一種伊蚊b型和庫蚊沃爾巴克氏體的熒光檢測引物及其檢測方法和檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種伊蚊B型和庫蚊沃爾巴克氏體的熒光 檢測引物及其檢測方法和檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】：
[0002] 沃爾巴克氏體（Wolbachia)是廣泛分布于節(jié)肢動物體內(nèi)的共生微生物，它可能是 昆蟲共生微生物中最為豐富的類群。它分布于鞘翅目、雙翅目、半翅目、同翅目、膜翅目、鱗 翅目等昆蟲種類中。它以垂直傳播作為其在宿主世代間傳遞的基本模式。它穩(wěn)定地存在于 宿主的生殖細胞內(nèi)，通過卵細胞傳遞給宿主子代，并可通過多種方式如細胞質(zhì)不親和、雌性 化和殺雄性等調(diào)控宿主的生殖活動。通過這些調(diào)控作用促進其在宿主種群內(nèi)廣泛傳播。
[0003] 在沃爾巴克氏體（Wolbachia)引起的宿主生殖行為改變中，細胞質(zhì)不親和 (Cytoplasmic Incompatibility，Cl)是最常見的一種類型。它表現(xiàn)為當(dāng)被沃爾巴克氏 體（Wolbachia)感染的雄蚊與未感染雌蚊或感染不同種類Wolbachia的雌雄蚊交配時，精 子和卵子結(jié)合后胚胎無法發(fā)育。沃爾巴克氏體（Wolbachia)的胞質(zhì)不親和的特性可導(dǎo)致 Wolbachia感染的蚊能侵入未感染或感染不同種Wolbachia的蚊群進行種群壓制和種群替 代。它的應(yīng)用對蚊媒病防治具有巨大的價值。近期研宄發(fā)現(xiàn)，沃爾巴克氏體（Wolbachia) 不僅具有上述的特性外，同時它還能在蚊子體內(nèi)與蚊子攜帶的一些重要的病原生物（如 登革病毒，瘧原蟲等）相互作用，抑制它們在蚊子體內(nèi)的增值和擴散從而在阻斷這些病原 生物傳播于人類。沃爾巴克氏體（Wolbachia)的這種抑制作用與它在蚊子體內(nèi)組織的分 布相關(guān)，所以，了解沃爾巴克氏體（Wolbachia)在蚊子體內(nèi)組織分布有助于快速篩選出傳 播阻斷效果最好的沃爾巴克氏體（Wolbachia)感染的蚊子，也有助于監(jiān)測沃爾巴克氏體 (Wolbachia)在蚊群中的垂直傳播，同時也有利于高效率地監(jiān)測大規(guī)模大地域范圍的沃爾 巴克氏體（Wolbachia)在蚊子組織中的感染情況。
[0004] 在自然界中，蚊子的種類有很多，常見的有伊蚊和庫蚊兩種。伊蚊分為白紋伊蚊和 埃及伊蚊，其中埃及伊蚊不攜帶沃爾巴克氏體。由于沃爾巴克氏菌只能存活于宿主體內(nèi)，不 能在體外自由生活，因而如何有效特異地檢測沃爾巴克氏菌是對該細菌研宄的必備工具。 比較常用的檢測手段有聚合酶鏈反應(yīng)法（PCR法）和免疫染色法。免疫染色法耗時耗力，而 且特異性不好。隨著PCR方法的普及，針對沃爾巴克氏體的檢測有了很大的進步。不同蚊 種攜帶不同的沃爾巴克氏體，通過PCR結(jié)果能夠直觀的看出蚊子攜帶的不同沃爾巴克氏體 類型，這樣為我們的日常檢測提供了很大的便利。目前針對不同沃爾巴克氏體PCR檢測的 方法還不完善。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種專一性強、特異性高和靈敏度高的伊蚊B型和庫蚊沃爾 巴克氏體的熒光檢測引物。
[0006] 本發(fā)明的伊蚊B型和庫蚊沃爾巴克氏體的熒光檢測引物，其特征在于，包括
[0007] (1)針對伊蚊B型沃爾巴克氏體：
[0008] wAlbBF :5' -TTGATCTCTTTAGTAGCTGATACTG-3'，（其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 1 所 示）；
[0009] wAlbBR :5' -CAGTTAAAGATCAAAAAGGATTTGG-3'，（其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 2 所 示）；
[0010] 探針 A :5'-CACCATAAGAACCAAAATAACGAGCAC-3'，（其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 3 所示）；
[0011] 探針A的兩端分別結(jié)合有熒光發(fā)生基團FAM和熒光淬滅基團BHQl ;
[0012] (2)針對庫蚊沃爾巴克氏體：
[0013] wPipF :5' -GTCTTTCAATTGAAAAGATTC-3'，（其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 4 所示）；
[0014] wPipR :5' -AAGAATTGTCATTCCGTCTGC-3'，（其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 5 所示）；
[0015] 探針 B :5' -TCTCCCCAAAATATAGCC-3'，（其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 6 所示）；
[0016] 探針B的兩端分別結(jié)合有熒光發(fā)生基團HEX和熒光淬滅基團BHQl。
[0017] 本發(fā)明的第二個目的是提供一種非疾病的診斷和治療目的的伊蚊B型和庫蚊沃 爾巴克氏體的檢測方法，其特征在于，提取樣品DNA，以該樣品DNA為模板，使用上述伊蚊B 型和庫蚊沃爾巴克氏體的熒光檢測引物wAlbBF、wAlbBR、探針A、wPipF、wPipR和探針B進 行熒光定量PCR擴增，擴增反應(yīng)完成后，根據(jù)探針標(biāo)記的熒光發(fā)生基團的熒光信號，讀取并 記錄樣品的PCR循環(huán)次數(shù)Ct，根據(jù)樣品的Ct值，按照建立的判斷標(biāo)準(zhǔn)，判斷樣品是否含有伊 蚊B型和庫蚊沃爾巴克氏體。
[0018] 所述的進行熒光定量PCR擴增，其反應(yīng)條件優(yōu)選為：預(yù)變性50°C 5分鐘，95°C 15分 鐘；擴增94°C 15秒、55°C 45秒，40個循環(huán)；55°C的時候收集熒光信號。
[0019] 本發(fā)明的第三個目的是提供一種伊蚊B型和庫蚊沃爾巴克氏體的檢測試劑盒，包 括熒光檢測引物和PCR試劑，其特征在于，所述的熒光檢測引物包括：
[0020] (1)針對伊蚊B型沃爾巴克氏體：
[0021] wAlbBF :5' -TTGATCTCTTTAGTAGCTGATACTG-3'，（其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 1 所 示）；
[0022] wAlbBR :5' -CAGTTAAAGATCAAAAAGGATTTGG-3'，（其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 2 所 示）；
[0023] 探針 A :5' -CACCATAAGAACCAAAATAACGAGCAC-3'，（其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 3 所示）；
[0024] 探針A的兩端分別結(jié)合有熒光發(fā)生基團FAM和熒光淬滅基團BHQl ;
[0025] (2)針對庫蚊沃爾巴克氏體：
[0026] wPipF :5' -GTCTTTCAATTGAAAAGATTC-3'，（其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 4 所示）；
[0027] wPipR :5' -AAGAATTGTCATTCCGTCTGC-3'，（其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 5 所示）；
[0028] 探針 B :5' -TCTCCCCAAAATATAGCC-3'，（其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 6 所示）；
[0029] 探針B的兩端分別結(jié)合有熒光發(fā)生基團HEX和熒光淬滅基團BHQl。
[0030] 利用本發(fā)明的熒光檢測引物按照本發(fā)明的檢測方法能夠快速高效專一的檢測出 伊蚊B型和庫蚊沃爾巴克氏體，具有專一性強，特異性高（只檢測出伊蚊B型和庫蚊沃爾巴 克氏體，而伊蚊A型沃爾巴克氏體不發(fā)生擴增），靈敏度高，其最低檢測限為lOOcopies/ml。
[0031] 因此，本發(fā)明具有快速高效、操作簡便、高特異性、高靈敏度、鑒定簡便等優(yōu)點。
【附圖說明】：
[0032] 圖1是伊蚊B型沃爾巴克氏體的靈敏度的實驗結(jié)果圖，其中I、II、III、IV分別代表 DNA抽提液，10、100、1000倍稀釋的DNA抽提液；
[0033] 圖2是庫蚊沃爾巴克氏體的靈敏度的實驗結(jié)果圖，其中I、II、III、IV分別代表DNA 抽提液，10、100、1000倍稀釋的DNA抽提液；
[0034] 圖3是伊蚊B型和庫蚊沃爾巴克氏體的重復(fù)性的實驗結(jié)果圖，其中I、11分別代表 不同的樣品的擴增曲線；
[0035] 圖4是FAM檢測通道對B型沃爾巴克氏體的特異性的實驗結(jié)果圖；
[0036] 圖5是FAM檢測通道對A型和wPip型沃爾巴克氏體（庫蚊沃爾巴克氏體）的特 異性的實驗結(jié)果圖；
[0037] 圖6是HEX檢測通道對wPip型沃爾巴克氏體（庫蚊沃爾巴克氏體）的特異性的 實驗結(jié)果圖；
[0038] 圖7是HEX檢測通道對A型和B型沃爾巴克氏體的特異性的實驗結(jié)果圖。
【具體實施方式】：
[0039] 以下實施例是對本發(fā)明的進一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。
[0040] 實施例1 :靈敏度
[0041] 一、伊蚊B型沃爾巴克氏體的靈敏度
[0042] 1、一只攜帶伊蚊B型沃爾巴克氏體的蚊子經(jīng)二氧化碳熏暈后，解剖腹部置于 0· 2ul EP 管中；
[0043] 2、加入 20ulDNA 提取液（DNA 提取液的配方為：30mM Na0H、0. 25mM EDTA、 15mMTris-HCl，溶劑為水，使用前需振蕩，將白色片狀物一同加入）；
[0044] 3、充分混勻；
[0045] 4、瞬時離心后，99°C溫浴10分鐘；
[0046] 5、得到DNA抽提液，_20°C保存，即獲得伊蚊B型沃爾巴克氏體的基因組DNA ;
[0047] 6、將DNA抽提液進行10,100,1000梯度稀釋，每個梯度有兩個平行，共8個樣本， 作為模板DNA進行PCR擴增；
[0048] 7、PCR擴增體系：
[0049] 模板 DNA 2 μ I、PCR A 液 18 μ 1 和 PCR B 液 2 μ 1。
[0050] 所述的 PCR A 液，每 18 μ 1 含有 IOpmol 熒光檢測引物 wAlbBF (5' -TTGATCTCTTTAGT AGCTGATACTG-3'）、IOpmol 熒光檢測引物 wAlbBR(5'-CAGTTAAAGATCAAAAAGGATTT GG-3'）、5pmol 探針 A(5' -CACCATAAGAACCAAAATAACGAGCAC-3'，探針的兩端分別結(jié)合 有熒光發(fā)生基團FAM和熒光淬滅基團BHQl)，IOpmol熒光檢測引物wPipF(5' -GTCTTT CAATTGAAAAGATTC-3'）、IOpmol 熒光檢測引物 wPipR(5, -AAGAATTGTCATTCCGTCTG C-3'）、 5pmol探針B(5' -TCTCCCCAAAATATAGCC-3'，探針的兩端分別結(jié)合有熒光發(fā)生基團HEX和熒 光淬滅基團BHQl)，其余為pH值為8. 0的緩沖液。所述的緩沖液成份為50mmol/L Tris-HCl、 8mmol/L MgC12、250mmol/L KC1，溶劑為水。
[0051] 所述的PCR B液由熱啟動Taq酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs組成，每2 μ I PCR B液中含有 熱啟動Taq酶5U、逆轉(zhuǎn)錄酶2. 5U和dNTPs lOmmol，其余為水。
[0052] 8、混勻后進行PCR擴增；
[0053] 9、PCR反應(yīng)條件：
[0054] 預(yù)變性 50°C 2min
[0055] 95 °C 15min
[0056] 擴增 94 °C 15s
[0057] 55°C 45s 40個循環(huán)，55°C時收集熒光
[0058] 10、擴增結(jié)束后觀察擴增曲線。
[0059] 具體結(jié)果如圖1所示，結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：如果出現(xiàn)待測基因的擴增反應(yīng)曲線，且Ct值 小于38,則判斷為陽性，如果38〈Ct〈40,判斷為可疑，可疑加大模板量，重復(fù)擴增，如果得到 相同的實驗結(jié)果，則判斷為陽性，否則為陰性，如果Ct值為0或40,則判斷為陰性。
[0060] 從圖1可以看出，DNA抽提液、10、100、1000倍稀釋的DNA抽提液都能擴增出反應(yīng) 曲線，其Ct都小于38,判斷為陽性，1000倍稀釋的溶液中的DNA濃度為lOOcopies/ml。由 此，本發(fā)明的焚光檢測引物的檢測下限為l〇〇copies/ml。
[0061] 二、庫蚊沃爾巴克氏體的靈敏度
[0062] 庫蚊沃爾巴克氏體的靈敏度的實驗流程同B型沃爾巴克氏體的靈敏度試驗，只是 模板DNA換成庫蚊沃爾巴克氏體的基因