種子細(xì)胞”應(yīng)理解為指分別在塊莖、果實(shí)和種子中存在的所有細(xì)胞。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“同源啟動子”應(yīng)理解為天然存在于用于制備根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞或根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物的植物細(xì)胞或植物中的啟動子(對于植物細(xì)胞或植物而言是同源的)或理解為調(diào)節(jié)在生物體中(從其中分離出該基因序列)基因表達(dá)的調(diào)控的啟動子(對于要表達(dá)的核酸分子而言是同源的)。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“異源啟動子”應(yīng)理解為不是天然存在于用于制備根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞或根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物的植物細(xì)胞或植物中的啟動子(對于植物細(xì)胞或植物而言是異源的)或理解為在生物體中(從其中分離要表達(dá)的基因)不天然存在以調(diào)控所述基因序列表達(dá)的啟動子(對于要表達(dá)的核酸分子而言是異源的)。
此外，可存在終止序列(多腺苷酸化信號)，其用于將聚腺苷酸尾添加到轉(zhuǎn)錄物上。聚腺苷酸尾被認(rèn)為具有穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄物的功能。這類元件描述于文獻(xiàn)中(參考Gielen等，EMBO J.8(1989)，23-29)并且可按需求互換。
在啟動子和編碼區(qū)之間也可存在內(nèi)含子序列。這些內(nèi)含子序列可導(dǎo)致植物中表達(dá)的穩(wěn)定和提高的表達(dá)(Callis等，1987，Genes Devel.1，1183-1200；Luehrsen和Walbot，1991，Mol.Gen.Genet.225，81-93；Rethmeier等，1997；Plant Journal 12(4)，895-899；Rose和Beliakoff，2000，Plant Physiol.122(2)，535-542；Vasil等，1989，Plant Physiol.91，1575-1579；XU等，2003，Science in China Series C Vol.46No.6，561-569)。合適的內(nèi)含子序列是，例如，玉米sh1基因的第一內(nèi)含子、玉米多聚遍在蛋白基因1的第一內(nèi)含子、稻EPSPS基因的第一內(nèi)含子或者擬南芥(Arabidopsis)PAT1基因的前兩個(gè)內(nèi)含子之一。
本發(fā)明還涉及包含根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞的植物?？赏ㄟ^從根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞的再生生產(chǎn)這樣的植物。
本發(fā)明也涉及本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物的可加工的或可消費(fèi)的部分，其中所述本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物包含根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“可加工的部分”應(yīng)理解為指用于制備食物或飼料的植物部分，其用作工業(yè)加工的原料來源，作為制備藥物產(chǎn)品的原料來源或者作為制備美容產(chǎn)品的原料來源。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“可消費(fèi)的部分”應(yīng)理解為指用作人的食物或者用作動物飼料的植物部分。
本發(fā)明也涉及本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物的繁殖材料，其中所述本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物包含根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞。
這里，術(shù)語“繁殖材料”包括適于以無性或有性方式產(chǎn)生后代的植物的那些成分。適于無性繁殖的是，例如，插枝、愈傷組織培養(yǎng)物、根莖或塊莖。其它繁殖材料包括，例如，果實(shí)、種子、秧苗、原生質(zhì)體、細(xì)胞培養(yǎng)物，等等。優(yōu)選的繁殖材料是塊莖、果實(shí)或種子。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物的可收獲的植物部分，諸如果實(shí)、貯藏根或其它根、花、芽、苗、葉或莖，優(yōu)選種子、果實(shí)或塊莖，這些可收獲的部分包含根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞。
優(yōu)選地，本發(fā)明涉及包含乙酰透明質(zhì)酸的根據(jù)本發(fā)明的繁殖材料或根據(jù)本發(fā)明的植物可收獲部分。特別優(yōu)選地是合成乙酰透明質(zhì)酸的根據(jù)本發(fā)明的繁殖材料或根據(jù)本發(fā)明的植物可收獲部分。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“馬鈴薯植物”或“馬鈴薯”應(yīng)理解為指茄(Solanum)屬的植物種，特別是產(chǎn)生塊莖的茄屬物種以及特別是馬鈴薯(Solanum tuberosum)。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“番茄植物”或“番茄”應(yīng)理解為指番茄屬(Lycopersicon)屬的植物種，特別是番茄(Lycopersicon esculentum)。
本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于，與文獻(xiàn)中描述的合成乙酰透明質(zhì)酸的轉(zhuǎn)基因植物相比較，根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物的可收獲的部分、繁殖材料、可加工的部分或可消費(fèi)的部分包括更多的乙酰透明質(zhì)酸。因此，根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物不僅特別適于作為可分離乙酰透明質(zhì)酸的原料，而且它們也可直接用作食物/飼料或用于制備具有預(yù)防或治療特性(例如，用于骨關(guān)節(jié)炎的預(yù)防，US 6,607,745)的食物/飼料。由于根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物比文獻(xiàn)中描述的植物的乙酰透明質(zhì)酸含量更高，制備這些食物/飼料時(shí)需要較少根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物的可收獲的部分、繁殖材料、可加工的部分或可消費(fèi)的部分的量。如果根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物的可消費(fèi)部分被消費(fèi)，例如直接用作“營養(yǎng)品”，可能甚至通過攝取相對小量的物質(zhì)即能達(dá)到陽性效果。這尤其在制備動物飼料時(shí)特別顯著，因?yàn)楹刑吆恐参锍煞值膭游镲暳喜贿m合于作為多種動物的飼料。
由于乙酰透明質(zhì)酸的高水結(jié)合能力，根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物的可收獲部分、繁殖材料、可加工部分或可消費(fèi)部分還具有當(dāng)制備固化食物/飼料時(shí)需更少增稠劑的優(yōu)點(diǎn)。因此，例如，制備果凍時(shí)需要較少的糖，其對健康有額外的積極影響。需要從粗植物材料中脫水的食物/伺料制備中，使用根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物的可收獲部分、繁殖材料、可加工部分或可消費(fèi)的部分的優(yōu)點(diǎn)在于只需從所討論植物材料中除去較少的水的事實(shí)，導(dǎo)致更低的生產(chǎn)成本，以及由于更溫和的制備方法(例如，更低的和/或更短的供熱)，提高了所討論食物/飼料的營養(yǎng)價(jià)值。因此，例如，當(dāng)制備番茄醬時(shí)，不必引入很多的能量便可獲得期望的稠度。
本發(fā)明還提供了一種制備合成乙酰透明質(zhì)酸的植物的方法，其包括 a)遺傳修飾植物細(xì)胞，其中遺傳修飾包括如下步驟i至iii i)將編碼乙酰透明質(zhì)酸合成酶的外源核酸分子引入植物細(xì)胞 ii)將這樣的遺傳修飾引入植物細(xì)胞，該遺傳修飾導(dǎo)致了與相應(yīng)的沒有經(jīng)遺傳修飾的野生型植物細(xì)胞相比較，具有GFAT(酶的)活性的蛋白的活性增加 iii)將這樣的遺傳修飾引入植物細(xì)胞，該遺傳修飾導(dǎo)致與相應(yīng)的沒有經(jīng)遺傳修飾的野生型植物細(xì)胞相比較，具有UDP-Glc-DH(酶的)活性的蛋白的活性增加 其中步驟i至iii可以以任何順序各自實(shí)施，或同時(shí)實(shí)施步驟i至iii的任何組合。
b)從步驟a)的植物細(xì)胞再生植物；和 c)根據(jù)需要，用步驟b)的植物產(chǎn)生進(jìn)一步的植物， 其中，根據(jù)需要，從步驟b)或c)的植物分離植物細(xì)胞并重復(fù)步驟a)至c)的方法直到產(chǎn)生這樣的植物，其具有編碼乙酰透明質(zhì)酸合成酶的外源核酸分子，并且與相應(yīng)的沒有經(jīng)遺傳修飾的野生型植物細(xì)胞相比較，具有GFAT(酶的)活性的蛋白具有增加的活性，以及與相應(yīng)的沒有經(jīng)遺傳修飾的野生型植物細(xì)胞相比較，具有UDP-Glc-DH(酶的)活性的蛋白具有增加的活性。
本發(fā)明優(yōu)選地涉及制備合成乙酰透明質(zhì)酸的植物的方法，其包括 a)遺傳修飾植物細(xì)胞，其中遺傳修飾包括如下以任何順序的步驟i至iii，或可以個(gè)別地或同時(shí)地進(jìn)行步驟i至iii的任何組合 i)將編碼乙酰透明質(zhì)酸合成酶的外源核酸分子引入植物細(xì)胞 ii)將遺傳修飾引入植物細(xì)胞，該遺傳修飾導(dǎo)致了與相應(yīng)的沒有經(jīng)遺傳修飾的野生型植物細(xì)胞相比較，具有GFAT(酶的)活性的蛋白活性增加 iii)將遺傳修飾引入植物細(xì)胞，該遺傳修飾導(dǎo)致與相應(yīng)的沒有經(jīng)遺傳修飾的野生型植物細(xì)胞相比較，具有UDP-Glc-DH(酶的)活性的蛋白活性增加 b)從包含根據(jù)下列步驟遺傳修飾的植物細(xì)胞再生植物 i)a)i ii)a)ii iii)a)iii iv)a)i和a)ii， v)a)i和a)iii， vi)a)ii和a)iii，或 vii)a)i和a)ii和a)iii c)根據(jù)下列步驟引入植物的植物細(xì)胞 i)b)i根據(jù)步驟a)ii的遺傳修飾， ii)b)i根據(jù)步驟a)iii的遺傳修飾， iii)b)i根據(jù)步驟a)ii的遺傳修飾并同時(shí)根據(jù)步驟a)iii的遺傳修飾， iv)b)ii根據(jù)步驟a)i的遺傳修飾， v)b)ii根據(jù)步驟a)iii的遺傳修飾， vi)b)ii根據(jù)步驟a)i的遺傳修飾并同時(shí)根據(jù)步驟a)iii的遺傳修飾， vii)b)iii根據(jù)步驟a)i的遺傳修飾， viii)b)iii根據(jù)步驟a)ii的遺傳修飾， ix)b)iii根據(jù)步驟a)i的遺傳修飾并同時(shí)根據(jù)步驟a)ii的遺傳修飾， x)b)iv根據(jù)步驟a)iii的遺傳修飾， xi)b)v根據(jù)步驟a)ii的遺傳修飾，或 xii)b)vi根據(jù)步驟a)i的遺傳修飾 并再生植物 d)根據(jù)下列步驟引入植物的植物細(xì)胞 i)c)i根據(jù)步驟a)iii的遺傳修飾， ii)c)ii根據(jù)步驟a)ii的遺傳修飾， iii)c)iv根據(jù)步驟a)iii的遺傳修飾， iv)c)v根據(jù)步驟a)ii的遺傳修飾， v)c)vii根據(jù)步驟a)ii的遺傳修飾， vi)c)vii根據(jù)步驟a)i的遺傳修飾，或 vii)c)ix根據(jù)步驟a)ii的遺傳修飾 并再生植物 e)根據(jù)需要，借助于根據(jù)b)vii、c)iii、c)vi、c)x、c)xi、c)xii的任何步驟或根據(jù)d)i至d)vii的任何步驟的植物產(chǎn)生進(jìn)一步的植物。
根據(jù)步驟a)引入植物細(xì)胞的遺傳修飾原則上可以是導(dǎo)致具有GFAT(酶的)活性的蛋白活性增加和具有UDP-葡萄糖脫氫酶(酶的)活性的蛋白活性增加的任何類型的修飾。
可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行根據(jù)步驟b)，以及根據(jù)需要，根據(jù)步驟c)和d)的植物的再生(例如，描述于“Plant Cell CultureProtocols”，1999，由R.D.Hall編輯，Humana Press，ISBN 0-89603-549-2)。
例如，可通過無性繁殖(例如，通過插枝、塊莖或通過愈傷組織培養(yǎng)以及整個(gè)植物的再生)或通過有性繁殖產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明方法的進(jìn)一步的植物(取決于根據(jù)步驟c)或步驟e)的方法)。這里，有性繁殖一般以可控方式，即，將所選的具有特定特性的植物彼此雜交并繁殖。優(yōu)選的以這樣的方式進(jìn)行選擇，使得進(jìn)一步的植物(取決于根據(jù)步驟c)或步驟e)產(chǎn)生的方法)包含在之前步驟中引入的修飾。
在根據(jù)本發(fā)明的制備合成乙酰透明質(zhì)酸的植物的方法中，產(chǎn)生根據(jù)本定明經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞的遺傳修飾可以同時(shí)進(jìn)行或以連續(xù)步驟進(jìn)行并可以任何組合。野生型植物和野生型植物細(xì)胞都可以作為起始點(diǎn)，編碼乙酰透明質(zhì)酸合成酶的外源核酸分子還沒有引入其中以及與相應(yīng)的沒有經(jīng)遺傳修飾的野生型植物細(xì)胞相比增加具有GFAT(酶的)活性的蛋白的活性的遺傳修飾沒有引入其中，以及與相應(yīng)的沒有經(jīng)遺傳修飾的野生型植物細(xì)胞相比增加具有UDP-Glc-DH(酶的)活性的蛋白的活性的遺傳修飾沒有引入其中；或者已經(jīng)經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞或植物，編碼乙酰透明質(zhì)酸合成酶的外源核酸分子已引入其中和/或與相應(yīng)的沒有經(jīng)遺傳修飾的野生型植物細(xì)胞相比增加具有GFAT(酶的)活性的蛋白的活性的遺傳修飾已引入其中和/或與相應(yīng)的沒有經(jīng)遺傳修飾的野生型植物細(xì)胞相比增加具有GFAT(酶的)活性的蛋白的活性的遺傳修飾已引入其中。這里，作為導(dǎo)致具有UDP-Glc-DH(酶的)活性的蛋白活性增加的遺傳修飾的相同方法是否用作導(dǎo)致具有GFAT(酶的)活性的蛋白活性增加的遺傳修飾無關(guān)緊要，只要兩個(gè)遺傳修飾一起導(dǎo)致在同一細(xì)胞中具有GFAT(酶的)活性的蛋白和具有UDP-Glc-DH(酶的)活性的蛋白活性的增加。用何種方法將編碼乙酰透明質(zhì)酸合成酶的外源核酸分子引入植物細(xì)胞中也無關(guān)緊要。
在根據(jù)本發(fā)明的制備合成乙酰透明質(zhì)酸的植物的方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，遺傳修飾在于將至少一個(gè)外源核酸分子引入植物細(xì)胞的基因組中，其中外源核酸分子的存在或表達(dá)導(dǎo)致在同一個(gè)植物細(xì)胞中具有GFAT(酶的)活性的蛋白和具有UDP-Glc-DH(酶的)活性的蛋白活性的增加。
在根據(jù)本發(fā)明的制備合成乙酰透明質(zhì)酸的植物的方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，遺傳修飾在于將至少一個(gè)外源核酸分子或多個(gè)外源核酸分子引入植物細(xì)胞的基因組中，其中一個(gè)或多個(gè)外源核酸分子包含乙酰透明質(zhì)酸合成酶的編碼序列和具有GFAT(酶的)活性的蛋白的編碼序列和具有UDP-Glc-DH(酶的)活性的蛋白的編碼序列。
如同上面描述的為了遺傳修飾而引入植物細(xì)胞或植物中的外源核酸分子那樣，根據(jù)本發(fā)明的制備合成乙酰透明質(zhì)酸的植物的方法中步驟a)引入的可以是單個(gè)的核酸分子或多個(gè)核酸分子。因此，編碼乙酰透明質(zhì)酸合成酶和/或編碼具有GFAT(酶的)活性的蛋白和/或編碼具有UDP-Glc-DH(酶的)活性的蛋白的外源核酸分子可以一起存在于單個(gè)核酸分子中；或所提到的外源核酸分子中的兩個(gè)一起存在于單個(gè)核酸分子中，且第三個(gè)外源核酸分子可以存在于另一個(gè)核酸分子中，以任何可能的組合方式；或者所提到的所有三個(gè)外源核酸分子在每一種情況下存在于單個(gè)獨(dú)立的核酸分子中。
此外，在根據(jù)本發(fā)明的制備合成乙酰透明質(zhì)酸的植物的方法的實(shí)施中，對于引入外源核酸分子，除了野生型植物細(xì)胞或野生型植物，還可以利用突變細(xì)胞或突變體，其區(qū)別在于它們已經(jīng)具有GFAT(酶的)活性的蛋白的活性增加和/或具有UDP-Glc-DH(酶的)活性的蛋白的活性增加。如果與相應(yīng)的野生型植物細(xì)胞或野生型植物相比較，突變細(xì)胞或突變體已經(jīng)具有GFAT(酶的)活性的蛋白具有增加的活性或增加的具有UDP-Glc-DH(酶的)活性的蛋白的活性，這足以實(shí)施根據(jù)本發(fā)明的制備合成乙酰透明質(zhì)酸的植物的方法，即將編碼乙酰透明質(zhì)酸合成酶的外源核酸分子和導(dǎo)致具有UDP-Glc-DH(酶的)活性的蛋白的活性的增加或具有GFAT(酶的)活性的蛋白的活性的增加(與相應(yīng)的沒有經(jīng)遺傳修飾的野生型植物細(xì)胞相比)的遺傳修飾引入到所述的突變細(xì)胞或突變體。如果與相應(yīng)的野生型植物細(xì)胞或相應(yīng)的野生型植物相比較，突變細(xì)胞或突變體已經(jīng)具有GFAT(酶的)活性的蛋白具有增加的活性和增加的具有UDP-Glc-DH(酶的)活性的蛋白的活性，可將編碼乙酰透明質(zhì)酸合成酶的外源核酸分子引入到所述的突變細(xì)胞或突變體中以實(shí)施根據(jù)本發(fā)明的制備合成乙酰透明質(zhì)酸植物的方法。
所有上面所述的其它關(guān)于為制備根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞或根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物的突變體的應(yīng)用在此以類似的方式應(yīng)用。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的制備合成乙酰透明質(zhì)酸的植物的方法，其中在步驟a)中編碼乙酰透明質(zhì)酸合成酶的核酸分子選自 a)核酸分子，特征在于它們編碼病毒的乙酰透明質(zhì)酸合成酶， b)核酸分子，特征在于它們編碼感染小球藻的病毒的乙酰透明質(zhì)酸合成酶， c)核酸分子，特征在于它們編碼綠草履蟲小球藻病毒1的乙酰透明質(zhì)酸合成酶， d)核酸分子，特征在于它們編碼綠草履蟲小球藻病毒1H1病毒株的乙酰透明質(zhì)酸合成酶， e)核酸分子，特征在于，與編碼乙酰透明質(zhì)酸合成酶的親本生物體的乙酰透明質(zhì)酸合成酶的核酸分子的密碼子相比較，編碼乙酰透明質(zhì)酸合成酶的核酸分子的密碼子被修飾了， f)核酸分子，特征在于，編碼乙酰透明質(zhì)酸合成酶的密碼子已經(jīng)被修飾，從而它們適應(yīng)它們被整合到或?qū)⒁系降幕蚪M的植物細(xì)胞或植物的密碼子的使用頻率， g)核酸分子，特征在于，它們編碼具有SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的乙酰透明質(zhì)酸合成酶，或者它們編碼其序列至少70％，優(yōu)選的至少80％，特別優(yōu)選的至少90％，尤其優(yōu)選的至少95％以及最優(yōu)選的至少98％與SEQ ID NO 2所示氨基酸序列同一的乙酰透明質(zhì)酸合成酶。
h)核酸分子，特征在于，它們編碼其氨基酸序列可衍生自插入到質(zhì)粒DSM16664中的核酸序列的編碼區(qū)的蛋白質(zhì)，或者它們編碼的蛋白的氨基酸序列至少70％，優(yōu)選的至少80％，特別優(yōu)選的至少90％，尤其優(yōu)選的至少95％以及最優(yōu)選的至少98％與可衍生自插入到質(zhì)粒DSM16664中的核酸序列的編碼區(qū)的氨基酸序列同一。
i)核酸分子，其包含SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 3所示的核酸序列，或者其至少70％，優(yōu)選的至少80％，優(yōu)選的至少90％，尤其優(yōu)選的至少95％以及最優(yōu)選的至少98％與SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 3所示核酸序列同一， j)核酸分子，其包含插入到質(zhì)粒DSM16664中的核酸序列，或者其至少70％，優(yōu)選的至少80％，優(yōu)選的至少90％，尤其優(yōu)選的至少95％以及最優(yōu)選的至少98％與插入到質(zhì)粒DSM16664中的核酸序列同一。
k)編碼乙酰透明質(zhì)酸合成酶的核酸分子，其中編碼乙酰透明質(zhì)酸合成酶的核酸分子與在植物細(xì)胞中起始轉(zhuǎn)錄的調(diào)控元件(啟動子)相連，或 l)根據(jù)k)的核酸分子，其中啟動子是組織特異性啟動子，特別優(yōu)選的是特異起始在植物塊莖、果實(shí)或種子細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的啟動子。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的制備合成乙酰透明質(zhì)酸的植物的方法，其中編碼具有GFAT活性的蛋白的核酸分子選自 a)核酸分子，特征在于它們編碼具有來源于細(xì)菌、動物或植物，優(yōu)選的來源于大腸桿菌或小鼠的GFAT活性的蛋白， b)核酸分子，特征在于它們編碼具有感染小球藻的病毒的GFAT活性的蛋白， c)核酸分子，特征在于它們編碼具有綠草履蟲小球藻病毒的GFAT活性的蛋白， d)核酸分子，特征在于，與編碼具有親本生物體的具有GFAT活性的相應(yīng)蛋白的核酸分子的密碼子相比較，編碼具有GFAT活性的蛋白的核酸分子的密碼子被修飾了， e)核酸分子，特征在于，如此修飾編碼具有GFAT活性的蛋白的密碼子，使得它們適應(yīng)它們將要整合到或被整合到的基因組的植物細(xì)胞或植物的密碼子的使用頻率， f)核酸分子，其編碼具有SEQ ID NO 8所示氨基酸序列的蛋白或具有SEQ ID NO 10所示氨基酸序列的蛋白或具有SEQ ID NO 12所示氨基酸序列的蛋白， g)核酸分子，其編碼的蛋白序列至少70％，優(yōu)選的至少80％，優(yōu)選的至少90％，尤其優(yōu)選的至少95％以及最優(yōu)選的至少98％與SEQ IDNO 8或SEQ ID NO 10或SEQ ID NO 12所示氨基酸序列同一。
h)核酸分子，其包含SEQ ID NO 7所示的核酸序列或與其互補(bǔ)的序列，或SEQ ID NO 9所示的核酸序列或與其互補(bǔ)的序列，或SEQ ID NO11所示的核酸序列或與其互補(bǔ)的序列，或SEQ ID NO 13所示的核酸序列或與其互補(bǔ)的序列， i)核酸分子，其至少70％，優(yōu)選的至少80％，優(yōu)選的至少90％，尤其優(yōu)選的至少95％以及最優(yōu)選的至少98％與h)中所描述的核酸序列同一， j)在嚴(yán)格條件下與f)或h)中所述核酸序列的至少一條鏈雜交的核酸分子， k)核酸分子，由于遺傳密碼子的簡并性，其核苷酸序列與f)或h)描述的核酸分子的序列不同，以及 l)核酸分子，其是a)，b)，c)，d)，e)，f)或h)所提到的核酸分子的片段、等位基因變體和/或衍生物， m)編碼具有GFAT活性的蛋白的核酸分子，其中編碼具有GFAT活性的蛋白的核酸分子與在植物細(xì)胞中起始轉(zhuǎn)錄的調(diào)控元件(啟動子)相連，或 n)根據(jù)m)的核酸分子，其中啟動子是組織特異性啟動子，特別優(yōu)選的是特異起始在植物塊莖、葉、果實(shí)或種子細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的啟動子。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的制備合成乙酰透明質(zhì)酸的植物的方法，其中編碼具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的核酸分子選自 a)核酸分子，特征在于它們編碼具有來源于病毒、細(xì)菌、動物或植物的UDP-Glc-DH活性的蛋白， b)核酸分子，特征在于它們編碼具有感染小球藻的病毒的UDP-Glc-DH活性的蛋白， c)核酸分子，特征在于它們編碼具有綠草履蟲小球藻病毒的UDP-Glc-DH活性的蛋白， d)核酸分子，特征在于，與編碼具有親本生物體的具有UDP-Glc-DH活性的相應(yīng)蛋白的核酸分子的密碼子相比較，編碼UDP-Glc-DH活性的蛋白的核酸分子的密碼子被修飾了， e)核酸分子，特征在于，如此修飾編碼具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的密碼子，使得它們適應(yīng)它們將要整合到或被整合到的基因組的植物細(xì)胞或植物的密碼子的使用頻率， f)核酸分子，其編碼具有SEQ ID NO 5所示氨基酸序列的蛋白， g)核酸分子，其編碼的蛋白的序列至少70％，優(yōu)選的至少80％，優(yōu)選的至少90％，尤其優(yōu)選的至少95％以及最優(yōu)選的至少98％與SEQ IDNO 5所示氨基酸序列同一， h)核酸分子，其包含SEQ ID NO 4所示的核苷酸序列或與其互補(bǔ)的序列，或SEQ ID NO 6所示的核苷酸序列或與其互補(bǔ)的序列， i)核酸分子，其至少70％，優(yōu)選的至少80％，優(yōu)選的至少90％，尤其優(yōu)選的至少95％以及最優(yōu)選的至少98％與h)中所描述的核酸序列同一， j)在嚴(yán)格條件下與f)或h)中所述核酸分子的至少一條鏈雜交的核酸分子， k)核酸分子，由于遺傳密碼子的簡并性，其核苷酸序列與f)或h)描述的核酸分子的序列不同，以及 l)核酸分子，其是a)，b)，c)，d)，e)，f)或h)所提到的核酸分子的片段、等位基因變體和/或衍生物， m)編碼具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的核酸分子，其中編碼具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的核酸分子與在植物細(xì)胞中起始轉(zhuǎn)錄的調(diào)控元件(啟動子)相連，或 n)根據(jù)m)的核酸分子，其中啟動子是組織特異性啟動子，特別優(yōu)選的是特異起始在植物塊莖、葉、果實(shí)或種子細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的啟動子。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，制備合成乙酰透明質(zhì)酸的植物的方法涉及制備其每克植物材料鮮重合成至少100μg，優(yōu)選至少600μg，特別優(yōu)選的至少1000μg，尤其優(yōu)選的至少1500μg乙酰透明質(zhì)酸的植物的方法。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，應(yīng)用根據(jù)本發(fā)明的制備合成乙酰透明質(zhì)酸的植物的方法制備根據(jù)本發(fā)明的經(jīng)遺傳修飾的植物。
本發(fā)明也提供通過根據(jù)本發(fā)明的制備合成乙酰透明質(zhì)酸的植物的方法得到的植物。
本發(fā)明另外還涉及制備乙酰透明質(zhì)酸的方法，包括從根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞，從根據(jù)本發(fā)明遺傳的植物，從根據(jù)本發(fā)明的繁殖材料，從根據(jù)本發(fā)明的可收獲的植物部分或從可通過根據(jù)本發(fā)明制備合成乙酰透明質(zhì)酸的植物的方法獲得的植物或這些植物的一部分提取乙酰透明質(zhì)酸的步驟。
優(yōu)選地，該方法也包括在提取乙酰透明質(zhì)酸前收獲所培養(yǎng)的根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞、根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物、根據(jù)本發(fā)明的繁殖材料、根據(jù)本發(fā)明的可收獲的植物部分、根據(jù)本發(fā)明的可加工的植物部分的步驟，并且特別優(yōu)選地還包括在收獲前培養(yǎng)根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞或根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物的步驟。
與細(xì)菌或動物組織相反，植物組織沒有透明質(zhì)酸酶并且不含有任何透明質(zhì)酸粘素。因此，如上面已經(jīng)描述的那樣，從植物組織中提取乙酰透明質(zhì)酸可用相對簡單的方法。如果需要，可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)一步純化含有乙酰透明質(zhì)酸的植物細(xì)胞或組織的上述水提物，例如，諸如用乙醇反復(fù)沉淀。在一般方法第3項(xiàng)中描述了純化乙酰透明質(zhì)酸的優(yōu)選方法。
已經(jīng)描述的用于從根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞或根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物中提取乙酰透明質(zhì)酸的方法也適用于從根據(jù)本發(fā)明的繁殖材料、從根據(jù)本發(fā)明的可收獲的植物部分或從可通過根據(jù)本發(fā)明用于制備合成乙酰透明質(zhì)酸的植物的方法獲得的植物或這些植物的一部分分離乙酰透明質(zhì)酸。
本發(fā)明也提供根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞、根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物、根據(jù)本發(fā)明的繁殖材料、根據(jù)本發(fā)明的可收獲的植物部分、根據(jù)本發(fā)明的可加工的植物部分或可通過根據(jù)本發(fā)明的用于制備乙酰透明質(zhì)酸的方法所獲得的植物的應(yīng)用。
本發(fā)明還涉及包含根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞的組合物。這里，細(xì)胞是否完整或因?yàn)橐驯黄扑?例如，通過加工)而不再完整都無關(guān)緊要。優(yōu)選的組合物是食物、飼料、藥品或美容產(chǎn)品。
本發(fā)明優(yōu)選地提供了這樣的組合物，其包含根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞、根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物、根據(jù)本發(fā)明的繁殖材料、根據(jù)本發(fā)明的可收獲的植物部分或可通過根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的植物的組分，并包含重組核酸分子，其中重組核酸分子的特征是，它們包含編碼乙酰透明質(zhì)酸合成酶和具有GFAT(酶的)活性的蛋白和具有UDP-Glc-DH(酶的)活性的蛋白的核酸分子。
將外源核酸分子穩(wěn)定整合到植物細(xì)胞或植物的基因組中導(dǎo)致外源核酸分子在被整合到植物細(xì)胞或植物的基因組后，其側(cè)翼為植物基因組的核酸序列。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的組合物的特征在于，存在于根據(jù)本發(fā)明的組合物中的重組核酸分子側(cè)翼為植物基因組的核酸序列。這里，植物基因組的核酸序列可以是天然存在于用于制備組合物的植物細(xì)胞或植物的基因組中的任何序列。
存在于根據(jù)本發(fā)明的組合物中的重組核酸分子可以是單個(gè)的或多個(gè)的重組核酸分子，其中編碼乙酰透明質(zhì)酸合成酶和具有GFAT(酶的)活性的蛋白和有UDP-Glc-DH(酶的)活性的蛋白的核酸分子存在于一個(gè)核酸分子中，或所提到的核酸分子可以存在于分別的重組核酸分子中。編碼乙酰透明質(zhì)酸合成酶或編碼具有GFAT(酶的)活性的蛋白或編碼有UDP-Glc-DH(酶的)活性的蛋白的核酸分子可以一起存在于單個(gè)重組核酸分子中；或者所提到的核酸分子的兩個(gè)可以一起存在于單個(gè)重組核酸分子中而第三個(gè)核酸分子可以存在于另一個(gè)重組核酸分子中，以任何可能的組合；或者所有三個(gè)所提到的核酸在每種情況下存在于單獨(dú)分離的重組核酸分子中。取決于編碼乙酰透明質(zhì)酸合成酶或編碼具有GFAT(酶的)活性的蛋白或編碼有UDP-Glc-DH(酶的)活性的蛋白的核酸分子以何種方式存在于根據(jù)本發(fā)明的組合物中，它們可以在側(cè)翼與相同的或不同的植物基因組的核酸序列相連。
可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的方法來證實(shí)根據(jù)本發(fā)明的組合物包含重組核酸分子，例如，諸如，基于雜交的方法，或優(yōu)選的利用基于PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))的方法。
優(yōu)選的，根據(jù)本發(fā)明的組合物包含至少0.005％，優(yōu)選的至少0.01％，特別優(yōu)選的至少0.05％，以及尤其優(yōu)選的至少0.1％的乙酰透明質(zhì)酸。
優(yōu)選的，根據(jù)本發(fā)明的組合物包含至多5％，優(yōu)選的至多2％，特別優(yōu)選的至多1％，以及尤其優(yōu)選的至少0.5％的乙酰透明質(zhì)酸。
如上述已提及，可使用根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞、根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物、根據(jù)本發(fā)明的繁殖材料、根據(jù)本發(fā)明的可收獲的植物部分、根據(jù)本發(fā)明的可加工的植物部分、根據(jù)本發(fā)明的可消費(fèi)的植物部分或者可通過根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的植物以制備食物或飼料。然而，也可用作工業(yè)應(yīng)用的原料，而不必分離乙酰透明質(zhì)酸。因此，例如，可將根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物或根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物部分應(yīng)用到在農(nóng)業(yè)耕作的地區(qū)以達(dá)到增加土壤的水結(jié)合。此外，可使用根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物或根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞制備干燥劑(例如，用于運(yùn)輸易于受潮的產(chǎn)品)或者用作液體的吸收劑(例如在尿布中或者用于吸收溢出的水性液體)。對于這種應(yīng)用，根據(jù)需要，可使用根據(jù)本發(fā)明遺傳修飾的整個(gè)植物、根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物的一部分或者根據(jù)本發(fā)明的粉碎(例如，碾磨)的經(jīng)遺傳修飾的植物或者根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物部分。適于在這些領(lǐng)域應(yīng)用的地上植物或植物部分是含乙酰透明質(zhì)酸但是僅含低比例的水的植物部分。這些優(yōu)選為谷類植物(谷物、稻、小麥、黑麥、燕麥、大麥、西米或高梁)的谷粒。因?yàn)楦鶕?jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞和根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物比文獻(xiàn)中描述的轉(zhuǎn)基因植物具有更高的乙酰透明質(zhì)酸含量，與這些相比較，當(dāng)將根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞或根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物用于工業(yè)應(yīng)用時(shí)，會用到更少的材料。
本發(fā)明也提供用于制備根據(jù)本發(fā)明的組合物的方法，其中使用根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞、根據(jù)的本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物、根據(jù)本發(fā)明的繁殖材料、根據(jù)本發(fā)明的可收獲的植物部分、根據(jù)本發(fā)明的可加工的植物部分、根據(jù)本發(fā)明的可消費(fèi)的植物部分或者可通過根據(jù)本發(fā)明用于制備合成乙酰透明質(zhì)酸的植物的方法獲得的植物。用于制備根據(jù)本發(fā)明的組合物的方法優(yōu)選地是用于制備食物或飼料的方法，用于制備藥品的方法或者用于制備美容產(chǎn)品的方法。
用于制備食物或飼料的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。在工業(yè)領(lǐng)域使用根據(jù)本發(fā)明遺傳修飾的植物或根據(jù)本發(fā)明的植物部分的方法也是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且尤其包括根據(jù)本發(fā)明遺傳修飾的植物或者根據(jù)本發(fā)明植物部分的粉碎或碾磨；然而，它們并不僅限于此。上面已經(jīng)描述了由于使用根據(jù)本發(fā)明的用于制備食物/飼料的主題或用于工業(yè)領(lǐng)域的主題所帶來的一些優(yōu)點(diǎn)。
根據(jù)本發(fā)明制備組合物的方法特別優(yōu)選的是制備含有乙酰透明質(zhì)酸的組合物的方法。
本發(fā)明同樣也提供通過用于制備根據(jù)本發(fā)明的組合物的方法獲得的組合物。
本發(fā)明也涉及根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞、根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物、根據(jù)本發(fā)明的繁殖材料、根據(jù)本發(fā)明的可收獲的植物部分、根據(jù)本發(fā)明的可加工的植物部分、根據(jù)本發(fā)明的可消費(fèi)的植物部分或者可通過根據(jù)本發(fā)明的用于制備合成乙酰透明質(zhì)酸的植物的方法獲得的植物用于制備根據(jù)本發(fā)明的組合物的用途。優(yōu)選的是根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞、根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的植物、根據(jù)本發(fā)明的繁殖材料、根據(jù)本發(fā)明的可收獲的植物部分、根據(jù)本發(fā)明的可加工的植物部分、根據(jù)本發(fā)明的可消費(fèi)的植物部分或者可通過根據(jù)本發(fā)明的用于制備合成乙酰透明質(zhì)酸的植物的方法獲得的植物用于制備食物或飼料、用于制備藥品或者用于制備美容產(chǎn)品的用途。
序列說明 SEQ ID NO 1核酸序列，編碼綠草履蟲小球藻病毒1的乙酰透明質(zhì)酸合成酶。
SEQ ID NO 2綠草履蟲小球藻病毒1的乙酰透明質(zhì)酸合成酶的氨基酸序列。所示的氨基酸序列可衍生自SEQ ID NO 1。
SEQ ID NO 3合成的核酸序列，編碼綠草履蟲小球藻病毒1的乙酰透明質(zhì)酸合成酶。如此合成所示序列的密碼子使得其適應(yīng)植物細(xì)胞中的密碼子的使用。所示的核酸序列編碼具有SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
SEQ ID NO 4核酸序列，編碼具有綠草履蟲小球藻病毒1的UDP-Glc-DH活性的蛋白。
SEQ ID NO 5具有綠草履蟲小球藻病毒1的UDP-Glc-DH活性的蛋白的氨基酸序列。所示的氨基酸序列可衍生自SEQ ID NO 4。
SEQ ID No 6合成的核酸序列，編碼具有綠草履蟲小球藻病毒1的UDP-Glc-DH活性的蛋白。如此合成所示序列的密碼子使得其適應(yīng)植物細(xì)胞中的密碼子的使用。所示的核酸序列編碼具有SEQ ID NO 5所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
SEQ ID NO 7核酸序列，編碼具有小鼠的GFAT-1活性的蛋白。
SEQ ID NO 8具有小鼠GFAT-1活性的蛋白的氨基酸序列。所示的氨基酸序列可衍生自SEQ ID NO 7。
SEQ ID NO 9核酸序列，編碼具有小鼠GFAT-2活性的蛋白。
SEQ ID NO 10具有小鼠GFAT-2活性的蛋白的氨基酸序列。所示的氨基酸序列可衍生自SEQ ID NO 9。
SEQ ID NO 11核酸序列，編碼具有大腸桿菌的GFAT活性的蛋白。
SEQ ID NO 12具有大腸桿菌的GFAT活性的蛋白的氨基酸序列。所示的氨基酸序列可衍生自SEQ ID NO 11。
SEQ ID NO 13合成的核酸序列，編碼具有大腸桿菌的GFAT活性的蛋白。如此合成所示序列的密碼子使得其適應(yīng)植物細(xì)胞中的密碼子的使用。所示的核酸序列編碼具有SEQ ID NO 12所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
SEQ ID NO 14在實(shí)施例1中用作引物的合成的寡核苷酸。
SEQ ID NO 15在實(shí)施例1中用作引物的合成的寡核苷酸。



圖1顯示校正曲線和用于計(jì)算植物組織中乙酰透明質(zhì)酸含量的回歸線的相應(yīng)方程式。校正曲線使用商業(yè)檢驗(yàn)試劑盒(Corgenix，Inc.，Colorado，USA的透明質(zhì)酸(HA)檢驗(yàn)試劑盒，Prod.No.029-001)和其中所提供的標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制。
所有引用的文獻(xiàn)，包括但不限于核酸或氨基酸序列的登錄號以參考文獻(xiàn)的方式結(jié)合到說明書中。
一般方法 下面描述可使用的與本發(fā)明有關(guān)的方法。這些方法為具體實(shí)施方案；然而，本發(fā)明不限于這些方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，通過改變所述方法和/或通過可選方法或方法的可選部分替換單個(gè)方法或方法的一部分，可以相同方式實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。
1、馬鈴薯植物的轉(zhuǎn)化 如Rocha-Sosa等(EMBO J.8，(1989)，23-29)所述，借助于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化馬鈴薯植物。
2、從植物組織中分離乙酰透明質(zhì)酸 為了檢測植物組織中乙酰透明質(zhì)酸的存在并測定乙酰透明質(zhì)酸含量，如下加工植物材料向約0.3g塊莖材料中添加200μl水(去礦質(zhì)的，電導(dǎo)率＝18MΩ)，并在實(shí)驗(yàn)室振蕩球磨機(jī)(MM200，購自Retsch，德國)中將混合物粉碎(30Hz，30秒鐘)。然后再添加800μl水(去礦質(zhì)的，電導(dǎo)率＝18MΩ)，并將混合物充分混合(例如，使用Vortex混合機(jī))。在16000xg離心5分鐘從上清液中分離細(xì)胞碎片和不溶成分。
3、乙酰透明質(zhì)酸的純化 約100克塊莖削皮，切成約1cm3大小的塊，添加100ml水(去礦質(zhì)的，電導(dǎo)率＝18MΩ)后在Warring攪拌機(jī)中以最大速度粉碎約30秒鐘。然后使用茶濾網(wǎng)移除細(xì)胞碎片。將已移除的細(xì)胞碎片在300ml水(去礦質(zhì)的，電導(dǎo)率＝18MΩ)中重懸，使用茶篩網(wǎng)再次移除?；旌纤@得的兩次懸液(100ml+300ml)并以13000xg離心15分鐘。向所獲得的離心上清液中添加NaCl直至1％的終濃度。在NaCl溶解到溶液內(nèi)后，通過添加2倍體積的乙醇接著徹底混合并保持在-20℃過夜進(jìn)行沉淀。然后將混合物在13000xg離心15分鐘。將這次離心后所獲得的沉積的沉淀物溶于100ml緩沖液(50mM TrisHCI，pH 8，1mM CaCl2)中，然后添加蛋白酶K至終濃度100μg/ml，并將溶液在42℃溫育2小時(shí)。這之后在95℃溫育10分鐘。再一次向該溶液中添加NaCl直至1％的終濃度。在NaCl溶解到溶液內(nèi)后，通過添加2倍體積的乙醇、徹底混合并保持在-20℃約96小時(shí)進(jìn)行另一次沉淀。這之后在13000xg離心15分鐘。將該離心后所獲得的沉積的沉淀物溶于30ml水(去礦質(zhì)的，電導(dǎo)率＝18MΩ)中，再一次添加NaCl至1％的終濃度。通過添加2倍體積的乙醇、徹底混合并保持在-20℃過夜，進(jìn)行另一次沉淀。將隨后在13000xg離心15分鐘所獲得的沉淀溶于20ml水(去礦質(zhì)的，電導(dǎo)率＝18MΩ)中。
通過離心過濾進(jìn)行進(jìn)一步的純化。為此，在每種情況下將5ml溶解的沉淀施加到膜濾器(CentriconAmicon，孔寬10 000NMWL，Prod.No.UCF8 010 96)上，并將樣品在2200xg離心分離直到濾器上僅剩余3ml溶液。再進(jìn)行兩次，每次然后向膜上的溶液中添加3ml水(去礦質(zhì)的，電導(dǎo)率＝18MΩ)，并每次在相同的條件下再次離心分離，直到結(jié)束時(shí)濾器上僅剩余約3ml溶液。去掉離心過濾后仍然存在于膜上的溶液，并將膜用約1.5ml水(去礦質(zhì)的，電導(dǎo)率＝18MΩ)反復(fù)漂洗(3到5次)。將仍存在于膜上的所有溶液和從漂洗中所獲得的溶液混合，添加NaCl至終濃度為1％，NaCl溶解到溶液中后，添加兩倍體積的乙醇，將樣品混合并通過在-20℃過夜貯藏獲得沉淀。將隨后在13000xg離心15分鐘獲得的沉淀溶解在4ml水(去礦質(zhì)的，電導(dǎo)率＝18MΩ)中，然后冷凍干燥(24小時(shí)，壓力0.37mbar，Christ，Osterode，Germany的冷凍干燥設(shè)備Christ Alpha 1-4)。
4、乙酰透明質(zhì)酸的檢測和乙酰透明質(zhì)酸含量的測定 根據(jù)制造商的說明(其因此作為參考的方式并入說明書中)，利用商業(yè)檢驗(yàn)(Corgenix，Inc.，Colorado，USA的透明質(zhì)酸(HA)檢驗(yàn)試劑盒，Prod.No.029-001)檢測乙酰透明質(zhì)酸。檢驗(yàn)原理是基于特異性結(jié)合乙酰透明質(zhì)酸的蛋白質(zhì)(HABP)的可獲得性并類似ELISA進(jìn)行，其中顏色反應(yīng)指示所檢查樣品中的乙酰透明質(zhì)酸含量。因此，對于乙酰透明質(zhì)酸的定量測定，應(yīng)當(dāng)以這樣的濃度使用待測樣品，從而使其在所述限度內(nèi)(例如取決于是否超過或未達(dá)到限度，稀釋所討論樣品或使用較少的水從植物組織中提取乙酰透明質(zhì)酸)。
在平行批次中，最初使將要測定的樣品的等分試樣進(jìn)行透明質(zhì)酸酶消化，然后使用商業(yè)檢驗(yàn)(Corgenix，Inc.，Colorado，USA的透明質(zhì)酸(HA)檢驗(yàn)試劑盒，Prod.No.029-001)進(jìn)行測定。使用400μl馬鈴薯塊莖提取物在透明質(zhì)酸酶緩沖液(0.1M磷酸鉀緩沖液，pH 5.3；150mM NaCl)中通過添加5μg(～3單位)透明質(zhì)酸酶(Sigma的III型透明質(zhì)酸酶，Prod.No.H2251)并在37℃溫育30分鐘，進(jìn)行透明質(zhì)酸酶消化。
在每種情況下以1∶10稀釋，然后使用所有樣品用于測定乙酰透明質(zhì)酸含量。
5、標(biāo)準(zhǔn)差的計(jì)算 根據(jù)下列公式計(jì)算所述的標(biāo)準(zhǔn)差 平方根[n∑x2-(∑x)2/n(n-1)] 其中，X是單個(gè)測定值的值，n是用于確定所討論的標(biāo)準(zhǔn)差的所有測定值的總和。
6、GFAT活性的測定 如Rachel等(1996，J.Bacteriol.178(8)，2320-2327)所描述的那樣測定具有GFAT活性的蛋白的活性。
用Hu等(2004，J.Biol.Chem.279(29)，29988-29993)描述的方法以區(qū)別蛋白是否具有GFAT-1或GFAT-2活性。
7、UDP-Glc-DH活性的測定 如Spicerl等(1998，J.Bacteriol.273(39)，25117-25124)所描述的那樣測定具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的活性。
8、番茄植物的轉(zhuǎn)化 利用US 5,565,347中所述的方法，借助于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化番茄植物。
實(shí)施例 1、植物表達(dá)載體IR 47-71的制備 質(zhì)粒pBinAR是雙元載體質(zhì)粒pBin19(Bevan，1984，Nucl Acids Res128711-8721)的衍生物，其構(gòu)建如下 從質(zhì)粒pDH51(Pietrzak等，1986 Nucleic Acids Res.14，5858)中分離529bp長的片段(其包含花椰菜花葉病毒35S啟動子的核苷酸6909-7437)作為EcoR I/Kpn I片段，并連接在pUC18的多聚接頭的EcoR I和Kpn I限制性位點(diǎn)之間。由此產(chǎn)生質(zhì)粒pUC18-35S。使用限制性內(nèi)切酶Hind III和Pvu II，從質(zhì)粒pAGV40(Herrera-Estrella等，1983Nature，303，209-213)中分離192bp長的片段，其包括Ti質(zhì)粒pTiACH5(Gielen等，1984，EMBOJournal 3，835-846)T-DNA章魚堿合成酶基因(基因3)的多腺苷酸化信號(3’端)(核苷酸11749-11939)。向Pvu II限制性位點(diǎn)添加Sph I接頭后，將片段連接在pUC18-35S的Sph I和Hind III限制性位點(diǎn)之間。這產(chǎn)生質(zhì)粒pA7。這里，使用EcoR I和Hind III移除包括35S啟動子和OCS終止子的整個(gè)多聚接頭，并連接到適當(dāng)切割的載體pBin19中。這產(chǎn)生了植物表達(dá)載體pBinAR(

和Willmitzer，1990，Plant Science 66，221-230)。
將馬鈴薯(Solanum tuberosum)patatin基因B33的啟動子(Rocha-Sosa等，1989，EMBO J.8，23-29)作為Dra I片段(核苷酸-1512-+14)連接到其末端已用T4-DNA聚合酶鈍端化的Sst I切割的載體pUC19中。這產(chǎn)生質(zhì)粒pUC19-B33。使用EcoR I和Sma I從該質(zhì)粒中移除B33啟動子并連到適當(dāng)限制性切割的載體pBinAR中。這產(chǎn)生植物表達(dá)載體pBinB33。
為了便于其它的克隆步驟，將MCS(多克隆位點(diǎn))延長。為此，合成兩個(gè)互補(bǔ)的寡核苷酸，在95℃加熱5分鐘，緩慢冷卻到室溫以允許良好固定(退火)，并克隆到pBinB33的Sal I和Kpn I限制性位點(diǎn)。用于此目的的寡核苷酸具有下列序列 5’-TCg ACA ggC CTg gAT CCT TAA TTA AAC TAg TCT CgA ggAgCT Cgg TAC-3’ 5’-CgA gCT CCT CgA gAC TAg TTT AAT TAA ggA TCC Agg CCTg-3’ 將所獲得的質(zhì)粒命名為IR 47-71。
2、植物表達(dá)載體pBinARHyg的制備 包含35S啟動子、Ocs終止子和整個(gè)多克隆位點(diǎn)的片段用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Hind III從pA7移除并克隆到用相同的限制性內(nèi)切酶酶切的載體pBIBHyg(Becker，1990，Nucleic Acids Res.18，203)中。所得到的質(zhì)粒命名為pBinARHyg。
3、克隆載體IC 317-204的制備 用限制性內(nèi)切酶Xho I和Hind III從質(zhì)粒IR 47-71中分離包含OCS終止子的核酸片段并克隆到用相同的限制性內(nèi)切酶酶切的載體pBlueScript KS(Stratagene，Prod.No.212207)中。所得到的質(zhì)粒命名為IC306-204。
用限制性內(nèi)切酶Bam HI和Eco Rl從質(zhì)粒IR 47-71中分離包含B33啟動子的核酸片段并克隆到用相同的限制性內(nèi)切酶酶切的載體pBlueScript KS(Stratagene，Prod.No.212207)中。所得到的質(zhì)粒命名為IC314-204。
用限制性內(nèi)切酶Bam HI從IC 306-204中分離OCS終止子并克隆到用相同的限制性內(nèi)切酶酶切的質(zhì)粒IC 314-204中。所得到的質(zhì)粒命名為IC317-204。
4、核酸分子的合成 a)編碼綠草履蟲小球藻病毒1的乙酰透明質(zhì)酸合成酶的核酸分子的合成 編碼綠草履蟲小球藻病毒1的乙酰透明質(zhì)酸合成酶(HAS)的核酸序列由Medigenomix GmbH(Munich，德國)合成并克隆到來自Invitrogen的載體pCR2.1(Prod.No.K2000-01)中。所得到的載體命名為IC 323-215。合成的編碼綠草履蟲小球藻病毒1HAS蛋白的核酸序列如SEQ ID NO 3所示。原始的從綠草履蟲小球藻病毒1中分離的相應(yīng)的核酸序列如SEQ IDNO 1所示。
b)編碼具有綠草履蟲小球藻病毒1的UDP-Glc-DH活性的蛋白的核酸分子的合成 編碼具有綠草履蟲小球藻病毒1的UDP-Glc-DH活性的蛋白的核酸分子由Entelechon GmbH合成并克隆到來自Invitrogen的載體pCR4Topo(Prod.No.K4510-20)。所得到的載體命名為IC 339-222。合成的編碼綠草履蟲小球藻病毒1的UDP-Glc-DH蛋白的核酸序列如SEQ ID NO 6所示。原始的從綠草履蟲小球藻病毒1中分離的相應(yīng)的核酸序列如SEQ ID NO 4所示。
c)編碼具有大腸桿菌GFAT活性的蛋白的核酸分子的合成 編碼具有大腸桿菌GFAT活性的蛋白的核酸序列由EntelechonGmbH合成并克隆到來自Invitrogen的載體pCR4Topo(Prod.No.K4510-20)。所得到的載體命名為IC 373-256。合成的編碼具有大腸桿菌GFAT活性的蛋白的核酸分子序列如SEQ ID NO 13所示。原始的從大腸桿菌分離的相應(yīng)的核酸序列如SEQ ID NO 11所示。
5、其它核酸分子的來源 a)編碼具有小鼠GFAT-1活性的蛋白的核酸分子 編碼具有GFAT-1活性的蛋白的核酸序列購自BioCat GmbH，Heidelberg(Art.No.MMM1013-65346，cDNA克隆MGC58262，IMAGE6742987)。這是一個(gè)由I.M.A.G.E.Konsortium(http://image.llnl.gov)生產(chǎn)并由BioCat GmbH分銷的克隆。這里，將編碼具有GFAT-1活性的蛋白的cDNA克隆到來自Invitrogen的載體pCMVSport 6。所得到的載體命名為IC 365-256。與SEQ ID NO 7所示的核酸序列相比較，插入到IC 365-256并編碼具有小家鼠的GFAT-1活性的蛋白的核酸序列有在1090位的從T到C的堿基交換以及在2027位的從G到A的堿基交換。這些堿基交換沒有導(dǎo)致由這兩個(gè)不同的核酸分子編碼的氨基酸序列的氨基酸交換。
具有小鼠GFAT-1活性的蛋白的編碼核酸序列如SEQ ID NO 8所示。為便于隨后的克隆步驟，用限制性內(nèi)切酶Xho I和Eco RV從IC 365-256中分離編碼具有GFAT-1活性的蛋白的序列并克隆到用相同的限制性內(nèi)切酶酶切的載體pME9(pBlueSkript載體，來自Stratagene，Prod.No.212207)中，該載體具有修飾過的多克隆位點(diǎn)，其兩端具有附加的Pac I限制性位點(diǎn)。所得到的質(zhì)粒命名為IC 367-256。. b)編碼具有小鼠的GFAT-2活性的蛋白的核酸分子 編碼具有小鼠的GFAT-2活性的蛋白的核酸分子購自Invitrogen(Clone ID 4167189，cDNA克隆MGC18324，IMAGE4167189)。這是一個(gè)由I.M.A.G.E.Konsortium(http://image.llnl.gov)生產(chǎn)并由Invitrogen分銷的克隆。這里，將編碼具有GFAT-2活性的蛋白的cDNA克隆到來自Invitrogen的載體pCMV Sport 6中。所得到的載體命名為IC 369-256。編碼具有小家鼠的GFAT-2活性的蛋白的核酸序列如SEQ ID NO 9所示。
6、包含綠草履蟲小球藻病毒1的乙酰透明質(zhì)酸合成酶的編碼核酸序列的植物表達(dá)載體IC 341-222的制備 利用BamH I和Xho I限制性消化，從質(zhì)粒IC 323-215中分離包含乙酰透明質(zhì)酸合成酶編碼序列的核酸分子并克隆到質(zhì)粒IR 47-71的BamH I和Xho I限制性位點(diǎn)中。所得到的植物表達(dá)載體命名為IC 341-222。
7、植物表達(dá)載體IC 370-256和IC 376-256的制備，其包含具有小鼠GFAT-1活性的蛋白和具有綠草履蟲小球藻病毒1的UDP-Glc-DH活性的蛋白的編碼核酸序列。
利用BamH I和Kpn I限制性消化，從質(zhì)粒IC 339-222中分離包含具有綠草履蟲小球藻病毒1的UDP-Glc-DH活性的蛋白的編碼序列的核酸分子并克隆到用相同的限制性內(nèi)切酶酶切的質(zhì)粒pA7中。所得到的植物表達(dá)載體命名為IC 342-222。
通過Xba I和Kpn I限制性消化，從質(zhì)粒IC 342-222中分離包含具有綠草履蟲小球藻病毒1的UDP-Glc-DH活性的蛋白的編碼序列的核酸分子并克隆到用Xba I和Kpn I限定的表達(dá)載體pBinAR Hyg中。所得到的植物表達(dá)載體命名為IC 349-222。
在下一個(gè)步驟中，將通過用Eco IR限制性消化從IC 317-204中分離的包含B33啟動子和OCS終止子的核酸片段克隆到IC 349-222的Eco IR限制性位點(diǎn)。這里，確保啟動子(35S和B33)是頭對頭的定向。所得的載體命名為IC 354-222。
在進(jìn)一步的克隆步驟中，通過利用Xho I和Eco RV限制性消化，從IC 367-256中分離包含具有小鼠GFAT-1活性的蛋白的編碼序列的核酸片段，并克隆到用Xho I和Ecl136 II限制的質(zhì)粒IC 354-222中。所得到的植物表達(dá)載體命名為IC 370-256。
在測序分析質(zhì)粒IC 370-256后，發(fā)現(xiàn)與插入到質(zhì)粒IC 365-256的核酸序列相比較，具有小鼠GFAT-1活性的蛋白的編碼核酸序列在兩個(gè)位點(diǎn)上有改變。與SEQ ID NO 7所示核酸序列相比較，質(zhì)粒IC 370-256包含的具有編碼小鼠GFAT-1活性的蛋白的核酸序列具有在1160位上的由G到A的堿基交換、1190位上的由T到C的堿基交換、1245位上的由T到C和2027位上的由G到A的堿基交換。該改變的核酸分子編碼的蛋白，相對于SEQ ID NO 8所示的氨基酸序列來說，具有在304位由R到Q和在366位由C到R的氨基酸改變。
為得到包含正確的編碼具有小鼠的GFAT-1活性的蛋白的核酸序列的植物表達(dá)載體，再次通過用Xho I和Eco RV的限制性消化從IC 365-256分離具有小鼠GFAT-1活性的蛋白的編碼序列，并將其克隆到用Xho I和Ecl136 II限制的質(zhì)粒IC 354-222中。所得到的植物表達(dá)載體命名為IC376-256。
質(zhì)粒IC 376-256包含的編碼具有小鼠的GFAT-1活性的蛋白的核酸序列與插入到質(zhì)粒365-256的具有小鼠GFAT-1活性的蛋白的編碼序列完全相同。由該核酸分子編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO 8所示。
8、植物表達(dá)載體IC 372-256的制備，其包含具有小鼠GFAT-2活性的蛋白和具有綠草履蟲小球藻病毒1的UDP-Glc-DH活性的蛋白的編碼核酸序列 通過用Xho I和Eco RV的限制性消化從IC 369-256分離包含具有小鼠GFAT-2活性的蛋白的編碼序列的核酸片段，并克隆到用Xho I和Ecl136 II限制的質(zhì)粒IC 354-222中。所得到的植物表達(dá)載體命名為IC372-256。
9、植物表達(dá)載體IC 375-271的制備，其包含具有大腸桿菌的GFAT活性的蛋白和具有綠草履蟲小球藻病毒1的UDP-Glc-DH活性的蛋白的編碼核酸序列 通過用Xho I和Eco RV的限制性消化從IC 373-256分離包含具有大腸桿菌的GFAT活性的蛋白的編碼序列的核酸片段，并克隆到用Xho I和Ecl136 II限制的質(zhì)粒IC 354-222中。所得到的植物表達(dá)載體命名為IC375-271。
10、用包含編碼乙酰透明質(zhì)酸合成酶的核酸分子的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化馬鈴薯植物 用一般方法第1項(xiàng)的方法，用植物表達(dá)載體IC 341-222轉(zhuǎn)化馬鈴薯植物，該載體包含在馬鈴薯patatin基因B33啟動子(Rocha-Sosa等，1989，EMBO J.8，23-29)控制下的綠草履蟲小球藻病毒1的乙酰透明質(zhì)酸合成酶的編碼核酸序列。所得到的用質(zhì)粒IC 341-222轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植物被命名為365ES。
11、用包含編碼乙酰透明質(zhì)酸合成酶的核酸分子的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物的分析 a)構(gòu)建校正曲線 根據(jù)制造商所描述的方法，使用在商業(yè)化檢驗(yàn)試劑盒(Corgenix，Inc.，Colorado，USA的透明質(zhì)酸(HA)檢驗(yàn)試劑盒，Prod.No.029-001)中提供的標(biāo)準(zhǔn)溶液建立校正曲線。為了測定1600ng/ml乙酰透明質(zhì)酸的消光，基于制造商所指出的提供的標(biāo)準(zhǔn)量，使用包含800ng/ml乙酰透明質(zhì)酸的雙倍量。在每種情況下，進(jìn)行三個(gè)獨(dú)立的測定系列，并且確定對應(yīng)的均值。這產(chǎn)生了如下校正曲線
表1用于構(gòu)建定量測定植物組織中乙酰透明質(zhì)酸含量的校正曲線的測定值。借助于軟件(Microsoft Office Excel 2002，SP2)，將所獲得的測定值輸入到圖表中，并確定趨勢線函數(shù)的方程式(見圖1)。E450nm指450nm波長處的消光，s.d.是單個(gè)數(shù)值計(jì)算均值的標(biāo)準(zhǔn)差。
b)365ES品系的馬鈴薯塊莖的分析 在溫室中，在6cm罐的土壤中培養(yǎng)365ES品系的個(gè)體植物。在每種情況下，根據(jù)在一般方法第2項(xiàng)所描述的方法加工個(gè)體植物的約0.3g馬鈴薯塊莖材料。使用在一般方法第4項(xiàng)所描述的方法，借助于實(shí)施例10a)和圖1中所示的校正曲線，測定各個(gè)植物提取物中存在的乙酰透明質(zhì)酸的量。這里，使用離心后所獲得的上清液以1∶10稀釋用于測定乙酰透明質(zhì)酸含量。
對于所選植物獲得下列結(jié)果 表2獨(dú)立選擇的365 ES品系轉(zhuǎn)基因植物所產(chǎn)生的乙酰透明質(zhì)酸的量(每克鮮重的乙酰透明質(zhì)酸μg數(shù))。第1列指從中收獲塊莖材料的植物(這里，“野生型”指未轉(zhuǎn)化的植物，然而其具有用作轉(zhuǎn)化起始材料的基因型)。第2列顯示用于測定乙酰透明質(zhì)酸含量的所討論的植物塊莖材料的量。第3列包含各個(gè)植物提取物1∶10稀釋液的所測定的消光。借助于回歸線方程式(見圖1)，考慮到稀釋因子，如下計(jì)算第4列((第3列值-0.149)/0.00185)x10。第5列顯示基于所用鮮重的乙酰透明質(zhì)酸的量，并如下計(jì)算(第4列值/第2列值)/1000?！皀.d.”意思是檢測不到。
12.用包含具有GFAT活性的蛋白和具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的編碼核酸序列的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化合成乙酰透明質(zhì)酸的植物 用一般方法第1項(xiàng)給出的方法，用植物表達(dá)載體IC 370-256，IC376-256，IC 372-256和IC 375-271在每種情況下轉(zhuǎn)化365 ES 13和365 ES74品系馬鈴薯植物。
將用質(zhì)粒IC 370-256轉(zhuǎn)化的365 ES 13品系轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植物命名為393 ES。
將用質(zhì)粒IC 370-256轉(zhuǎn)化的365 ES 74品系轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植物命名為394 ES。
將用質(zhì)粒IC 372-256轉(zhuǎn)化的365 ES 13品系轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植物命名為395 ES。
將用質(zhì)粒IC 372-256轉(zhuǎn)化的365 ES 74品系轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植物命名為396 ES。
將用質(zhì)粒IC 375-271轉(zhuǎn)化的365 ES 13品系轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植物命名為403 ES。
將用質(zhì)粒IC 375-271轉(zhuǎn)化的365 ES 74品系轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植物命名為404 ES。
將用質(zhì)粒IC 376-256轉(zhuǎn)化的365 ES 13品系轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植物命名為408 ES。
將用質(zhì)粒IC 376-256轉(zhuǎn)化的365 ES 74品系轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植物命名為409 ES。
13、分析用包含具有GFAT活性的蛋白和具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的編碼核酸序列的植物表達(dá)載體額外轉(zhuǎn)化的合成乙酰透明質(zhì)酸的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植物 在溫室中，在6cm罐的土壤中培養(yǎng)393 ES，394 ES，395 ES，396 ES，403 ES，404 ES和409 ES品系的個(gè)體植物。在每種情況下，根據(jù)在一般方法第2項(xiàng)所描述的方法加工個(gè)體植物的約0.3g馬鈴薯塊莖或葉子材料。使用在一般方法第4項(xiàng)所描述的方法，借助于根據(jù)實(shí)施例10a)產(chǎn)生的校正曲線(為每一個(gè)單獨(dú)的測定系列新產(chǎn)生校正曲線)，測定各個(gè)植物提取物中所含的乙酰透明質(zhì)酸的量。這里，為測定乙酰透明質(zhì)酸含量，在每種情況下用水(去礦質(zhì)，電導(dǎo)率＝18MΩ)稀釋離心后獲得的上清液，使得單個(gè)樣本所測得的消光值在校正曲線的線性范圍內(nèi)。源自用不同質(zhì)粒原始轉(zhuǎn)化的植物的結(jié)果如下 a)393 ES品系塊莖的分析 對名為393 ES品系的單個(gè)轉(zhuǎn)基因植物的每個(gè)塊莖取兩個(gè)獨(dú)立的樣本，并且在每種情況下分別測定乙酰透明質(zhì)酸含量。然后用一般方法第5項(xiàng)給出的公式計(jì)算每個(gè)塊莖的單個(gè)測定獲得的值的均值和標(biāo)準(zhǔn)差。通過計(jì)算每種情況下在十個(gè)不同植物(分別是野生型(Solanum tuberosum cv.Désirée)和365 ES 13品系的無性后代)的塊莖中的乙酰透明質(zhì)酸的量計(jì)算名為野生型的植物和名為365 ES 13的植物的所述均值和標(biāo)準(zhǔn)差。得到了所選擇的植物的下列結(jié)果 表3獨(dú)立地選擇的393 ES品系轉(zhuǎn)基因植物的塊莖中產(chǎn)生的乙酰透明質(zhì)酸的量(每克鮮重的乙酰透明質(zhì)酸μg數(shù))。第1列包含從中收獲塊莖材料的植物的名稱(這里，“野生型”指未轉(zhuǎn)化的植物；365 ES 13指表達(dá)乙酰透明質(zhì)酸合成酶并用作用植物表達(dá)載體IC 370-256轉(zhuǎn)化產(chǎn)生393 ES品系的起始材料的植物)。第2列顯示了對所討論的塊莖所測定的乙酰透明質(zhì)酸量的均值。第3列顯示了所測定的均值的標(biāo)準(zhǔn)差。
b)394 ES品系塊莖的分析 對命名為394 ES品系的單個(gè)轉(zhuǎn)基因植物的每個(gè)塊莖取兩個(gè)獨(dú)立的樣本，并且在每種情況下分別測定乙酰透明質(zhì)酸含量。然后用一般方法第5項(xiàng)給出的公式計(jì)算每個(gè)塊莖的單獨(dú)測定獲得的值的均值和標(biāo)準(zhǔn)差。通過計(jì)算每種情況下在18株不同的野生型植物和26株不同的365 ES 74品系植物(分別是野生型(Solanum tuberosum cv.Désirée)和365 ES 74品系的無性后代)的塊莖中的乙酰透明質(zhì)酸的量，計(jì)算名為野生型的植物和名為365ES的植物的所述均值和標(biāo)準(zhǔn)差。得到了所選擇的植物的下列結(jié)果 表4獨(dú)立地選擇的394 ES品系轉(zhuǎn)基因植物的塊莖所產(chǎn)生的乙酰透明質(zhì)酸的量(每克鮮重的乙酰透明質(zhì)酸μg數(shù))。第1列包含從中收獲塊莖材料的植物的名稱(這里，“野生型”指未轉(zhuǎn)化的植物；365 ES 74指表達(dá)乙酰透明質(zhì)酸合成酶并用作用植物表達(dá)載體IC 370-256轉(zhuǎn)化產(chǎn)生394 ES品系的起始材料的植物)。第2列顯示了對所討論的塊莖所測定的乙酰透明質(zhì)酸量的均值。第3列顯示了所測定的均值的標(biāo)準(zhǔn)差。
c)395 ES品系塊莖的分析 如果可能的話，對名為395 ES品系的各轉(zhuǎn)基因植物的每個(gè)塊莖取兩個(gè)獨(dú)立的樣本，并且在每種情況下分別測定乙酰透明質(zhì)酸含量。然后用一般方法第5項(xiàng)給出的公式計(jì)算每個(gè)塊莖單獨(dú)測定獲得的值的均值和標(biāo)準(zhǔn)差。通過計(jì)算每種情況下在10株不同的野生型植物和18株不同的365 ES 13品系植物(分別是野生型(Solanum tuberosum cv.Désirée)和365 ES 13品系的無性后代)的塊莖中的乙酰透明質(zhì)酸的量，計(jì)算名為野生型的植物和名為365 ES的植物的所述均值和標(biāo)準(zhǔn)差。得到了所選擇的植物的下列結(jié)果 表5獨(dú)立地選擇的395 ES品系轉(zhuǎn)基因植物的塊莖所產(chǎn)生的乙酰透明質(zhì)酸的量(每克鮮重的乙酰透明質(zhì)酸μg數(shù))。第1列包含從中收獲塊莖材料的植物的名稱(這里，“野生型”指未轉(zhuǎn)化的植物；365 ES 13指表達(dá)乙酰透明質(zhì)酸合成酶并用作用植物表達(dá)載體IC 372-256轉(zhuǎn)化產(chǎn)生395 ES品系的起始材料的植物)。第2列顯示了對所討論的塊莖所測定的乙酰透明質(zhì)酸量的均值。第3列顯示了所測定的均值的標(biāo)準(zhǔn)差。至于沒有標(biāo)出標(biāo)準(zhǔn)差的植物，只測定了一個(gè)塊莖的乙酰透明質(zhì)酸含量。
d)395 ES品系葉子的分析 測定了具有395 ES名稱的植物品系的個(gè)體的葉子的乙酰透明質(zhì)酸含量。通過在每種情況下計(jì)算在4株不同的野生型植物和9株不同的365 ES13品系植物(分別是野生型(Solanum tuberosum cv.Désirée)和365 ES 13品系的無性后代)的葉子中的乙酰透明質(zhì)酸的量，計(jì)算具有野生型名稱的植物和具有365 ES名稱的植物的所述均值和標(biāo)準(zhǔn)差。得到了所選擇的植物的下列結(jié)果 表6獨(dú)立地選擇的395ES品系轉(zhuǎn)基因植物的葉子所產(chǎn)生的乙酰透明質(zhì)酸的量(每克鮮重的乙酰透明質(zhì)酸μg數(shù))。第1列包含從中收獲塊莖材料的植物的名稱(在此，“野生型”指未轉(zhuǎn)化的植物；365 ES 13指表達(dá)乙酰透明質(zhì)酸合成酶并用作用植物表達(dá)載體IC 372-256轉(zhuǎn)化產(chǎn)生395 ES品系的起始材料的植物)。第2列顯示了對所討論的塊莖所測定的乙酰透明質(zhì)酸量的均值。第3列顯示了所測定的均值的標(biāo)準(zhǔn)差。至于沒有標(biāo)出標(biāo)準(zhǔn)差的植物，只測定了一個(gè)葉子樣本的乙酰透明質(zhì)酸含量。
e)396 ES品系塊莖的分析 為名為396品系的各轉(zhuǎn)基因植物的每個(gè)塊莖取兩個(gè)獨(dú)立的樣本，并且在每種情況下分別測定乙酰透明質(zhì)酸含量。然后用一般方法第5項(xiàng)給出的公式計(jì)算每個(gè)塊莖的單獨(dú)測定獲得的值的均值和標(biāo)準(zhǔn)差。通過計(jì)算每種情況下在12株不同的野生型植物和14株不同的365 ES 74品系植物(分別是野生型(Solanum tuberosum cv.Désirée)和365 ES 74品系的無性后代)的塊莖中的乙酰透明質(zhì)酸的量，計(jì)算名為野生型的植物和名為365 ES的植物的所述均值和標(biāo)準(zhǔn)差。得到了所選擇的植物的下列結(jié)果 表7獨(dú)立地選擇的396 ES品系轉(zhuǎn)基因植物的塊莖所產(chǎn)生的乙酰透明質(zhì)酸的量(每克鮮重的乙酰透明質(zhì)酸μg數(shù))。第1列包含從中收獲塊莖材料的植物的名稱(這里，“野生型”指未轉(zhuǎn)化的植物；365 ES 74指表達(dá)乙酰透明質(zhì)酸合成酶并用作用植物表達(dá)載體IC 372-256轉(zhuǎn)化產(chǎn)生396 ES品系的起始材料的植物)。第2列顯示了對所討論的塊莖所測定的乙酰透明質(zhì)酸量的均值。第3列顯示了所測定的均值的標(biāo)準(zhǔn)差。
f)396 ES品系葉子的分析 測定了具有396 ES名字的植物品系的個(gè)體的葉子的乙酰透明質(zhì)酸含量。通過在每種情況下計(jì)算在4株不同的野生型植物和6株不同的365 ES13品系植物(分別是野生型(Solanum tuberosum cv.Désirée)和365 ES 13品系的無性后代)的葉子中的乙酰透明質(zhì)酸的量，計(jì)算具有野生型名字的植物和具有365 ES名字的植物的所述均值和標(biāo)準(zhǔn)差。得到了所選擇的植物的下列結(jié)果 表8獨(dú)立地選擇的396 ES品系轉(zhuǎn)基因植物的葉子所產(chǎn)生的乙酰透明質(zhì)酸的量(每克鮮重的乙酰透明質(zhì)酸μg數(shù))。第1列包含從中收獲葉子材料的植物的名稱(這里，“野生型”指未轉(zhuǎn)化的植物；365 ES 74指表達(dá)乙酰透明質(zhì)酸合成酶并用作用植物表達(dá)載體IC 372-256轉(zhuǎn)化產(chǎn)生396 ES品系的起始材料的植物)。第2列顯示了為所討論的塊莖所測定的乙酰透明質(zhì)酸量的均值。第3列顯示了所測定的均值的標(biāo)準(zhǔn)差。至于沒有標(biāo)出標(biāo)準(zhǔn)差的植物，只測定了一個(gè)葉子樣本的乙酰透明質(zhì)酸含量。
g)403 ES品系塊莖的分析 為名為403 ES品系的各轉(zhuǎn)基因植物的每個(gè)塊莖取兩個(gè)獨(dú)立的樣本(如果可能的話)，并且在每種情況下分別測定乙酰透明質(zhì)酸含量。然后用一般方法第5項(xiàng)給出的公式計(jì)算每個(gè)塊莖的單個(gè)測定獲得的值的均值和標(biāo)準(zhǔn)差。通過計(jì)算每種情況下在10株不同的野生型植物和10株不同的365ES13品系植物(分別是野生型(Solanum tuberosum cv.Désirée)和365 ES 13品系的無性后代)的塊莖中的乙酰透明質(zhì)酸的量，計(jì)算名為野生型的植物和名為365 ES的植物的所述均值和標(biāo)準(zhǔn)差。得到了所選擇的植物的下列結(jié)果 表9獨(dú)立地選擇的403 ES品系轉(zhuǎn)基因植物的塊莖所產(chǎn)生的乙酰透明質(zhì)酸的量(每克鮮重的乙酰透明質(zhì)酸μg數(shù))。第1列包含從中收獲塊莖材料的植物的名稱(這里，“野生型”指未轉(zhuǎn)化的植物；365 ES 13指表達(dá)乙酰透明質(zhì)酸合成酶并用作用植物表達(dá)載體IC 375-271轉(zhuǎn)化產(chǎn)生403 ES品系的起始材料的植物)。第2列顯示了為所討論的塊莖所測定的乙酰透明質(zhì)酸量的均值。第3列顯示了所測定的均值的標(biāo)準(zhǔn)差?！皀.d.”意思在塊莖中不可能檢測到乙酰透明質(zhì)酸。至于沒有標(biāo)出標(biāo)準(zhǔn)差的植物，只測定了一個(gè)塊莖樣本的乙酰透明質(zhì)酸含量。
h)403 ES品系葉子的分析 測定了具有403 ES名字的植物品系的個(gè)體的葉子的乙酰透明質(zhì)酸含量。通過在每種情況下計(jì)算在5株不同的野生型植物和5株不同的365 ES13品系植物(分別是野生型(Solanum tuberosum cv.Désirée)和365 ES 13品系的無性后代)的葉子中的乙酰透明質(zhì)酸的量，計(jì)算具有野生型名字的植物和具有365 ES名字的植物的所述均值和標(biāo)準(zhǔn)差。得到了所選擇的植物的下列結(jié)果 表10獨(dú)立地選擇的403 ES品系轉(zhuǎn)基因植物的葉子所產(chǎn)生的乙酰透明質(zhì)酸的量(每克鮮重的乙酰透明質(zhì)酸μg數(shù))。第1列包含從中收獲葉子材料的植物的名稱(這里，“野生型”指未轉(zhuǎn)化的植物；365 ES 13指表達(dá)乙酰透明質(zhì)酸合成酶并用作用植物表達(dá)載體IC 375-271轉(zhuǎn)化產(chǎn)生403 ES品系的起始材料的植物)。第2列顯示了對所討論的塊莖所測定的乙酰透明質(zhì)酸量的均值。第3列顯示了所測定的均值的標(biāo)準(zhǔn)差。至于沒有標(biāo)出標(biāo)準(zhǔn)差的植物，只測定了一個(gè)葉子樣本的乙酰透明質(zhì)酸含量。
i)404 ES品系塊莖的分析 為名為404 ES品系的各轉(zhuǎn)基因植物的每個(gè)塊莖取兩個(gè)獨(dú)立的樣本(如果可能的話)，并且在每種情況下分別測定乙酰透明質(zhì)酸含量。然后用一般方法第5項(xiàng)給出的公式計(jì)算每個(gè)塊莖的單個(gè)測定獲得的值的均值和標(biāo)準(zhǔn)差。通過計(jì)算在每種情況下在10株不同的野生型植物和12株不同的365 ES74品系植物(分別是野生型(Solanum tuberosum cv.Désirée)和365 ES 74品系的無性后代)的塊莖中的乙酰透明質(zhì)酸的量，計(jì)算名為野生型的植物和名為365 ES的植物的所述均值和標(biāo)準(zhǔn)差。得到了所選擇的植物的下列結(jié)果 表11獨(dú)立地選擇的404 ES品系轉(zhuǎn)基因植物的塊莖所產(chǎn)生的乙酰透明質(zhì)酸的量(每克鮮重的乙酰透明質(zhì)酸μg數(shù))。第1列包含從中收獲塊莖材料的植物的名稱(在此，“野生型”指未轉(zhuǎn)化的植物；365 ES 74指表達(dá)乙酰透明質(zhì)酸合成酶并用作用植物表達(dá)載體IC 375-271轉(zhuǎn)化產(chǎn)生404 ES品系的起始材料的植物)。第2列顯示了對所討論的塊莖所測定的乙酰透明質(zhì)酸量的均值。第3列顯示了所測定的均值的標(biāo)準(zhǔn)差?！皀.d.”意思在塊莖中不可能檢測到乙酰透明質(zhì)酸。至于沒有標(biāo)出標(biāo)準(zhǔn)差的植物，只測定了一個(gè)塊莖樣本的乙酰透明質(zhì)酸含量。
j)404 ES品系葉子的分析 測定了具有404 ES名字的植物品系的個(gè)體的葉子的乙酰透明質(zhì)酸含量。通過在每種情況下計(jì)算在7株不同的野生型植物和9株不同的365 ES74品系植物(分別是野生型(Solanum tuberosum cv.Désirée)和365 ES 74品系的無性后代)的葉子中的乙酰透明質(zhì)酸的量，計(jì)算具有野生型名字的植物和具有365 ES名字的植物的所述均值和標(biāo)準(zhǔn)差。得到了所選擇的植物的下列結(jié)果 表12獨(dú)立地選擇的404 ES品系轉(zhuǎn)基因植物的葉子所產(chǎn)生的乙酰透明質(zhì)酸的量(每克鮮重的乙酰透明質(zhì)酸μg數(shù))。第1列包含從中收獲葉子材料的植物的名稱(在此，“野生型”指未轉(zhuǎn)化的植物；365 ES 74指表達(dá)乙酰透明質(zhì)酸合成酶并用作用植物表達(dá)載體IC 375-271轉(zhuǎn)化產(chǎn)生404 ES品系的起始材料的植物)。第2列顯示了對所討論的葉子所測定的乙酰透明質(zhì)酸量的均值。第3列顯示了所測定的均值的標(biāo)準(zhǔn)差。至于沒有標(biāo)出標(biāo)準(zhǔn)差的植物，只測定了一個(gè)葉子樣本的乙酰透明質(zhì)酸含量。
k)409 ES品系塊莖的分析 對名為409 ES品系的各轉(zhuǎn)基因植物的每個(gè)塊莖取得樣本，并且在每種情況下測定乙酰透明質(zhì)酸含量。通過計(jì)算在每種情況下在4株不同的野生型植物和6株不同的365 ES 74品系植物(分別是野生型(Solanumtuberosum cv.Désirée)和365 ES 74品系的無性后代)的塊莖中的乙酰透明質(zhì)酸的量，計(jì)算名為野生型的植物和名為365 ES的植物的所述均值和標(biāo)準(zhǔn)差。用一般方法第5項(xiàng)給出的公式計(jì)算每個(gè)塊莖的單獨(dú)測定獲得的值的均值和標(biāo)準(zhǔn)差。得到了所選擇的植物的下列結(jié)果 表13獨(dú)立地選擇的409 ES品系轉(zhuǎn)基因植物的塊莖所產(chǎn)生的乙酰透明質(zhì)酸的量(每克鮮重的乙酰透明質(zhì)酸μg數(shù))。第1列包含從中收獲塊莖材料的植物的名稱(在此，“野生型”指未轉(zhuǎn)化的植物；365 ES 74指表達(dá)乙酰透明質(zhì)酸合成酶并用作用植物表達(dá)載體IC 375-271轉(zhuǎn)化產(chǎn)生409 ES品系的起始材料的植物)。第2列顯示了對所討論的塊莖所測定的乙酰透明質(zhì)酸量的均值。第3列顯示了所測定的均值的標(biāo)準(zhǔn)差。“n.d.”意思在塊莖中不可能檢測到乙酰透明質(zhì)酸。至于沒有標(biāo)出標(biāo)準(zhǔn)差的植物，只測定了一個(gè)塊莖樣本的乙酰透明質(zhì)酸含量。
l)409 ES品系葉子的分析 測定了具有409 ES名字的植物品系的個(gè)體的葉子的乙酰透明質(zhì)酸含量。通過在每種情況下計(jì)算在4株不同的野生型植物和6株不同的365 ES74品系植物(分別是野生型(Solanum tuberosum cv.Désirée)和365 ES 74品系的無性后代)的葉子中的乙酰透明質(zhì)酸的量，計(jì)算具有野生型名字的植物和具有365 ES名字的植物的所述均值和標(biāo)準(zhǔn)差。得到了所選擇的植物的下列結(jié)果 表14獨(dú)立地選擇的409 ES品系轉(zhuǎn)基因植物的葉子所產(chǎn)生的乙酰透明質(zhì)酸的量(每克鮮重的乙酰透明質(zhì)酸μg數(shù))。第1列包含從中收獲葉子材料的植物的名稱(“野生型”指未轉(zhuǎn)化的植物；365 ES 74指表達(dá)乙酰透明質(zhì)酸合成酶并用作用植物表達(dá)載體IC 376-256轉(zhuǎn)化產(chǎn)生409 ES品系的起始材料的植物)。第2列顯示了對所討論的葉子所測定的乙酰透明質(zhì)酸量的均值。第3列顯示了所測定的均值的標(biāo)準(zhǔn)差?！皀.d.”意思在塊莖中沒有能檢測到的乙酰透明質(zhì)酸。至于沒有標(biāo)出標(biāo)準(zhǔn)差的植物，只測定了一個(gè)葉子樣本的乙酰透明質(zhì)酸含量。
m)關(guān)于鮮重和關(guān)于干重的乙酰透明質(zhì)酸含量的測定 在收獲所討論的植物的塊莖之前，從植物中移除395 ES和396 ES品系植物的個(gè)體葉子并在中間分開。在每種情況下在液氮中冰凍每一個(gè)體葉子的一半，冷凍干燥過夜相應(yīng)的另一半葉子。
用實(shí)驗(yàn)室振蕩珠磨機(jī)(MM200，Retsch，德國)(30HZ，30秒)中粉碎約0.3g冰凍的葉子材料或約0.02g冷凍干燥的葉子樣本。然后在每個(gè)個(gè)體的粉碎樣本中添加300μl水(去礦質(zhì)，電導(dǎo)率＝18MΩ)，然后用蝸旋攪拌器將其完全混合，然后通過離心(16000xg，5分鐘)從上清液中分離細(xì)胞碎片和不溶成分。移除上清液，用水(去礦質(zhì)，電導(dǎo)率＝18MΩ)使得每個(gè)樣品至500μl。用這種方法制備的樣品的等分試樣用于用一般方法第4項(xiàng)描述的方法測定乙酰透明質(zhì)酸的含量。用一般方法第5項(xiàng)給出的公式計(jì)算均值和標(biāo)準(zhǔn)差。得到了所選擇的植物的下列結(jié)果
表15獨(dú)立地選擇的395 ES和396 ES品系轉(zhuǎn)基因植物的葉子所產(chǎn)生的乙酰透明質(zhì)酸的量(每克鮮重的乙酰透明質(zhì)酸μg數(shù))。第1列命名了從中收獲葉子材料的植物的名稱。365 ES 13指表達(dá)乙酰透明質(zhì)酸合成酶并用作用植物表達(dá)載體IC 372-256轉(zhuǎn)化產(chǎn)生395 ES品系的起始材料的植物。365 ES 74指表達(dá)乙酰透明質(zhì)酸合成酶并用作用植物表達(dá)載體IC 372-256轉(zhuǎn)化產(chǎn)生396 ES品系的起始材料的植物。第2列示出了對所討論的植物的不同葉子所測定的乙酰透明質(zhì)酸量。第3列示出了植物不同葉子中測定的乙酰透明質(zhì)酸含量的均值。第4列示出了測定的均值的標(biāo)準(zhǔn)差。

表16獨(dú)立地選擇的395 ES和396 ES品系轉(zhuǎn)基因植物的葉子所產(chǎn)生的乙酰透明質(zhì)酸的量(每克干重的乙酰透明質(zhì)酸μg數(shù))。第1列命名了從中收獲葉子材料的植物的名稱。365 ES 13指表達(dá)乙酰透明質(zhì)酸合成酶并用作用植物表達(dá)載體IC 372-256轉(zhuǎn)化產(chǎn)生395 ES品系的起始材料的植物。365 ES 74指表達(dá)乙酰透明質(zhì)酸合成酶并用作用植物表達(dá)載體IC 372-256轉(zhuǎn)化產(chǎn)生396 ES品系的起始材料的植物。第2列標(biāo)記了對所討論的植物的不同葉子所測定的乙酰透明質(zhì)酸量。第3列標(biāo)記了植物不同葉子中測定的乙酰透明質(zhì)酸含量的均值。第4列標(biāo)記了測定的均值的標(biāo)準(zhǔn)差。
14、用包含編碼乙酰透明質(zhì)酸合成酶的核酸分子的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化番茄植物 用一般方法第8項(xiàng)給出的方法，用植物表達(dá)載體IC 341-222起始轉(zhuǎn)化番茄植物，該載體包含在馬鈴薯patatin基因B33啟動子(Rocha-Sosa等，1989，EMBO J.8，23-29)控制下的綠草履蟲小球藻病毒1HAS蛋白的編碼核酸序列。將所得到的用質(zhì)粒IC 341-222轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因番茄植物命名為367ES。
用一般方法第8項(xiàng)給出的方法用植物表達(dá)載體IC 341-222轉(zhuǎn)化367 ES25和367 ES 42品系番茄植物。將用質(zhì)粒IC 341-222轉(zhuǎn)化367ES 25品系所得到的番茄植物命名為399 ES。將用質(zhì)粒IC 341-222轉(zhuǎn)化367 ES 42品系所得到的番茄植物命名為400 ES。
然后用一般方法第8項(xiàng)給出的方法用植物表達(dá)載體IC 375-271轉(zhuǎn)化367 ES 25品系番茄植物。將用質(zhì)粒IC 375-271轉(zhuǎn)化367 ES 25品系所得到的轉(zhuǎn)基因番茄植物命名為405 ES。
15、分析用包含具有GFAT活性的蛋白和具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的編碼核酸序列的植物表達(dá)載體額外轉(zhuǎn)化的合成乙酰透明質(zhì)酸的轉(zhuǎn)基因番茄植物 a)399 ES和400 ES品系番茄植物的葉子 在每種情況下，從不同的所選擇的已在溫室土壤中培養(yǎng)的399 ES和400 ES品系番茄植物中收獲1片葉子并在液氮中冰凍。用在實(shí)施例11b)中所描述的對馬鈴薯植物葉子一樣的方法進(jìn)行進(jìn)一步處理并測定乙酰透明質(zhì)酸含量。得到以下結(jié)果 表17獨(dú)立地選擇的399 ES和400 ES品系轉(zhuǎn)基因植物的葉子所產(chǎn)生的乙酰透明質(zhì)酸的量(每克鮮重的乙酰透明質(zhì)酸μg數(shù))。第1列表示從中收獲葉子材料的植物的名稱。367 ES 25和367 ES 42指表達(dá)乙酰透明質(zhì)酸合成酶并分別用作用植物表達(dá)載體IC 372-256轉(zhuǎn)化產(chǎn)生399 ES和400ES品系的起始材料的不同植物。第2列標(biāo)記了在所討論植物的葉子中所測定的乙酰透明質(zhì)酸量的值。野生型指未轉(zhuǎn)化的植物。
b)399 ES和400 ES品系番茄植物的果實(shí) 在每種情況下，收獲不同的所選的已在溫室土壤中培養(yǎng)的399 ES和400 ES品系番茄植物的成熟的果實(shí)，粉碎、離心、并且在離心后過濾上清。用在實(shí)施例11b)中所描述的對馬鈴薯葉子一樣的方法進(jìn)一步處理濾出液并測定乙酰透明質(zhì)酸含量。得到了以下結(jié)果 表18獨(dú)立地選擇的399 ES和400 ES品系轉(zhuǎn)基因植物的成熟果實(shí)所產(chǎn)生的乙酰透明質(zhì)酸的量(每克鮮重的乙酰透明質(zhì)酸μg數(shù))。第1列表示從中收獲葉子材料的植物的名稱。367 ES 25-1和267 ES-2指367 ES 25植物的不同的克隆后代，以及367 ES 42-1和267 ES 42-2指367 ES 42植物的不同的克隆后代。第2列標(biāo)記了在所討論植物的果實(shí)中所測定的乙酰透明質(zhì)酸量的均值。為此，在每種情況下，測定了3個(gè)(399 ES-1,400 ES 3品系)，5個(gè)(367 ES-25-1,325 ES-2,367 ES 42-1,367 ES 42-2品系)或6個(gè)(399 ES-11品系)不同的所討論品系的果實(shí)中的乙酰透明質(zhì)酸含量。第3列標(biāo)出了所測定的均值的標(biāo)準(zhǔn)差。
c)405 ES品系番茄植物的果實(shí) 在每種情況下，收獲不同的所選的已在溫室土壤中培養(yǎng)的405 ES品系番茄植物的成熟的果實(shí)，粉碎、離心、并且在離心后過濾上清。用在實(shí)施例11b)中所描述的對馬鈴薯葉子一樣的方法進(jìn)一步處理濾出液并測定乙酰透明質(zhì)酸含量。得到了以下結(jié)果
表19獨(dú)立地選擇的405 ES品系轉(zhuǎn)基因植物的成熟果實(shí)所產(chǎn)生的乙酰透明質(zhì)酸的量(每克鮮重的乙酰透明質(zhì)酸μg數(shù))。第1列表示從中收獲葉子材料的植物的名稱。367 ES 25-8和367 ES 25-9指367 ES 25植物的不同的克隆后代。通過拉丁數(shù)字的擴(kuò)展表示各植物的不同果實(shí)。(“wt”表示未轉(zhuǎn)化的植物)。第2列標(biāo)記了在所討論植物的不同果實(shí)中所測定的乙酰透明質(zhì)酸量的均值。第3列標(biāo)記了所測定的均值的標(biāo)準(zhǔn)差。
16)結(jié)束語 當(dāng)測定植物的不同葉子的乙酰透明質(zhì)酸含量時(shí)，發(fā)現(xiàn)同一植物的較老的葉子比同一植物的較年輕的葉子含有更多的乙酰透明質(zhì)酸。因此，葉子中乙酰透明質(zhì)酸的含量看起來隨著葉子年齡的增長而增長，因此可以推測乙酰透明質(zhì)酸隨著時(shí)間而積累。這一現(xiàn)象可能可以解釋在相同品系的后代的獨(dú)立測定中發(fā)現(xiàn)的乙酰透明質(zhì)酸的不同量。
序列表
<110>拜爾作物科學(xué)股份公司
<120>用于產(chǎn)生乙酰透明質(zhì)酸的改良的方法和手段
<130>BCS 05-5010PCT
<150>EP05090277.4
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<150>EP06090053.7
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<210>1
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<212>DNA
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<222>(1)..(1707)
<300>
<308>PB42580
<309>1995-12-24
<313>(50903)..(52609)
<400>1
atg ggt aaa aat ata atc ata atg gtt tcg tgg tac acc atc ata act48
Met Gly Lys Asn Ile Ile Ile Met Val Ser Trp Tyr Thr Ile Ile Thr
1 5 10 15
tca aat cta atc gcg gtt gga gga gcc tct cta atc ttg gct ccg gca96
Ser Asn Leu Ile Ala Val Gly Gly Ala Ser Leu Ile Leu Ala Pro Ala
20 25 30
att act ggg tat gtt cta cat tgg aat att gct ctc tcg aca atc tgg144
Ile Thr Gly Tyr Val Leu His Trp Asn Ile Ala Leu Ser Thr Ile Trp
35 40 45
gga gta tca gct tat ggt att ttc gtt ttt ggg ttt ttc ctt gca caa192
Gly Val Ser Ala Tyr Gly Ile Phe Val Phe Gly Phe Phe Leu Ala Gln
50 55 60
gtt tta ttt tca gaa ctg aac agg aaa cgt ctt cgc aag tgg att tct240
Val Leu Phe Ser Glu Leu Asn Arg Lys Arg Leu Arg Lys Trp Ile Ser
65 70 75 80
ctc aga cct aag ggt tgg aat gat gtt cgt ttg gct gtg atc att gct288
Leu Arg Pro Lys Gly Trp Asn Asp Val Arg Leu Ala Val Ile Ile Ala
85 90 95
gga tat cgc gag gat cct tat atg ttc cag aag tgc ctc gag tct gta336
Gly Tyr Arg Glu Asp Pro Tyr Met Phe Gln Lys Cys Leu Glu Ser Val
100 105 110
cgt gac tct gat tat ggc aac gtt gcc cgt ctg att tgt gtg att gac384
Arg Asp Ser Asp Tyr Gly Asn Val Ala Arg Leu Ile Cys Val Ile Asp
115 120 125
ggt gat gag gac gat gat atg agg atg gct gcc gtt tac aag gcg atc432
Gly Asp Glu Asp Asp Asp Met Arg Met Ala Ala Val Tyr Lys Ala Ile
130 135 140
tac aat gat aat atc aag aag ccc gag ttt gtt ctg tgt gag tca gac480
Tyr Asn Asp Asn Ile Lys Lys Pro Glu Phe Val Leu Cys Glu Ser Asp
145 150 155 160
gac aag gaa ggt gaa cgc atc gac tct gat ttc tct cgc gac att tgt528
Asp Lys Glu Gly Glu Arg Ile Asp Ser Asp Phe Ser Arg Asp Ile Cys
165 170 175
gtc ctc cag cct cat cgt gga aaa cgg gag tgt ctt tat act ggg ttt576
Val Leu Gln Pro His Arg Gly Lys Arg Glu Cys Leu Tyr Thr Gly Phe
180 185 190
caa ctt gca aag atg gac ccc agt gtc aat gct gtc gtt ctg att gac624
Gln Leu Ala Lys Met Asp Pro Ser Val Asn Ala Val Val Leu Ile Asp
195 200 205
agc gat acc gtt ctc gag aag gat gct att ctg gaa gtt gta tac cca672
Ser Asp Thr Val Leu Glu Lys Asp Ala Ile Leu Glu Val Val Tyr Pro
210 215 220
ctt gca tgc gat ccc gag atc caa gcc gtt gca ggt gag tgt aag att720
Leu Ala Cys Asp Pro Glu Ile Gln Ala Val Ala Gly Glu Cys Lys Ile
225 230 235 240
tgg aac aca gac act ctt ttg agt ctt ctc gtc gct tgg cgg tac tat768
Trp Asn Thr Asp Thr Leu Leu Ser Leu Leu Val Ala Trp Arg Tyr Tyr
245 250 255
tct gcg ttt tgt gtg gag agg agt gcc cag tct ttt ttc agg act gtt816
Ser Ala Phe Cys Val Glu Arg Ser Ala Gln Ser Phe Phe Arg Thr Val
260 265 270
cag tgc gtt ggg ggg cca ctg ggt gcc tac aag att gat atc att aag864
Gln Cys Val Gly Gly Pro Leu Gly Ala Tyr Lys Ile Asp Ile Ile Lys
275 280 285
gag att aag gac ccc tgg att tcc cag cgc ttt ctt ggt cag aag tgt912
Glu Ile Lys Asp Pro Trp Ile Ser Gln Arg Phe Leu Gly Gln Lys Cys
290 295 300
act tac ggt gac gac cgc cgg cta acc aac gag atc ttg atg cgt ggt960
Thr Tyr Gly Asp Asp Arg Arg Leu Thr Asn Glu Ile Leu Met Arg Gly
305 310 315 320
aaa aag gtt gtg ttc act cca ttt gct gtt ggt tgg tct gac agt ccg1008
Lys Lys Val Val Phe Thr Pro Phe Ala Val Gly Trp Ser Asp Ser Pro
325 330 335
acc aat gtg ttt cgg tac atc gtt cag cag acc cgc tgg agt aag tcg1056
Thr Asn Val Phe Arg Tyr Ile Val Gln Gln Thr Arg Trp Ser Lys Ser
340 345 350
tgg tgc cgc gaa att tgg tac acc ctc ttc gcc gcg tgg aag cac ggt1104
Trp Cys Arg Glu Ile Trp Tyr Thr Leu Phe Ala Ala Trp Lys His Gly
355 360 365
ttg tct gga att tgg ctg gcc ttt gaa tgt ttg tat caa att aca tac1152
Leu Ser Gly Ile Trp Leu Ala Phe Glu Cys Leu Tyr Gln Ile Thr Tyr
370 375 380
ttc ttc ctc gtg att tac ctc ttt tct cgc cta gcc gtt gag gcc gac1200
Phe Phe Leu Val Ile Tyr Leu Phe Ser Arg Leu Ala Val Glu Ala Asp
385 390 395 400
cct cgc gcc cag aca gcc acg gtg att gtg agc acc acg gtt gca ttg1248
Pro Arg Ala Gln Thr Ala Thr Val Ile Val Ser Thr Thr Val Ala Leu
405 410 415
att aag tgt ggg tat ttt tca ttc cga gcc aag gat att cgg gcg ttt1296
Ile Lys Cys Gly Tyr Phe Ser Phe Arg Ala Lys Asp Ile Arg Ala Phe
420 425 430
tac ttt gtg ctt tat aca ttt gtt tac ttt ttc tgt atg att ccg gcc1344
Tyr Phe Val Leu Tyr Thr Phe Val Tyr Phe Phe Cys Met Ile Pro Ala
435 440 445
agg att act gca atg atg acg ctt tgg gac att ggc tgg ggt act cgc1392
Arg Ile Thr Ala Met Met Thr Leu Trp Asp Ile Gly Trp Gly Thr Arg
450 455 460
ggt gga aac gag aag cct tcc gtt ggc acc cgg gtc gct ctg tgg gca1440
Gly Gly Asn Glu Lys Pro Ser Val Gly Thr Arg Val Ala Leu Trp Ala
465 470 475 480
aag caa tat ctc att gca tat atg tgg tgg gcc gcg gtt gtt ggc gct1488
Lys Gln Tyr Leu Ile Ala Tyr Met Trp Trp Ala Ala Val Val Gly Ala
485 490 495
gga gtt tac agc atc gtc cat aac tgg atg ttc gat tgg aat tct ctt1536
Gly Val Tyr Ser Ile Val His Asn Trp Met Phe Asp Trp Asn Ser Leu
500 505 510
tct tat cgt ttt gct ttg gtt ggt att tgt tct tac att gtt ttt att1584
Ser Tyr Arg Phe Ala Leu Val Gly Ile Cys Ser Tyr Ile Val Phe Ile
515 520 525
gtt att gtg ctg gtg gtt tat ttc acc ggc aaa att acg act tgg aat1632
Val Ile Val Leu Val Val Tyr Phe Thr Gly Lys Ile Thr Thr Trp Asn
530 535 540
ttc acg aag ctt cag aag gag cta atc gag gat cgc gtt ctg tac gat1680
Phe Thr Lys Leu Gln Lys Glu Leu Ile Glu Asp Arg Val Leu Tyr Asp
545 550 555 560
gca act acc aat gct cag tct gtg tga1707
Ala Thr Thr Asn Ala Gln Ser Val
565
<210>2
<211>568
<212>PRT
<213>綠草履蟲小球藻病毒1
<400>2
Met Gly Lys Asn Ile Ile Ile Met Val Ser Trp Tyr Thr Ile Ile Thr
1 5 10 15
Ser Asn Leu Ile Ala Val Gly Gly Ala Ser Leu Ile Leu Ala Pro Ala
20 25 30
Ile Thr Gly Tyr Val Leu His Trp Asn Ile Ala Leu Ser Thr Ile Trp
35 40 45
Gly Val Ser Ala Tyr Gly Ile Phe Val Phe Gly Phe Phe Leu Ala Gln
50 55 60
Val Leu Phe Ser Glu Leu Asn Arg Lys Arg Leu Arg Lys Trp Ile Ser
65 70 75 80
Leu Arg Pro Lys Gly Trp Asn Asp Val Arg Leu Ala Val Ile Ile Ala
85 90 95
Gly Tyr Arg Glu Asp Pro Tyr Met Phe Gln Lys Cys Leu Glu Ser Val
100 105 110
Arg Asp Ser Asp Tyr Gly Asn Val Ala Arg Leu Ile Cys Val Ile Asp
115 120 125
Gly Asp Glu Asp Asp Asp Met Arg Met Ala Ala Val Tyr Lys Ala Ile
130 135 140
Tyr Asn Asp Asn Ile Lys Lys Pro Glu Phe Val Leu Cys Glu Ser Asp
145 150 155 160
Asp Lys Glu Gly Glu Arg Ile Asp Ser Asp Phe Ser Arg Asp Ile Cys
165 170 175
Val Leu Gln Pro His Arg Gly Lys Arg Glu Cys Leu Tyr Thr Gly Phe
180 185 190
Gln Leu Ala Lys Met Asp Pro Ser Val Asn Ala Val Val Leu Ile Asp
195 200 205
Ser Asp Thr Val Leu Glu Lys Asp Ala Ile Leu Glu Val Val Tyr Pro
210 215 220
Leu Ala Cys Asp Pro Glu Ile Gln Ala Val Ala Gly Glu Cys Lys Ile
225 230 235 240
Trp Asn Thr Asp Thr Leu Leu Ser Leu Leu Val Ala Trp Arg Tyr Tyr
245 250 255
Ser Ala Phe Cys Val Glu Arg Ser Ala Gln Ser Phe Phe Arg Thr Val
260 265 270
Gln Cys Val Gly Gly Pro Leu Gly Ala Tyr Lys Ile Asp Ile Ile Lys
275 280 285
Glu Ile Lys Asp Pro Trp Ile Ser Gln Arg Phe Leu Gly Gln Lys Cys
290 295 300
Thr Tyr Gly Asp Asp Arg Arg Leu Thr Asn Glu Ile Leu Met Arg Gly
305 310 315 320
Lys Lys Val Val Phe Thr Pro Phe Ala Val Gly Trp Ser Asp Ser Pro
325 330 335
Thr Asn Val Phe Arg Tyr Ile Val Gln Gln Thr Arg Trp Ser Lys Ser
340 345 350
Trp Cys Arg Glu Ile Trp Tyr Thr Leu Phe Ala Ala Trp Lys His Gly
355 360 365
Leu Ser Gly Ile Trp Leu Ala Phe Glu Cys Leu Tyr Gln Ile Thr Tyr
370 375 380
Phe Phe Leu Val Ile Tyr Leu Phe Ser Arg Leu Ala Val Glu Ala Asp
385 390 395 400
Pro Arg Ala Gln Thr Ala Thr Val Ile Val Ser Thr Thr Val Ala Leu
405 410 415
Ile Lys Cys Gly Tyr Phe Ser Phe Arg Ala Lys Asp Ile Arg Ala Phe
420 425 430
Tyr Phe Val Leu Tyr Thr Phe Val Tyr Phe Phe Cys Met Ile Pro Ala
435 440 445
Arg Ile Thr Ala Met Met Thr Leu Trp Asp Ile Gly Trp Gly Thr Arg
450 455 460
Gly Gly Asn Glu Lys Pro Ser Val Gly Thr Arg Val Ala Leu Trp Ala
465 470 475 480
Lys Gln Tyr Leu Ile Ala Tyr Met Trp Trp Ala Ala Val Val Gly Ala
485 490 495
Gly Val Tyr Ser Ile Val His Asn Trp Met Phe Asp Trp Asn Ser Leu
500 505 510
Ser Tyr Arg Phe Ala Leu Val Gly Ile Cys Ser Tyr Ile Val Phe Ile
515 520 525
Val Ile Val Leu Val Val Tyr Phe Thr Gly Lys Ile Thr Thr Trp Asn
530 535 540
Phe Thr Lys Leu Gln Lys Glu Leu Ile Glu Asp Arg Val Leu Tyr Asp
545 550 555 560
Ala Thr Thr Asn Ala Gln Ser Val
565
<210>3
<211>1707
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>編碼綠草履蟲小球藻病毒乙酰透明質(zhì)酸合成酶蛋白的合成序列
<400>3
atgggtaaga acattatcat tatggtgtcc tggtacacaa ttattacaag taatctcatc60
gcagttggtg gtgcatctct tattctcgct ccagctatca ctggatatgt tcttcactgg120
aacatcgccc tctcaactat ttggggagtt tccgcatatg gtatttttgt tttcgggttc180
tttttggctc aggttctgtt ctcagagctc aatcgtaaga gactcaggaa gtggattagc240
cttagaccaa aggggtggaa tgacgttcgt ctcgctgtca ttatcgctgg ctaccgtgaa300
gatccttaca tgtttcaaaa gtgcttggaa tcagttaggg atagtgatta tggcaacgtc360
gctagactga tctgtgtgat tgatggagat gaggacgacg atatgaggat ggcagctgtt420
tataaggcta tctataatga taacattaag aagcctgaat ttgttctttg cgagtctgat480
gacaaggaag gagaacggat tgattcagat ttctcacgtg atatctgcgt tctccaacct540
catcgtggga agcgtgaatg tctttataca ggtttccaac tcgccaaaat ggacccatca600
gtgaacgctg tggttcttat cgatagtgat actgtgctgg agaaagatgc tatcttggag660
gttgtttacc ctcttgcctg tgatcctgaa attcaagctg tggctggaga gtgcaagatc720
tggaacacag atactcttct ttctctgctt gtcgcatgga gatattactc cgcattctgt780
gtggagagga gcgctcaatc ctttttccgt accgttcaat gcgttggtgg tcctttggga840
gcttacaaaa ttgatatcat caaggagatt aaggacccat ggattagtca aaggtttctt900
ggtcagaagt gcacttatgg cgatgatcgt agattgacta acgaaatcct tatgaggggc960
aagaaagtcg tttttactcc atttgctgtc ggatggtctg attcacctac aaatgttttc1020
cgttatattg tgcaacaaac acgttggagt aagagctggt gtagggagat ctggtacact1080
ttgttcgctg cttggaagca cgggcttagc ggaatttggc ttgcttttga atgcctttac1140
cagattacat actttttctt ggtgatctat ttgttttcac gtcttgccgt cgaggctgac1200
cctagagcac agactgcaac tgtgattgtt tctactacag tcgcacttat taagtgtggc1260
tatttcagtt ttagagcaaa agatattaga gccttctatt ttgttttgta cacatttgtt1320
tatttctttt gcatgattcc agctcgtatt accgctatga tgaccttgtg ggacatcgga1380
tggggaacta gaggtggtaa cgaaaagcct tctgtgggaa caagggtggc cctttgggca1440
aaacaatatc tcatcgccta catgtggtgg gccgctgtcg ttggtgccgg agtgtactca1500
atcgttcata actggatgtt tgactggaac tctttgagct atcgtttcgc tcttgtgggt1560
atttgttctt acattgtttt catcgtgatt gtgctcgttg tgtatttcac tggtaaaatc1620
acaacctgga atttcactaa acttcaaaag gaattgattg aagacagggt tctgtatgat1680
gctactacca acgcccagtc agtttaa1707
<210>4
<211>1260
<212>DNA
<213>綠草履蟲小球藻病毒1
<220>
<221>CDS
<222>(62)..(1228)
<300>
<308>U42580.4
<309>2004-09-20
<313>(291749.)..(292918)
<400>4
atcaacgtga tttatatttt aaacaaagac cattcacatc tttagtactt aattaattat60
a atg tca cga atc gca gtc gtt ggt tgt ggt tac gtc gga acc gct tgt109
Met Ser Arg Ile Ala Val Val Gly Cys Gly Tyr Val Gly Thr Ala Cys
1 5 10 15
gca gta ctt ctt gct caa aaa aac gaa gtc atc gtg ctt gat att agc 157
Ala Val Leu Leu Ala Gln Lys Asn Glu Val Ile Val Leu Asp Ile Ser
20 25 30
gaa gac cgt gtt caa cta atc aag aac aag aag agt cca atc gag gac 205
Glu Asp Arg Val Gln Leu Ile Lys Asn Lys Lys Ser Pro Ile Glu Asp
35 40 45
aag gaa atc gaa gag ttt ctc gaa acg aaa gac ctg aac ctg acc gcg 253
Lys Glu Ile Glu Glu Phe Leu Glu Thr Lys Asp Leu Asn Leu Thr Ala
50 55 60
acg act gac aag gtt ctt gca tac gaa aac gcc gaa ttt gtc atc atc 301
Thr Thr Asp Lys Val Leu Ala Tyr Glu Asn Ala Glu Phe Val Ile Ile
65 70 75 80
gca acc ccg act gac tat gac gtg gtt act agg tat ttt aac acg aaa 349
Ala Thr Pro Thr Asp Tyr Asp Val Val Thr Arg Tyr Phe Asn Thr Lys
85 90 95
tct gtg gaa aac gtc att ggg gac gtg atc aaa aat aca cag acc cat 397
Ser Val Glu Asn Val Ile Gly Asp Val Ile Lys Asn Thr Gln Thr His
100 105 110
cca act atc gtg att aaa tct acc atc ccc att gga ttt gtt gat aag 445
Pro Thr Ile Val Ile Lys Ser Thr Ile Pro Ile Gly Phe Val Asp Lys
115 120 125
gtt cgt gag caa ttc gac tac caa aat atc att ttc tcc cca gaa ttt493
Val Arg Glu Gln Phe Asp Tyr Gln Asn Ile Ile Phe Ser Pro Glu Phe
130 135 140
ctg cgt gaa ggt aga gcc ttg tat gat aat ctc tac cca tcc cgt atc541
Leu Arg Glu Gly Arg Ala Leu Tyr Asp Asn Leu Tyr Pro Ser Arg Ile
145 150 155 160
atc gta gga gat gat tcc ccc att gcg ctt aag ttc gca aac ctt ctc589
Ile Val Gly Asp Asp Ser Pro Ile Ala Leu Lys Phe Ala Asn Leu Leu
165 170 175
gtt gaa ggt tct aaa act ccg ctt gcc cct gtc ctg acg atg gga act637
Val Glu Gly Ser Lys Thr Pro Leu Ala Pro Val Leu Thr Met Gly Thr
180 185 190
cgc gaa gcc gag gcc gtc aaa cta ttc tct aac acg tat ctt gca atg685
Arg Glu Ala Glu Ala Val Lys Leu Phe Ser Asn Thr Tyr Leu Ala Met
195 200 205
cga gtt gca tac ttc aac gaa cta gat aca ttc gca atg tct cac ggt733
Arg Val Ala Tyr Phe Asn Glu Leu Asp Thr Phe Ala Met Ser His Gly
210 215 220
atg aat gcg aaa gaa atc att gat ggt gtg act ctg gag cct cgc att781
Met Asn Ala Lys Glu Ile Ile Asp Gly Val Thr Leu Glu Pro Arg Ile
225 230 235 240
ggt cag ggg tac tca aac cct tcg ttc ggt tat gga gct tat tgc ttt829
Gly Gln Gly Tyr Ser Asn Pro Ser Phe Gly Tyr Gly Ala Tyr Cys Phe
245 250 255
cca aag gat acg aag caa ctg ctg gct aat ttc gag gga gtg cct caa877
Pro Lys Asp Thr Lys Gln Leu Leu Ala Asn Phe Glu Gly Val Pro Gln
260265 270
gat atc atc gga gca att gta gaa tca aat gag act cgc aag gaa gtg925
Asp Ile Ile Gly Ala Ile Val Glu Ser Asn Glu Thr Arg Lys Glu Val
275 280 285
att gtg agt gaa gta gaa aat cgt ttc ccc acg act gtt ggt gtg tat973
Ile Val Ser Glu Val Glu Asn Arg Phe Pro Thr Thr Val Gly Val Tyr
290 295 300
aag ctc gcc gct aaa gcg ggt tct gat aat ttt cgg agt tct gca att1021
Lys Leu Ala Ala Lys Ala Gly Ser Asp Asn Phe Arg Ser Ser Ala Ile
305 310 315 320
gta gac ata atg gag cga ctt gca aac aag ggt tat cac att aag att1069
Val Asp Ile Met Glu Arg Leu Ala Asn Lys Gly Tyr His Ile Lys Ile
325 330 335
ttc gaa cca act gtg gaa caa ttc gaa aac ttt gaa gtt gat aac aac1117
Phe Glu Pro Thr Val Glu Gln Phe Glu Asn Phe Glu Val Asp Asn Asn
340 345 350
ctg aca aca ttt gcg act gag agc gat gta att atc gca aac aga gtt1165
Leu Thr Thr Phe Ala Thr Glu Ser Asp Val Ile Ile Ala Asn Arg Val
355 360 365
ccc gtt gaa cat cgc att ctc ttt ggt aaa aaa tta atc aca cgt gat1213
Pro Val Glu His Arg Ile Leu Phe Gly Lys Lys Leu Ile Thr Arg Asp
370 375 380
gta tat ggc gat aac taaaatgttt tcaatatgat gttgttaatg at1260
Val Tyr Gly Asp Asn
385
<210>5
<211>389
<212>PRT
<213>綠草履蟲小球藻病毒1
<400>5
Met Ser Arg Ile Ala Val Val Gly Cys Gly Tyr Val Gly Thr Ala Cys
1 5 10 15
Ala Val Leu Leu Ala Gln Lys Asn Glu Val Ile Val Leu Asp Ile Ser
20 25 30
Glu Asp Arg Val Gln Leu Ile Lys Asn Lys Lys Ser Pro Ile Glu Asp
35 40 45
Lys Glu Ile Glu Glu Phe Leu Glu Thr Lys Asp Leu Asn Leu Thr Ala
50 55 60
Thr Thr Asp Lys Val Leu Ala Tyr Glu Asn Ala Glu Phe Val Ile Ile
65 70 75 80
Ala Thr Pro Thr Asp Tyr Asp Val Val Thr Arg Tyr Phe Asn Thr Lys
85 90 95
Ser Val Glu Asn Val Ile Gly Asp Val Ile Lys Asn Thr Gln Thr His
100 105 110
Pro Thr Ile Val Ile Lys Ser Thr Ile Pro Ile Gly Phe Val Asp Lys
115 120 125
Val Arg Glu Gln Phe Asp Tyr Gln Asn Ile Ile Phe Ser Pro Glu Phe
130 135 140
Leu Arg Glu Gly Arg Ala Leu Tyr Asp Asn Leu Tyr Pro Ser Arg Ile
145 150 155 160
Ile Val Gly Asp Asp Ser Pro Ile Ala Leu Lys Phe Ala Asn Leu Leu
165 170 175
Val Glu Gly Ser Lys Thr Pro Leu Ala Pro Val Leu Thr Met Gly Thr
180 185 190
Arg Glu Ala Glu Ala Val Lys Leu Phe Ser Asn Thr Tyr Leu Ala Met
195 200 205
Arg Val Ala Tyr Phe Asn Glu Leu Asp Thr Phe Ala Met Ser His Gly
210 215 220
Met Asn Ala Lys Glu Ile Ile Asp Gly Val Thr Leu Glu Pro Arg Ile
225 230 235 240
Gly Gln Gly Tyr Ser Asn Pro Ser Phe Gly Tyr Gly Ala Tyr Cys Phe
245 250 255
Pro Lys Asp Thr Lys Gln Leu Leu Ala Asn Phe Glu Gly Val Pro Gln
260 265 270
Asp Ile Ile Gly Ala Ile Val Glu Ser Asn Glu Thr Arg Lys Glu Val
275 280 285
Ile Val Ser Glu Val Glu Asn Arg Phe Pro Thr Thr Val Gly Val Tyr
290 295 300
Lys Leu Ala Ala Lys Ala Gly Ser Asp Asn Phe Arg Ser Ser Ala Ile
305 310 315 320
Val Asp Ile Met Glu Arg Leu Ala Asn Lys Gly Tyr His Ile Lys Ile
325 330 335
Phe Glu Pro Thr Val Glu Gln Phe Glu Asn Phe Glu Val Asp Asn Asn
340 345 350
Leu Thr Thr Phe Ala Thr Glu Ser Asp Val Ile Ile Ala Asn Arg Val
355 360 365
Pro Val Glu His Arg Ile Leu Phe Gly Lys Lys Leu Ile Thr Arg Asp
370 375 380
Val Tyr Gly Asp Asn
385
<210>6
<211>1170
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>編碼具有UDP-Glc-DH活性的綠草履蟲小球藻病毒蛋白的合成的序列
<400>6
atgtctcgca tagctgttgt aggatgtggc tatgtgggaa ctgcatgtgc ggttctactt 60
gctcaaaaga acgaagttat tgtgcttgat attagtgaag accgtgttca acttattaag 120
aacaagaagt ctcctattga ggataaggaa atcgaagagt tcttggaaac aaaggatctt 180
aatcttactg cgactacaga taaggttctt gcctacgaga acgctgagtt tgtgataatc 240
gctacaccaa ccgattacga cgttgtgact cgatatttca ataccaaatc cgtggaaaac 300
gttataggag atgttatcaa gaacactcaa acccacccta ctatcgtcat caagtccaca 360
attcccatcg gtttcgttga taaggtcaga gagcagtttg attatcaaaa cattatcttc 420
tcacctgagt tcttaaggga gggtcgtgct ctctacgata atttgtatcc gtcccgtatt 480
atcgttggcg acgattctcc tatcgctctc aagttcgcaa atctcttagt tgagggtagt 540
aagacccctt tggctcctgt tttgacaatg ggaaccagag aagcagaagc tgtcaagcta 600
ttctctaata cctaccttgc catgagggta gcatacttta acgaacttga tacatttgct 660
atgtcgcatg gtatgaatgc caaggagatt atagatggtg tcactttaga gcccaggatc 720
ggtcaaggat attctaaccc atcattcggc tatggagctt actgctttcc taaggacact 780
aagcagttgc tggcaaactt cgagggagtt cctcaagaca tcataggcgc tattgtggag 840
tcaaacgaaa caaggaaaga ggtgatagtt agtgaggtag agaatcgttt cccaacgaca 900
gtcggtgttt acaaactggc agctaaagct ggtagcgata acttcaggtc aagtgctatt 960
gtcgacatca tggaacgcct ggctaacaaa ggttaccaca ttaagatctt tgagccaact 1020
gtagagcagt tcgaaaattt cgaagttgac aataacttga caacgtttgc tactgagtca 1080
gacgttatta tcgcaaatcg tgtccctgtg gaacatagaa tcctatttgg aaagaagctc 1140
attaccagag atgtttacgg tgataattaa 1170
<210>7
<211>2298
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<220>
<221>CDS
<222>(150)..(2192)
<220>
<221>突變
<222>(1060)..(1060)
<223>插入質(zhì)粒IC 370-256中的序列含有在位置1060處由G到A的交換
<220>
<221>等位基因
<222>(1190)..(1190)
<223>插入質(zhì)粒IC 365-256中的序列含有在位置1190處由T到C的堿基交換
<220>
<221>突變
<222>(1245)..(1245)
<223>插入質(zhì)粒IC 370-256中的序列含有在位置1245處由T到C的交換
<220>
<221>等位基因
<222>(2027)..(2027)
<223>插入質(zhì)粒IC 365-256中的序列含有在位置2027處由G到A的堿基交換
<300>
<308>BC050762.1
<309>2005-03-08
<313>(150)..(2195)
<400>7
gagagcgaag cgagcgctga gtcggactgt cgggtctgag ctgtcgcatc ccagagtcct 60
ctcattgcca ccaccccggc ccgagctcac cctcgcttct gaagctctcc gcgcgcccga 120
cagctcagcc ctcgcccgtg accaacatc atg tgc ggt ata ttt gct tat tta173
Met Cys Gly Ile Phe Ala Tyr Leu
1 5
aat tac cat gtt cct cga aca aga cga gaa atc ttg gag aca cta atc221
Asn Tyr His Val Pro Arg Thr Arg Arg Glu Ile Leu Glu Thr Leu Ile
10 15 20
aaa ggc ctt cag aga ctg gaa tac aga gga tat gat tct gct ggt gtg269
Lys Gly Leu Gln Arg Leu Glu Tyr Arg Gly Tyr Asp Ser Ala Gly Val
25 30 35 40
gga ctt gac gga ggc aat gac aaa gac tgg gaa gcc aac gcc tgc aaa317
Gly Leu Asp Gly Gly Asn Asp Lys Asp Trp Glu Ala Asn Ala Cys Lys
45 50 55
atc cag ctc att aag aag aaa gga aaa gtt aag gca ctg gat gaa gaa365
Ile Gln Leu Ile Lys Lys Lys Gly Lys Val Lys Ala Leu Asp Glu Glu
60 65 70
gtt cac aaa caa caa gat atg gac ttg gat ata gaa ttt gat gtg cat413
Val His Lys Gln Gln Asp Met Asp Leu Asp Ile Glu Phe Asp Val His
75 80 85
ctt gga ata gct cat acc cgt tgg gcg aca cat gga gaa ccc aat cct461
Leu Gly Ile Ala His Thr Arg Trp Ala Thr His Gly Glu Pro Asn Pro
90 95 100
gtc aat agt cac ccc cag cgc tct gat aaa aat aat gaa ttc att gtt509
Val Asn Ser His Pro Gln Arg Ser Asp Lys Asn Asn Glu Phe Ile Val
105 110 115 120
att cat aat gga atc atc acc aac tac aaa gac ttg aaa aag ttt ctg557
Ile His Asn Gly Ile Ile Thr Asn Tyr Lys Asp Leu Lys Lys Phe Leu
125 130 135
gaa agc aaa ggc tat gac ttt gaa tct gaa aca gac aca gaa acc att605
Glu Ser Lys Gly Tyr Asp Phe Glu Ser Glu Thr Asp Thr Glu Thr Ile
140 145 150
gcc aag ctc gtc aag tac atg tat gac aac tgg gag agc cag gac gtc653
Ala Lys Leu Val Lys Tyr Met Tyr Asp Asn Trp Glu Ser Gln Asp Val
155 160 165
agt ttt acc acc ttg gtg gag aga gtt atc caa caa ttg gaa ggc gcc701
Ser Phe Thr Thr Leu Val Glu Arg Val Ile Gln Gln Leu Glu Gly Ala
170 175 180
ttt gct ctt gtg ttt aaa agt gtc cat ttt ccc ggg caa gca gtt ggc749
Phe Ala Leu Val Phe Lys Ser Val His Phe Pro Gly Gln Ala Val Gly
185 190 195 200
aca agg cga ggt agc cct ctc ttg att ggt gtg cgg agt gaa cat aag797
Thr Arg Arg Gly Ser Pro Leu Leu Ile Gly Val Arg Ser Glu His Lys
205 210 215
ctt tct aca gat cac att ccg att ctg tac aga aca ggc aaa gac aag845
Leu Ser Thr Asp His Ile Pro Ile Leu Tyr Arg Thr Gly Lys Asp Lys
220 225 230
aaa gga agc tgc ggt ctt tcc cgt gtg gac agc acg aca tgc ctg ttc893
Lys Gly Ser Cys Gly Leu Ser Arg Val Asp Ser Thr Thr Cys Leu Phe
235 240 245
cct gtt gag gaa aag gca gtt gaa tat tac ttt gct tct gat gca agt941
Pro Val Glu Glu Lys Ala Val Glu Tyr Tyr Phe Ala Ser Asp Ala Ser
250 255 260
gcc gtg ata gag cac acc aat cgt gtc atc ttt ctg gaa gat gat gat989
Ala Val Ile Glu His Thr Asn Arg Val Ile Phe Leu Glu Asp Asp Asp
265 270 275 280
gtt gca gca gtg gtg gat ggc cgt ctc tct atc cac cga att aaa cga1037
Val Ala Ala Val Val Asp Gly Arg Leu Ser Ile His Arg Ile Lys Arg
285 290 295
act gca gga gac cat cct ggc cga gct gtg caa act ctc cag atg gag1085
Thr Ala Gly Asp His Pro Gly Arg Ala Val Gln Thr Leu Gln Met Glu
300 305 310
ctc cag cag atc atg aag ggc aac ttt agt tca ttt atg cag aag gaa1133
Leu Gln Gln Ile Met Lys Gly Asn Phe Ser Ser Phe Met Gln Lys Glu
315 320 325
att ttt gag cag cca gaa tct gtt gtg aac aca atg aga gga aga gtc1181
Ile Phe Glu Gln Pro Glu Ser Val Val Asn Thr Met Arg Gly Arg Val
330 335 340
aat ttt gat gac tac act gtg aat ttg gga ggt ttg aaa gat cac att1229
Asn Phe Asp Asp Tyr Thr Val Asn Leu Gly Gly Leu Lys Asp His Ile
345 350 355 360
aag gag atc cag cgg tgt cgg cgg ttg att ctt att gct tgt ggc aca1277
Lys Glu Ile Gln Arg Cys Arg Arg Leu Ile Leu Ile Ala Cys Gly Thr
365 370 375
agt tac cac gct ggt gtg gca acc cgt cag gtc ctg gag gag ctg acc1325
Ser Tyr His Ala Gly Val Ala Thr Arg Gln Val Leu Glu Glu Leu Thr
380 385 390
gag ctg ccc gtg atg gtg gag ctt gcc agt gac ttc ttg gat aga aac1373
Glu Leu Pro Val Met Val Glu Leu Ala Ser Asp Phe Leu Asp Arg Asn
395 400 405
act cca gtc ttt cga gat gat gtt tgc ttt ttc att agt caa tca ggc1421
Thr Pro Val Phe Arg Asp Asp Val Cys Phe Phe Ile Ser Gln Ser Gly
410 415 420
gag aca gct gac acc ctg atg gga ctt cgt tac tgt aag gag aga gga1469
Glu Thr Ala Asp Thr Leu Met Gly Leu Arg Tyr Cys Lys Glu Arg Gly
425 430 435 440
gcc tta act gtg ggg atc aca aat aca gtc ggc agt tct ata tca agg1517
Ala Leu Thr Val Gly Ile Thr Asn Thr Val Gly Ser Ser Ile Ser Arg
445 450 455
gag aca gat tgc ggg gtt cat att aat gct ggt cct gag att ggc gtg1565
Glu Thr Asp Cys Gly Val His Ile Asn Ala Gly Pro Glu Ile Gly Val
460 465 470
gcc agt aca aag gca tac acc agc cag ttt gtg tcc ctc gtg atg ttt1613
Ala Ser Thr Lys Ala Tyr Thr Ser Gln Phe Val Ser Leu Val Met Phe
475 480 485
gct ctc atg atg tgt gat gac agg atc tcc atg caa gag aga cgc aaa1661
Ala Leu Met Met Cys Asp Asp Arg Ile Ser Met Gln Glu Arg Arg Lys
490 495 500
gag atc atg ctc gga ctg aag cga ctg ccg gac ttg att aag gaa gtg1709
Glu Ile Met Leu Gly Leu Lys Arg Leu Pro Asp Leu Ile Lys Glu Val
505 510 515 520
ctg agc atg gat gat gaa atc cag aag ctg gcg acg gag ctt tac cac1757
Leu Ser Met Asp Asp Glu Ile Gln Lys Leu Ala Thr Glu Leu Tyr His
525 530 535
cag aag tcg gtc ctg ata atg ggg cgg ggc tac cat tat gct aca tgc1805
Gln Lys Ser Val Leu Ile Met Gly Arg Gly Tyr His Tyr Ala Thr Cys
540 545 550
ctt gaa ggg gct ctg aaa atc aag gag att act tat atg cat tcg gaa1853
Leu Glu Gly Ala Leu Lys Ile Lys Glu Ile Thr Tyr Met His Ser Glu
555 560 565
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Lys Leu Met Pro Val Ile Met Ile Ile Met Arg Asp His Thr Tyr Ala
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435 440 445
ctg tct cag gac aaa cgc att gaa gcg ctg gca gaa gat ttc tct gac1392
Leu Ser Gln Asp Lys Arg Ile Glu Ala Leu Ala Glu Asp Phe Ser Asp
450 455 460
aaa cat cac gcg ctg ttc ctg ggc cgt ggc gat cag tac cca atc gcg1440
Lys His His Ala Leu Phe Leu Gly Arg Gly Asp Gln Tyr Pro Ile Ala
465 470 475 480
ctg gaa ggc gca ttg aag ttg aaa gag atc tct tac att cac gct gaa1488
Leu Glu Gly Ala Leu Lys Leu Lys Glu Ile Ser Tyr Ile His Ala Glu
485 490 495
gcc tac gct gct ggc gaa ctg aaa cac ggt ccg ctg gcg cta att gat1536
Ala Tyr Ala Ala Gly Glu Leu Lys His Gly Pro Leu Ala Leu Ile Asp
500 505 510
gcc gat atg ccg gtt att gtt gtt gca ccg aac aac gaa ttg ctg gaa1584
Ala Asp Met Pro Val Ile Val Val Ala Pro Asn Asn Glu Leu Leu Glu
515 520 525
aaa ctg aaa tcc aac att gaa gaa gtt cgc gcg cgt ggc ggt cag ttg1632
Lys Leu Lys Ser Asn Ile Glu Glu Val Arg Ala Arg Gly Gly Gln Leu
530 535 540
tat gtc ttc gcc gat cag gat gcg ggt ttt gta agt agc gat aac atg1680
Tyr Val Phe Ala Asp Gln Asp Ala Gly Phe Val Ser Ser Asp Asn Met
545 550 555 560
cac atc atc gag atg ccg cat gtg gaa gag gtg att gca ccg atc ttc1728
His Ile Ile Glu Met Pro His Val Glu Glu Val Ile Ala Pro Ile Phe
565 570 575
tac acc gtt ccg ctg cag ctg ctg gct tac cat gtc gcg ctg atc aaa1776
Tyr Thr Val Pro Leu Gln Leu Leu Ala Tyr His Val Ala Leu Ile Lys
580 585 590
ggc acc gac gtt gac cag ccg cgt aac ctg gca aaa tcg gtt acg gtt1824
Gly Thr Asp Val Asp Gln Pro Arg Asn Leu Ala Lys Ser Val Thr Val
595 600 605
gag taa1830
Glu
<210>12
<211>609
<212>PRT
<213>大腸桿菌
<400>12
Met Cys Gly Ile Val Gly Ala Ile Ala Gln Arg Asp Val Ala Glu Ile
1 5 10 15
Leu Leu Glu Gly Leu Arg Arg Leu Glu Tyr Arg Gly Tyr Asp Ser Ala
20 25 30
Gly Leu Ala Val Val Asp Ala Glu Gly His Met Thr Arg Leu Arg Arg
35 40 45
Leu Gly Lys Val Gln Met Leu Ala Gln Ala Ala Glu Glu His Pro Leu
50 55 60
His Gly Gly Thr Gly Ile Ala His Thr Arg Trp Ala Thr His Gly Glu
65 70 75 80
Pro Ser Glu Val Asn Ala His Pro His Val Ser Glu His Ile Val Val
85 90 95
Val His Asn Gly Ile Ile Glu Asn His Glu Pro Leu Arg Glu Glu Leu
100 105 110
Lys Ala Arg Gly Tyr Thr Phe Val Ser Glu Thr Asp Thr Glu Val Ile
115 120 125
Ala His Leu Val Asn Trp Glu Leu Lys Gln Gly Gly Thr Leu Arg Glu
130 135 140
Ala Val Leu Arg Ala Ile Pro Gln Leu Arg Gly Ala Tyr Gly Thr Val
145 150 155 160
Ile Met Asp Ser Arg His Pro Asp Thr Leu Leu Ala Ala Arg Ser Gly
165 170 175
Ser Pro Leu Val Ile Gly Leu Gly Met Gly Glu Asn Phe Ile Ala Ser
180 185 190
Asp Gln Leu Ala Leu Leu Pro Val Thr Arg Arg Phe Ile Phe Leu Glu
195 200 205
Glu Gly Asp Ile Ala Glu Ile Thr Arg Arg Ser Val Asn Ile Phe Asp
210 215 220
Lys Thr Gly Ala Glu Val Lys Arg Gln Asp Ile Glu Ser Asn Leu Gln
225 230 235 240
Tyr Asp Ala Gly Asp Lys Gly Ile Tyr Arg His Tyr Met Gln Lys Glu
245 250 255
Ile Tyr Glu Gln Pro Asn Ala Ile Lys Asn Thr Leu Thr Gly Arg Ile
260 265 270
Ser His Gly Gln Val Asp Leu Ser Glu Leu Gly Pro Asn Ala Asp Glu
275 280 285
Leu Leu Ser Lys Val Glu His Ile Gln Ile Leu Ala Cys Gly Thr Ser
290 295 300
Tyr Asn Ser Gly Met Val Ser Arg Tyr Trp Phe Glu Ser Leu Ala Gly
305 310 315 320
Ile Pro Cys Asp Val Glu Ile Ala Ser Glu Phe Arg Tyr Arg Lys Ser
325 330 335
Ala Val Arg Arg Asn Ser Leu Met Ile Thr Leu Ser Gln Ser Gly Glu
340 345 350
Thr Ala Asp Thr Leu Ala Gly Leu Arg Leu Ser Lys Glu Leu Gly Tyr
355 360 365
Leu Gly Ser Leu Ala Ile Cys Asn Val Pro Gly Ser Ser Leu Val Arg
370 375 380
Glu Ser Asp Leu Ala Leu Met Thr Asn Ala Gly Thr Glu Ile Gly Val
385 390 395 400
Ala Ser Thr Lys Ala Phe Thr Thr Gln Leu Thr Val Leu Leu Met Leu
405 410 415
Val Ala Lys Leu Ser Arg Leu Lys Gly Leu Asp Ala Ser Ile Glu His
420 425 430
Asp Ile Val His Gly Leu Gln Ala Leu Pro Ser Arg Ile Glu Gln Met
435 440 445
Leu Ser Gln Asp Lys Arg Ile Glu Ala Leu Ala Glu Asp Phe Ser Asp
450 455 460
Lys His His Ala Leu Phe Leu Gly Arg Gly Asp Gln Tyr Pro Ile Ala
465 470 475 480
Leu Glu Gly Ala Leu Lys Leu Lys Glu Ile Ser Tyr Ile His Ala Glu
485 490 495
Ala Tyr Ala Ala Gly Glu Leu Lys His Gly Pro Leu Ala Leu Ile Asp
500 505 510
Ala Asp Met Pro Val Ile Val Val Ala Pro Asn Asn Glu Leu Leu Glu
515 520 525
Lys Leu Lys Ser Asn Ile Glu Glu Val Arg Ala Arg Gly Gly Gln Leu
530 535 540
Tyr Val Phe Ala Asp Gln Asp Ala Gly Phe Val Ser Ser Asp Asn Met
545 550 555 560
His Ile Ile Glu Met Pro His Val Glu Glu Val Ile Ala Pro Ile Phe
565 570 575
Tyr Thr Val Pro Leu Gln Leu Leu Ala Tyr His Val Ala Leu Ile Lys
580 585 590
Gly Thr Asp Val Asp Gln Pro Arg Asn Leu Ala Lys Ser Val Thr Val
595 600 605
Glu
<210>13
<211>1830
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>編碼具有GFAT活性的大腸桿菌蛋白的合成的序列
<400>13
atgtgcggaa ttgttggtgc tatcgcccaa agagacgttg ctgagatttt gttagagggt60
ctgcgaaggc tagagtatag aggatatgac tccgctggtc tggctgtcgt tgatgctgag120
ggtcatatga caaggctaag aaggttagga aaggttcaga tgcttgctca ggcagctgag180
gaacatccat tgcatggagg tactggtatt gcacatacca ggtgggctac tcatggggag240
ccatcagaag ttaatgctca tccacatgtg agtgagcata tcgttgtagt tcacaatggg300
ataattgaaa accacgaacc attgagggaa gagttaaagg caagaggata tacttttgtg360
agtgagactg acactgaggt tattgcacat ttagtgaact gggaactcaa acaggggggc420
acattgcgtg aggctgtgtt aagagctatt cctcaactta gaggtgcata cggtactgtt480
attatggatt caagacaccc agatactctc cttgcagcta gatcaggtag tcccttggtc540
ataggacttg gaatgggtga aaattttatc gctagcgacc aattggcctt attgccagtt600
acaagacgat ttattttcct tgaagagggc gatattgctg agattactag aaggtctgtg660
aacatctttg ataagactgg cgctgaggtt aaacgtcagg atatcgagtc taaccttcaa720
tacgatgctg gtgataaagg aatttacagg cattatatgc aaaaggaaat ttatgaacaa780
ccaaatgcta tcaaaaacac acttactggc cgtatttctc atggacaggt cgatttaagc840
gagcttggtc ctaatgcaga cgaactgcta tcaaaagttg agcacataca gatactggca900
tgcggaacta gttataattc aggaatggtc tctagatact ggttcgaaag cttggcaggt960
ataccttgtg atgtagagat cgcttctgag tttaggtata gaaagtctgc tgtgcgtaga1020
aattcattaa tgattacatt atctcaatcc ggagaaacag cagatacact ggctggattg 1080
aggctttcta aggaactcgg atatctgggt tcacttgcta tttgtaatgt accaggttcc1140
tcattggttc gtgaatcaga tctagcactt atgacaaatg caggaactga aataggtgtg1200
gcaagtacca aggctttcac aacccaactg accgtacttt taatgttggt agcaaaactc1260
agtcgattaa aggggctaga tgcatctatc gaacatgata ttgttcacgg gcttcaagct1320
ctcccttcaa gaattgaaca aatgctttca caagataaga gaatagaggc attggctgaa1380
gatttttccg acaaacatca cgcattgttt cttggacgtg gcgatcaata tccaattgca1440
ttggaaggag ctttgaagtt gaaagaaata agttacattc acgcagaagc atatgcagct1500
ggagaactca agcatggtcc tttggcactc atcgacgctg acatgcccgt gatcgtagtg1560
gctcctaata acgaactgct cgaaaagctt aaatcaaata tcgaagaggt tcgagctaga1620
ggaggtcagc tttacgtttt cgctgaacaa gatgctggat tcgtgtcaag cgataatatg1680
catataattg aaatgcctca cgttgaagaa gtgattgcac ctatatttta tacagtccca1740
ttgcaacttc tagcttacca tgttgcactt attaaaggaa ctgatgttga tcagcctaga1800
aacctagcaa aatctgtaac agtcgaataa 1830
<210>14
<211>48
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>14
tcgacaggcc tggatcctta attaaactag tctcgaggag ctcggtac 48
<210>15
<211>40
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>15
cgagctcctc gagactagtt taattaagga tccaggcctg 40
權(quán)利要求
1. 具有穩(wěn)定整合入其基因組的編碼乙酰透明質(zhì)酸合成酶的核酸分子的經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞，其中所述植物細(xì)胞與相應(yīng)的沒有經(jīng)遺傳修飾的野生型植物細(xì)胞相比較，額外地具有增加的具有谷氨酰胺果糖6-磷酸酰胺轉(zhuǎn)移酶(GFAT)活性的蛋白的活性和增加的具有UDP-葡萄糖脫氫酶(UDP-Glc-DH)活性的蛋白的活性。
2. 權(quán)利要求1所述的經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞，其具有穩(wěn)定地整合入其基因組的一個(gè)外源核酸分子或穩(wěn)定地整合入其基因組的多個(gè)外源核酸分子，其中，與相應(yīng)的沒有經(jīng)遺傳修飾的野生型植物細(xì)胞相比較，所述的一個(gè)外源核酸分子或所述的多個(gè)外源核酸分子增加了具有谷氨酰胺果糖6-磷酸酰胺轉(zhuǎn)移酶(GFAT)活性的蛋白的活性和增加了具有UDP-葡萄糖脫氫酶(UDP-Glc-DH)活性的蛋白的活性。
3. 權(quán)利要求2所述的經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞，其中第一外源核酸分子編碼具有谷氨酰胺果糖6-磷酸酰胺轉(zhuǎn)移酶(GFAT)活性的蛋白且第二外源核酸分子編碼具有UDP-葡萄糖脫氫酶(UDP-Glc-DH)活性的蛋白。
4. 權(quán)利要求1、2或3任一項(xiàng)所述的經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞，其與具有乙酰透明質(zhì)酸合成酶的活性但沒有增加的谷氨酰胺果糖6-磷酸酰胺轉(zhuǎn)移酶(GFAT)的活性和沒有增加的UDP-葡萄糖脫氫酶活性的植物細(xì)胞相比較，合成增加的乙酰透明質(zhì)酸的量。
5. 包含權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞的植物。
6. 權(quán)利要求5所述的植物的繁殖材料，其包含權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞。
7. 權(quán)利要求5所述的植物的可收獲的植物部分，其包含權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞。
8. 制備合成乙酰透明質(zhì)酸的植物的方法，其包括
a)遺傳修飾植物細(xì)胞，其中遺傳修飾包括如下步驟i至iii
i)將編碼乙酰透明質(zhì)酸合成酶的外源核酸分子引入植物細(xì)胞
ii)將這樣的遺傳修飾引入植物細(xì)胞，該遺傳修飾導(dǎo)致了與相應(yīng)的沒有經(jīng)遺傳修飾的野生型植物細(xì)胞相比較，具有谷氨酰胺果糖6-磷酸酰胺轉(zhuǎn)移酶(GFAT)活性的蛋白的活性增加；
iii)將這樣的遺傳修飾引入植物細(xì)胞，該遺傳修飾導(dǎo)致與相應(yīng)的沒有經(jīng)遺傳修飾的野生型植物細(xì)胞相比較，具有谷氨酰胺果糖6-磷酸UDP-葡萄糖脫氫酶活性的蛋白的活性增加；
其中步驟i至iii可以以任何順序各自實(shí)施，或可以同時(shí)實(shí)施步驟i至iii的任何組合；
b)從步驟a)的植物細(xì)胞再生植物；和
c)根據(jù)需要，用根據(jù)步驟b)的植物產(chǎn)生進(jìn)一步的植物，
其中，根據(jù)需要，從根據(jù)步驟b)或c)的植物分離植物細(xì)胞并重復(fù)步驟a)至c)的方法直到產(chǎn)生這樣的植物，其具有編碼乙酰透明質(zhì)酸合成酶的外源核酸分子，并且與相應(yīng)的沒有經(jīng)遺傳修飾的野生型植物細(xì)胞相比較，具有增加的具有谷氨酰胺果糖6-磷酸酰胺轉(zhuǎn)移酶(GFAT)活性的蛋白的活性，以及與相應(yīng)的沒有經(jīng)遺傳修飾的野生型植物細(xì)胞相比較，具有增加的具有谷氨酰胺果糖6-磷酸UDP-葡萄糖脫氫酶活性的蛋白的活性。
9. 制備乙酰透明質(zhì)酸的方法，其包括從權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞、從權(quán)利要求5所述的植物、從權(quán)利要求6所述的繁殖材料、從權(quán)利要求7所述的可收獲的植物部分或從通過權(quán)利要求8所述的方法可獲得的植物提取乙酰透明質(zhì)酸的步驟。
10. 權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞、權(quán)利要求5所述的植物、權(quán)利要求6所述的繁殖材料、權(quán)利要求7所述的可收獲的植物部分或通過權(quán)利要求8所述的方法可獲得的植物用于制備乙酰透明質(zhì)酸的用途。
11. 組合物，其包含權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞。
12. 制備包含乙酰透明質(zhì)酸的組合物的方法，其中使用了權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞、權(quán)利要求5所述的植物、權(quán)利要求6所述的繁殖材料、權(quán)利要求7所述的可收獲的植物部分或通過權(quán)利要求8所述的方法可獲得的植物。
13. 權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞、權(quán)利要求5所述的植物、權(quán)利要求6所述的繁殖材料、權(quán)利要求7所述的可收獲的植物部分或通過權(quán)利要求8所述的方法可獲得的植物用于制備權(quán)利要求11所述的組合物的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及合成增加的乙酰透明質(zhì)酸的量的植物細(xì)胞和植物，并涉及用于制備這類植物的方法，也涉及借助于這些植物細(xì)胞或植物制備乙酰透明質(zhì)酸的方法。在此，與野生型植物細(xì)胞或野生型植物相比較，根據(jù)本發(fā)明的植物細(xì)胞或經(jīng)遺傳修飾的植物具有乙酰透明質(zhì)酸合成酶活性和額外地增加的谷氨酰胺果糖6-磷酸酰胺轉(zhuǎn)移酶(GFAT)活性和增加的UDP葡萄糖脫氫酶(UDP-Glc-DH)活性。本發(fā)明還涉及具有增加的乙酰透明質(zhì)酸合成的植物用于制備乙酰透明質(zhì)酸和含有乙酰透明質(zhì)酸的食物或飼料中的用途。
文檔編號C12N9/06GK101277610SQ200680036866
公開日2008年10月1日 申請日期2006年10月5日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月5日
發(fā)明者C·弗羅貝格, B·埃西格曼 申請人:拜爾作物科學(xué)股份公司