基于MassARRAY質(zhì)譜平臺Iplex分析的肺癌基因譜檢測方法及試劑盒與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于檢測肺癌的檢測方法，特別涉及一種基于MassARRAY質(zhì)譜平 臺Iplex分析的肺癌基因譜檢測方法及試劑盒與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 肺癌是我惡性腫瘤死亡原因之首，發(fā)病率持續(xù)上升，健康危害形勢嚴(yán)峻，其發(fā)生、 發(fā)展以及治療與基因變異關(guān)系密切，基于基因變異的"個體化"靶向治療是繼傳統(tǒng)放化療后 腫瘤領(lǐng)域的新突破。非小細(xì)胞肺癌（NSCLC)樣本中基因靶點(diǎn)變異可從相應(yīng)的靶向藥物治療 中獲益，針對EGFR和ALK基因變異的酪氨酸激酶抑制劑（TKI)吉非替尼（gefitinib)/厄洛 替尼（erlotinib)和克佐替尼（crizotinb)等革El向治療可延長患者的生存期。隨著研宄深 入，ROSl、RET、ERBB2、STKll等分子變異被逐步確定為肺癌的驅(qū)動基因 （driver gene)，并 且新的低頻基因被陸續(xù)報道。但是大部分患者在接受靶向治療后一年左右最終都會對TKI 藥物耐藥。在非小細(xì)胞肺癌中，對EGFR TKI藥物Gefitinib/Erlotinib的抗藥性分子機(jī) 理包括 EGFR 二次變異（T790M、D761Y、L747S、T854A、G796A 和 Exon20 插入）以及 EGFR 基 因擴(kuò)增、RAS/RAF基因變異、MAPK1基因擴(kuò)增、MET基因擴(kuò)增、HGF/MET激活、FGF/FGFR激活、 PTEN丟失、GAS6/AXL激活、IGFBP3丟失、BRCAl高表達(dá)和CRKL基因擴(kuò)增。在抗ALK TKI藥 物 Crizotinib 的肺癌中，ALK 二次突變（L1196M、C1156Y、F1174L、L1152R、G1202R、S1206Y 和1151T插入）及ALK基因擴(kuò)增、⑶74-R0S1融合、KIT基因擴(kuò)增，EGFR或KRAS變異也被 發(fā)現(xiàn)。目前本申請人所在肺癌研宄進(jìn)行的臨床試驗(yàn)正在研宄MET抑制劑INC280聯(lián)合EGFR TKI治療非小細(xì)胞肺癌靶向藥物治療耐藥后MET突變的療效。腫瘤發(fā)生發(fā)展耐藥的多位點(diǎn) 變異決定了腫瘤靶點(diǎn)的分子分型、靶向治療以及耐藥后機(jī)制探索的復(fù)雜性。
[0003] 在肺癌的分子分型方面，目前臨床單基因檢測方法主要有qPCR、測序、FISH及IHC 等多平臺技術(shù)，除了 EGFR、ALK、KRAS等主要基因的檢測技術(shù)在臨床相對成熟之外，R0S1、 RET、HER2、NRTK、NRG、RICTOR、mTOR、LKBl、MET、RITlA等分子變異的分型在臨床主要限制 因素有：分析的通量化（high throughput)不夠成熟和生物材料的有限性獲得（limited procurement)。臨床上肺癌早期患者接受手術(shù)（大手術(shù)或小手術(shù)活檢）具有充足的組織， 晚期患者通常通過經(jīng)皮肺穿刺、支氣管鏡活檢、支氣管內(nèi)超聲穿刺活檢等獲得只是少量標(biāo) 本。這些小標(biāo)本為了滿足現(xiàn)有的臨床病理診斷和個別基因的分子檢測，很難有剩余材料進(jìn) 一步用于其他重要分子分型（molecular classification/genotying)、藥物耐藥機(jī)制等分 析?？梢娔[瘤樣本的匱乏、低通量、耗時性以及價格昂貴等是制約臨床多次單個基因檢測開 展的瓶頸。
[0004] 腫瘤發(fā)生發(fā)展、靶向治療后耐藥以及轉(zhuǎn)移機(jī)制等分子靶點(diǎn)的復(fù)雜性分析，以及對 肺癌患者樣本多靶點(diǎn)變異基因進(jìn)行單基因檢測的局限性，決定了在臨床轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研宄中 開展多基因檢測平臺的必要性與緊迫性。MassARRAY分子量陣列技術(shù)通過擴(kuò)增延伸反應(yīng) 與質(zhì)譜相結(jié)合實(shí)現(xiàn)基因的分型檢測，基于此平臺的Iplex技術(shù)可基于96/384孔板開展多 基因檢測，操作程序簡單，分型結(jié)果具有質(zhì)譜的高準(zhǔn)確性和敏感性。LungCarta試劑盒是 MassARRAY公司研發(fā)主要針對肺癌靶向基因檢測的試劑盒，已在肺癌領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，包含 26個癌癥相關(guān)基因的214個突變位點(diǎn)。本發(fā)明申請人已經(jīng)使用LungCarta試劑盒對肺癌患 者組織樣本進(jìn)行多基因多位點(diǎn)的高通量檢測，檢測樣本目前已達(dá)到100多例，可明顯提高 臨床檢測效率，改變傳統(tǒng)單基因檢測價格昂貴，耗時長，操作繁瑣等劣勢，為肺癌患者的臨 床靶向治療以及耐藥后治療、以及生物標(biāo)志物轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研宄提供更全面的依據(jù)。但是由于 該試劑盒為國外研發(fā)，技術(shù)信息保密，價格昂貴，且未完全包括前沿分子靶點(diǎn)如原發(fā)MET基 因變異與EGFR TKI的靶向治療耐藥相關(guān)、ALK基因的多個位點(diǎn)突變與Crizotinib的靶向 治療耐藥相關(guān)等，以及中美地區(qū)驅(qū)動基因譜具有差異性等特點(diǎn)，因此研發(fā)適合中國人群的 多基因同步檢測方法具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種基于MassARRAY質(zhì) 譜平臺Iplex分析的肺癌基因譜檢測方法。
[0006] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種基于MassARRAY質(zhì)譜平臺的肺癌基因譜檢測試 劑盒，是通過上述檢測方法設(shè)計得到。
[0007] 本發(fā)明的再一目的在于提供上述試劑盒的應(yīng)用
[0008] 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種基于MassARRAY質(zhì)譜平臺Iplex分析 的肺癌基因譜檢測方法，能檢測肺癌13種驅(qū)動和耐藥相關(guān)基因的99種熱點(diǎn)變異位點(diǎn)，包括 如下步驟：
[0009] (1)設(shè)計如表1所示的擴(kuò)增引物和如表2所示的延伸引物；
[0010] ⑵將如表1所示的擴(kuò)增引物分為12組，擴(kuò)增引物名稱末尾為Pl-F和Pl-R為第 1組，擴(kuò)增引物名稱末尾為P2-F和P2-R為第2組，類推，分為12組；將分組后的擴(kuò)增引物 混合，得到12管擴(kuò)增引物混合液；將如表2所示的延伸引物進(jìn)行分組，延伸引物名稱末尾 為El的延伸引物混合得到第1管延伸引物混合物，延伸引物名稱末尾為E2的延伸引物混 合得到第2管延伸引物混合物，類推，得到11管延伸引物混合物和1管單獨(dú)延伸引物，共計 12管；
[0011] (3)以人肺組織基因組為模板，將12管擴(kuò)增引物混合液分別進(jìn)行PCR，獲得PCR產(chǎn) 物；
[0012] (4)將步驟（3)獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行堿性磷酸酶消化；
[0013] (5)將步驟（4)消化后的產(chǎn)物進(jìn)行延伸反應(yīng)：12管擴(kuò)增引物得到的產(chǎn)物分別對應(yīng) 12管延伸引物，Pl對應(yīng)E1，以此類推；
[0014] (6)在96孔板或384孔板將步驟（5)延伸反應(yīng)后得到的產(chǎn)物、清潔樹脂和水混合； 旋轉(zhuǎn)96孔板或384孔板進(jìn)行脫鹽去離子防干擾處理；接著離心；對上清進(jìn)行分析；
[0015] (7) MassARRAY系統(tǒng)Nanodispenser點(diǎn)樣儀進(jìn)行芯片點(diǎn)樣，利用Analyzer分析儀芯 片掃描；掃描結(jié)果以Typ er4. 0軟件分析各目的基因的突變狀況，在質(zhì)譜峰變異堿基處出現(xiàn) 峰，則判斷為突變。
[0016] 表1擴(kuò)增引物
[0017] Z3 I tlfm ?-t ?Λ? 二I I 4·Λτ? I /1-，
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[0024] I ' '
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[0025] 步驟（2)中所述的擴(kuò)增引物混合物中的擴(kuò)增引物優(yōu)選為按等摩爾比混合；更優(yōu)選 為每條擴(kuò)增引物的濃度為0. 5 μΜ ;
[0026] 步驟（2)中所述的延伸引物混合物中的延伸引物優(yōu)選為按如下摩爾比混合：
[0027] 第1管：如SEQ ID NO. 199~SEQ ID NO. 208所示的延伸引物的摩爾比為7. 04 : 7. 36 :8. 05 :8. 30 :9. 10 :9. 34 :10. 12 :10. 35 :10. 91 :11. 11 ;
[0028] 第2管：如SEQ ID NO. 209~SEQ ID NO. 218所示的延伸引物的濃度分別依次為 6. 83 :7. 11 :7. 84 :8. 05 :8. 93 :9. 16 :9. 76 :9. 94 :10. 42 :10. 90 ;
[0029] 第3管：如SEQ ID NO. 219~SEQ ID NO. 228所示的延伸引物的濃度分別依次為 7. 01 :7. 74 :7. 99 :8. 69 :8. 96 :9. 60 :9. 84 :10. 41 :10. 66 :11. 20 ;
[0030] 第4管：如SEQ ID NO. 229~SEQ ID NO. 238所示的延伸引物的濃度分別依次為 6. 89 ：7. 18 ：7. 89 ：8. 55 ：9. 44 ：9. 58 ：10. 15 ：10. 40 ：11. 02 ：11. 20 ；
[0031] 第5管：如SEQ ID NO. 239~SEQ ID NO. 248所示的延伸引物的濃度分別依次為 6. 94 ：7, 28 ：7, 59 ：8, 34 ：8, 59 ：9, 44 ：9, 63 ：10, 30 ：10, 45 ：11, 16 ；
[0032] 第6管：如SEQ ID NO. 249~SEQ ID NO. 258所示的延伸引物的濃度分別依次為 6. 94 ：7, 67 ：8, 34 ：8, 57 ：9, 31 ：9, 47 ：10, 03 ：10, 26 ：10, 91 ：11. 11 ；
[0033] 第7管：如SEQ ID NO. 259~SEQ ID NO. 268所示的延伸引物的濃度分別依次為 7. 05 ：7, 35 ：8. 11 ：8, 95 ：9, 18 ：9, 80 ：9, 99 ：10, 52 ：11, 01 ：11, 22 ；
[0034] 第8管：如SEQ ID NO. 269~SEQ ID NO. 278所示的延伸引物的濃度分別依次為 6. 87 ：7, 12 ：8, 09 ：8, 74 ：9, 00 ：9, 69 ：10, 42 ：10, 65 ：11, 13 ：11, 29 ；
[0035] 第9管：如SEQ ID NO. 279~SEQ ID NO. 285所示的延伸引物的濃度分別依次為 7. 11 ：8, 04 ：8, 72 ：8, 93 ：9, 63 ：10, 34 ：11, 10 ；
[0036] 第10管：如SEQ ID NO. 286~SEQ ID NO. 291所示的延伸引物的濃度分別依次為 6. 90 ：7, 97 ：8, 14 ：9. 11 ：9, 90 ：10, 74 ；
[0037] 第11管：如SEQ ID NO. 292~SEQ ID NO. 296所示的延伸引物的濃度分別依次為 7. 10 ：8, 14 ：9, 20 ：10, 09 ：10, 85 ；
[0038] 步驟⑵中所述的延伸引物混合物中的延伸引物的濃度優(yōu)選為如表3所示；
[0039] 表3延伸引物濃度
[0040]
[0041]
[0042] 步驟（3)中所述的PCR的體系優(yōu)選為：10XPCR緩沖液0. 5 μ 1、 MgCl2 (25mM) 0· 4 μ I、dNTPs (25mM) 0· 1 μ I、PCR 酶（5U/μ 1) 0· 2 μ 1、擴(kuò)增引物混合液 1 μ 1、 人肺組織基因組（l〇ng/ μ 1)2 μ 1，水補(bǔ)足5 μ I ;
[0043] 步驟（3)中所述的PCR的條件優(yōu)選為：94°C 2分鐘；94°C 30秒、56°C 30秒、72°C I 分鐘，45個循環(huán)；72 °C 5分鐘；
[0044] 步驟⑷中所述的消化的體系為：在PCR產(chǎn)物中加入核酸外切酶SAP 0. 3 μ 1、SAP 緩沖液0. 17 μ I、水補(bǔ)足至7 μ I ;
[0045] 步驟（4)中所述的消化的條件優(yōu)選為：37°C 40分鐘，85°C 5分鐘；
[0046] 步驟（5)中所述的延伸反應(yīng)的體系優(yōu)選為：在消化后得到的產(chǎn)物中加入Typeplex 緩沖液（IOX)〇·2 μ 1、Typ印Iex終止混合液（IOX)0.2 μ 1、Typ印Iex熱測序酶（33U/ μ 1)0. 041 μ 1、延伸引物混合液或單獨(dú)延伸引物溶液0. 804 μ 1、H2O補(bǔ)足至9 μ 1 ;
[0047] 步驟（5)中所述的延伸反應(yīng)的條件優(yōu)選為：94°C 30秒；〔94°C 5秒、（52°C 5秒、 80°C 5秒）5個循環(huán)〕，35個循環(huán)；72°C 3分鐘。
[0048] 步驟（6)中：當(dāng)使用96孔板操作時，將延伸反應(yīng)后的產(chǎn)物9 μ 1、水41 μ 1和清潔樹 脂（Clean Resin) 15mg混合；當(dāng)使用384孔板操作時，將延伸反應(yīng)后的產(chǎn)物9 μ 1、水16 μ 1 和清潔樹脂6mg混合；
[0049] 步驟（6)中所述的脫鹽去離子防干擾處理的時間優(yōu)選為