一種快速鑒定茶樹種質(zhì)烏龍茶適制性的分子標(biāo)記方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于茶樹種質(zhì)鑒定利用與品種選育領(lǐng)域。具體涉及一種快速鑒定茶樹種質(zhì) 烏龍茶適制性的分子標(biāo)記方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 簡單重復(fù)序列（simple sequence repeat，SSR)，具有等位變異高、共顯性、簡便、 快速、穩(wěn)定的特點(diǎn)，目前SSR是茶樹種質(zhì)鑒定、遺傳多樣性、親緣關(guān)系等研宄的主要分子標(biāo) 記之一。從NCBI公共數(shù)據(jù)庫中下載茶樹EST序列，利用軟件獲取EST序列微衛(wèi)星（SSR) 信息，并利用軟件將微衛(wèi)星側(cè)翼保守序列設(shè)計成引物，通過初步篩選獲得30對有效SSR 引物，另收集公開發(fā)表的茶樹SSR引物328對（Jian-Qiang Ma, Ming-Zhe Yao, Chun-Lei Ma,etc. Construction of a SSR-Based Genetic Map and Identification of QTLs for Catechins Content in Tea Plant(Camellia sinensis). Plos one 9(3): e93131. doi:10.1371/journal. pone. 0093131)。
[0003] 適制烏龍茶的茶樹種質(zhì)主要分布在我國福建、廣東、臺灣等地(黃福 平，梁月榮，陸建良，等.烏龍茶種質(zhì)資源種群遺傳多樣性AFLP評價.茶葉科 學(xué)，2004, 24(3) : 183-189)，按照上述步驟（1)至步驟（4)獲得福建以及部分廣東、臺灣60 個茶樹種質(zhì)合計358個位點(diǎn)上的基因型（上述358對SSR引物）。在TM352、TM445位點(diǎn)上 這些種質(zhì)均共包括8種基因型，且呈現(xiàn)規(guī)律性的分型特點(diǎn)，4種基因型為適制烏龍茶的茶樹 種質(zhì)，其余4種基因型均為不適制烏龍茶的茶樹種質(zhì)，推測TM352、TM445位點(diǎn)與控制茶樹種 質(zhì)烏龍茶適制性的基因 （quantitative trait locus, QTL)連鎖或共分離。
[0004] 烏龍茶有別于其他茶類的最主要特征是具有自然幽雅的花香，形成這種品質(zhì)特征 的基礎(chǔ)是茶樹品種。烏龍茶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，在很大程度上取決于適制烏龍茶的茶樹品種的選 育與應(yīng)用，而選育適制烏龍茶的茶樹品種，其關(guān)鍵技術(shù)是對茶樹種質(zhì)進(jìn)行烏龍茶適制性鑒 定。對茶樹種質(zhì)進(jìn)行烏龍茶適制性鑒定，至今仍采用直接鑒定法。該方法通過采摘茶樹鮮 葉加工制做烏龍茶樣品，然后對樣品進(jìn)行感官審評確定品質(zhì)，最后根據(jù)品質(zhì)鑒定結(jié)果確定 茶樹種質(zhì)烏龍茶適制性。直接鑒定法先要種植茶樹種質(zhì)，一般需要經(jīng)過2~3年的擴(kuò)繁與 生長，才可進(jìn)行單株或株系采制試驗，品質(zhì)鑒定需要重復(fù)3年。從茶樹種植至獲得品質(zhì)鑒定 結(jié)果至少需要5~6年。直接鑒定法存在鑒定時間長，耗費(fèi)人力、物力、財力較大，鑒定效率 車父低等缺點(diǎn)。
[0005] 將TM352、TM445位點(diǎn)上的4種基因型作為適制烏龍茶的茶樹種質(zhì)的基因型（圖 1，A、B、C、D ;圖2, a、b、c、d)，可對茶樹種質(zhì)進(jìn)行烏龍茶適制性快速鑒定。應(yīng)用這種方法 可在茶樹生長的幼齡期（苗期）采摘微量的茶樹組織（1~2g)進(jìn)行分子標(biāo)記基因型鑒定， 通過簡單的實驗操作和分析即可篩選出適制烏龍茶的茶樹種質(zhì)，整個過程僅需要1-2個 工作日即可，相比直接鑒定法（5~6年）極大的縮短了鑒定周期，可以減少烏龍茶品種 選育過程人力、物力、財力的浪費(fèi)。應(yīng)用本方法進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇育種（Molecular Marker-Assisted Selection, MAS)，可以一定程度上實現(xiàn)烏龍茶品種定向育種，減少烏龍 茶新品種選育的盲目性。應(yīng)用本方法還可以初步掌握多個待鑒定茶樹種質(zhì)間的遺傳背景與 親緣關(guān)系。該方法可作為快速鑒定茶樹種質(zhì)烏龍茶適制性的分子標(biāo)記方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種快速鑒定茶樹種質(zhì)烏龍茶適制性的分子標(biāo)記方法，可 在茶樹生長的幼齡期（苗期）快速鑒定茶樹種質(zhì)的烏龍茶適制性，減少烏龍茶品種選育過程 人力、物力、財力的浪費(fèi)。在一定程度上實現(xiàn)烏龍茶定向育種，減少烏龍茶新品種選育的盲 目性。
[0007] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案： 包含以下具體步驟： (1)待鑒定茶樹種質(zhì)基因組DNA提取 X:將研缽中加入3mLl. 5%CTAB溶液，取2. Og樣品放到研缽中研磨均勾，吸取1.0 mL研 磨溶液轉(zhuǎn)入2. OmL離心管中，置65°C水浴lh，間隔15min輕輕混勻1次。
[0008] ②冷卻后，加入600uL的氯仿：異戊醇，其體積比為24:1，混勻，12000r/min，離心 15min〇
[0009] 吸上清，轉(zhuǎn)入新的I. 5mL離心管，重復(fù):?步驟1次。
[0010] ::?:吸上清，轉(zhuǎn)入新的離心管中，加入1/3體積的3mol/L NaAc和lmL-20°C預(yù)冷的 無水乙醇，混勻后置于-20°C靜置30min。
[0011] :甚 12000 r/min，離心 lOmin，棄上清。
[0012] S:加入75%乙醇洗滌2次，置于吸水紙上倒置晾干。
[0013] :2:加入 50uLddH20 溶解，即為 DNA。
[0014] (2)特定的SSR熒光標(biāo)記引物合成 :χ: TM352、TM445標(biāo)記引物信息(位點(diǎn)信息）如表1。
[0015] 表1標(biāo)記引物信息
S TM352、TM445標(biāo)記引物熒光染料為表2中的任意一種。
[0016] 表2標(biāo)記引物熒光染料種類
(3)以待鑒定茶樹種質(zhì)基因組DNA為模板，分別利用特定的SSR熒光標(biāo)記引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增 X PCR 反應(yīng)體系：CldH2O 16 μ L，IOXBuffer 3 μ L，10 mmoir1 dNTP 3 μ L，MgCl2 2 μ L， 10 μ molfF、R 引物各 I. 5 μ L，0· 5U Taq 酶 1 μ L，模板 DNA 2 μ L。
[0017] :f PCR熱循環(huán)程序：94°C預(yù)變性5min，使模板DNA充分變性，然后進(jìn)入下列溫度循 環(huán)：94°C變性lmin，52 °C退火lmin，72°C延伸lmin，重復(fù)35個熱循環(huán)；72°C延伸20min，最 后4 C保存。
[0018] (4) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測，分別獲得待鑒定茶樹種質(zhì)特定位點(diǎn)上的基因型 .3：: R0X500分子量標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制：50ul R0X500分子量標(biāo)準(zhǔn)原液加950ul Hi-Di， 配成Iml R0X500分子量標(biāo)準(zhǔn)工作液，4°C備用，_20°C長期保存。
[0019] :：!:在96孔板內(nèi)加入Iul樣品與IOul R0X500分子量標(biāo)準(zhǔn)工作液，震蕩混勻，離心， 使用3730x1型DNA分析儀檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，分別獲得待鑒定茶樹種質(zhì)在TM352、TM445位 點(diǎn)上的基因型。
[0020] (5)分析待鑒定茶樹種質(zhì)基因型 S首先按照上述步驟（1)至步驟（4)分別獲得待鑒定茶樹種質(zhì)在TM352、TM445位點(diǎn)上 的基因型。
[0021] i：然后將其與適制烏龍茶的種質(zhì)在TM352、TM445位點(diǎn)上的基因型比較，如果待鑒 定茶樹種質(zhì)在這兩個位點(diǎn)上的基因型與適制烏龍茶的種質(zhì)在TM352、TM445位點(diǎn)上的基因 型共同一致，則判定該茶樹種質(zhì)為適制烏龍茶的種質(zhì)。
[0022] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：（1)可在茶樹生長的幼齡期(苗期）采摘微量的茶樹組織 (1~2g)進(jìn)行分子標(biāo)記基因型鑒定，通過簡單的實驗操作和分析即可篩選出適制烏龍茶 的茶樹種質(zhì)，整個過程僅需要1-2個工作日即可，相比直接鑒定法（5~6年）極大的縮 短了鑒定周期，可以減少烏龍茶品種選育過程人力、物力、財力的浪費(fèi)；（2)在烏龍茶新 品種選育過程中應(yīng)用本技術(shù)進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇育種（Molecular Marker-Assisted Selection，MAS)，可以一定程度上實現(xiàn)烏龍茶品種定向育種，減少烏龍茶新品種選育的盲 目性；（3)應(yīng)用本發(fā)明可以初步掌握多個待鑒定茶樹種質(zhì)間的遺傳背景與親緣關(guān)系。該發(fā) 明可作為快速鑒定茶樹種質(zhì)烏龍茶適制性的分子標(biāo)記方法。
【附圖說明】
[0023] 圖1適制烏龍茶的茶樹種質(zhì)在TM352位點(diǎn)上4種基因型（A、B、C、D)。
[0024] 圖2適制烏龍茶的茶樹種質(zhì)在TM445位點(diǎn)上4種基因型（a、b、c、d)。
[0025] 圖3茶樹新品系春桃香在TM352、TM445位點(diǎn)上的基因型。
[0026] 圖4茶樹新品系茗科3號在TM352、TM445位點(diǎn)上的基因型。
【具體實施方式】
[0027] (1)待鑒定茶樹種質(zhì)基因組DNA提取 .2)將研缽中加入3mLl. 5%CTAB溶液，取2. Og樣品放到研缽中研磨均勻，吸取1.0 mL研 磨溶液轉(zhuǎn)入2. OmL離心管中，置65°C水浴lh，間隔15min輕輕混勻1次。
[0028] :：!:冷卻后，加入600uL的氯仿：異戊醇，其體積比為24:1，混勾，12000r/min，離心 15min〇
[0029] :f吸上清，轉(zhuǎn)入新的I. 5mL離心管，重復(fù)②步驟1次。
[0030] :1:吸上清，轉(zhuǎn)入新的離心管中，加入1 /3體積的3mo I/L NaAc和lmL-20 °C預(yù)冷的 無水乙醇，混勻后置于-