NO: 10 與 SEQ ID NO: 11，并在 SEQ ID N0:8 和 SEQ ID NO: 10 的 5'端標(biāo)記 FAM 熒光基團(tuán)，3'端標(biāo)記NFQ-MGB不發(fā)光淬滅基團(tuán)，在SEQ ID N0:9和SEQ ID NO: 11的5'端標(biāo) 記VIC熒光基團(tuán)，3'端標(biāo)記NFQ-MGB不發(fā)光淬滅基團(tuán)。將引物、探針分別制備成100 μΜ的 母液儲(chǔ)存。
[0070] 2.制備內(nèi)標(biāo)系統(tǒng)：設(shè)計(jì)并合成針對(duì)人類基因組設(shè)計(jì)的1對(duì)內(nèi)標(biāo)引物，該引物對(duì)序 列為SEQ ID NO: 12和SEQ ID NO: 13;設(shè)計(jì)并合成內(nèi)標(biāo)探針，該探針為SEQ ID NO: 14。將該 內(nèi)標(biāo)引物分別配制成100 μM的母液儲(chǔ)存，內(nèi)標(biāo)探針配制成100 μM的母液儲(chǔ)存。
[0071] 3.制備其他試劑：制備PCR緩沖液，其中含有1.0 mM的MgCl2, dATP、dUTP、dGTP和 dCTP 各 1.0 mM ;制備酶混合液，其中含有 Taq 酶 0· 5 X 103U/ml，UNG 酶 0· I X 103U/ml。
[0072] 4.制備陽(yáng)性對(duì)照液和空白對(duì)照液，該陽(yáng)性對(duì)照液中含有4種質(zhì)粒DNA，這些質(zhì)粒 DNA 中分別含有本發(fā)明試劑盒涉及的 CYP2D6*10C、CYP2D6*10T、SULT1A1*2G、SULT1A1*2A 基 因4種不同的多態(tài)性質(zhì)粒，該質(zhì)粒的選擇及設(shè)計(jì)為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，均為2500拷貝/ μ 1 ;該空白對(duì)照液為Tris-HCl (IOmM)緩沖液。
[0073] 5. PCR反應(yīng)液配制：按照下表進(jìn)行兩個(gè)不同體系PCR反應(yīng)液配制
[0074]
[0075] 6.組裝試劑盒：試劑盒中包含2管分別檢測(cè)CYP2D6和SULT1A1的基因多態(tài)性檢 測(cè)PCR反應(yīng)液，根據(jù)PCR反應(yīng)體系各成分使用量，計(jì)算12人份和24人份兩種規(guī)格各成分使 用量，配制試劑盒各管中成分并組裝。
[0076] 實(shí)施例2
[0077] 用實(shí)施例1制備的CYP2D6和SULT1A1基因多態(tài)性檢測(cè)試劑盒對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行檢 測(cè)。
[0078] 本實(shí)施例中收集30例乳腺癌患者的抗凝全血樣品，從其中提取基因組DNA，用 實(shí)施例1中得到的CYP2D6和SULT1A1基因多態(tài)性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)待檢樣品的CYP2D6和 SULT1A1的基因多態(tài)性情況。
[0079] 1.血液樣品基因組DNA提取
[0080] 取全血300 μ 1，加入900 μ 1的細(xì)胞裂解液CL，顛倒混勾，靜置5min， 10, 000rpm(ll，500Xg)離心lmin，吸去上清，留下細(xì)胞沉淀，向離心收集到的細(xì)胞沉淀中 加200 μ 1緩沖液GS，振蕩至徹底混勻。加入20 μ I Proteinase K溶液，混勻。加200 μ 1 緩沖液GB，充分顛倒混勻，56°C放置lOmin，其間顛倒混勻數(shù)次，直至溶液變清亮（如溶液 未徹底變清亮，請(qǐng)延長(zhǎng)裂解時(shí)間至溶液清亮為止）。加200 μ 1無水乙醇，充分顛倒混勻，此 時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀。將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個(gè)吸附柱CB3中（吸附 柱CB3放入收集管中），12, OOOrpm(13, 400 X g)離心30秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱 CB3放入收集管中。向吸附柱CB3中加入500 μ 1緩沖液⑶（使用前請(qǐng)先檢查是否已加入 無水乙醇），12, OOOrpm(13, 400 X g)離心30秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB3放入收 集管中。向吸附柱CB3中加入600 μ 1漂洗液PW(使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無水乙醇）， 12, 000rpm(13, 400Xg)離心30秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。重 復(fù)操作步驟7。12,000rpm(13,400Xg)離心2min，倒掉廢液。將吸附柱CB3置于室溫放置 數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入I. 5ml離心管中，向吸附 膜中間位置懸空滴加100 μ 1洗脫緩沖液TB，室溫放置2-5min，12, OOOrpm(13, 400 Xg)離心 2min，將溶液收集到離心管中。取2 μ 1所得溶液測(cè)OD值以確定DNA濃度，然后將樣品DNA 稀釋到IOng/ μ 1，分別取2 μ 1加入至實(shí)施例1中制得的試劑盒中并進(jìn)行下一步的PCR反 應(yīng)。
[0081] 2.樣本的熒光定量PCR檢測(cè)
[0082] 將步驟1中稀釋后的DNA樣品依次取2 μ 1分別加入到23 μ 1的實(shí)施例1的試劑 盒的CYP2D6*10檢測(cè)反應(yīng)體系和SULT1A1*2檢測(cè)反應(yīng)體系中，使兩種反應(yīng)體系總體積均為 25 μ 1，并放入熒光定量PCR儀，按如下所示設(shè)置PCR反應(yīng)程序后進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)：
[0083] 37〇C IOmin ；
[0084] 95 °C 5min ；
[0085] 95°0 158,60°0 6〇8,40個(gè)循環(huán)；每個(gè)循環(huán)后收集？41^1(：和1^的熒光信號(hào)。
[0086] 3.樣本的檢測(cè)結(jié)果分析：30例樣品的檢測(cè)結(jié)果如下：
[0087] CYP2D6*10C/C純合野生樣本7例，其中一個(gè)檢測(cè)結(jié)果如圖1所示；
[0088] CYP2D6*10T/T純合突變樣本4例，其中一個(gè)檢測(cè)結(jié)果如圖2所示；
[0089] CYP2D6*10C/T雜合突變樣本19例，其中一個(gè)檢測(cè)結(jié)果如圖3所示；
[0090] SULT1A1*2G/G純合野生樣本20例，其中一個(gè)檢測(cè)結(jié)果如圖4所示；
[0091] SULT1A1*2G/A雜合突變樣本10例，其中一個(gè)檢測(cè)結(jié)果如圖5所示；
[0092] 上述30例樣本熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果與測(cè)序結(jié)果一致。以上結(jié)果表明本發(fā)明提 供的檢測(cè)試劑盒用于人類CYP2D6和SULT1A1基因多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果可靠，與直接測(cè)序一致率 達(dá)到100%，且本發(fā)明檢測(cè)方法靈敏度高于傳統(tǒng)測(cè)序方法，操作簡(jiǎn)單快速，利于大規(guī)模推廣。 [0093] 以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精 神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種CYP2D6和SULT1A1基因多態(tài)性檢測(cè)試劑盒，該試劑盒包括PCR緩沖液， HotStartTaq酶，UNG酶，2組特異性引物，2組特異性探針和內(nèi)標(biāo)系統(tǒng)，其中，所述2組特異 性引物序列分別為SEQIDN0:1、SEQIDN0:2、SEQIDN0:3與SEQIDN0:4;SEQIDN0:5、 SEQIDNO:6 與SEQIDNO:7。2. 如權(quán)利要求I所述的CYP2D6和SULT1A1基因多態(tài)性檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述 2 組特異性探針序列分別為SEQIDNO: 8 與SEQIDNO: 9,SEQIDNO: 10 與SEQIDNO: 11， 且所述特異性探針5'端修飾有FAM或VIC，3'端修飾有NFQ-MGB。3. 如權(quán)利要求1或2所述的CYP2D6和SULT1A1基因多態(tài)性檢測(cè)試劑盒，其特征在 于，所述內(nèi)標(biāo)系統(tǒng)包含內(nèi)標(biāo)引物和內(nèi)標(biāo)探針，所述內(nèi)標(biāo)引物序列為SEQIDNO: 12和SEQID NO: 13,所述內(nèi)標(biāo)探針序列為SEQIDNO: 14。4. 如權(quán)利要求3所述的CYP2D6和SULT1A1基因多態(tài)性檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述 內(nèi)標(biāo)探針5'端修飾有R0X，3'端修飾有BHQ2。5. 如權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的CYP2D6和SULT1A1基因多態(tài)性檢測(cè)試劑盒，其特 征在于，所述檢測(cè)試劑盒含有陽(yáng)性對(duì)照液和空白對(duì)照液，所述陽(yáng)性對(duì)照液含有4種質(zhì)粒DNA 混合液，所述4種質(zhì)粒DNA分別含有2種不同的CYP2D6等位基因和2種不同的SULT1A1等 位基因，所述空白對(duì)照為Tris-HCl緩沖液。6. -種用于檢測(cè)CYP2D6和SULT1A1基因多態(tài)性的方法，該方法包括以下步驟： (1) 設(shè)計(jì)并篩選含有CYP2D6和SULT1A1的檢測(cè)探針，ARMS引物，通用引物； (2) 使用從非細(xì)胞體系或細(xì)胞體系中提取的基因組DNA作為模板DNA; (3) 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增：每個(gè)樣本的CYP2D6基因多態(tài)性和SULT1A1基因多態(tài) 性檢測(cè)分2管進(jìn)行PCR反應(yīng)。7. -種用于檢測(cè)CYP2D6和SULT1A1基因多態(tài)性的方法，該方法包括以下步驟： (1) 設(shè)計(jì)并篩選特異性擴(kuò)增與檢測(cè)CYP2D6和SULT1A1基因多態(tài)性的引物組合和探針組 合；制備如權(quán)利要求1至5任選一項(xiàng)所述試劑盒； (2) 獲得待測(cè)樣品基因組DNA; (3) 進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增：每個(gè)樣本分兩個(gè)反應(yīng)管分別檢測(cè)CYP2D6和SULT1A1基因 的多態(tài)性，每管中加入特異性引物組和探針組、PCR反應(yīng)緩沖液、Taq酶、UNG酶、內(nèi)標(biāo)系統(tǒng)， 將上述獲得的基因組DNA先后取相同的量加入所述2個(gè)反應(yīng)管中并同時(shí)進(jìn)行PCR反應(yīng)。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種人類CYP2D6和SULT1A1基因多態(tài)性檢測(cè)試劑盒，該試劑盒包括PCR緩沖液，dNTP，MgCl2，2組特異性引物，2組特異性探針，內(nèi)標(biāo)系統(tǒng)，HotStart Taq酶、UNG酶。本發(fā)明用于檢測(cè)CYP2D6和SULT1A1基因多態(tài)性的試劑盒具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單快速、高通量、安全、結(jié)果判讀客觀等優(yōu)勢(shì)。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號(hào)】CN104894236
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510219734
【發(fā)明人】張喆, 葉婷, 張 浩, 周鵬飛
【申請(qǐng)人】武漢友芝友醫(yī)療科技有限公司
【公開日】2015年9月9日
【申請(qǐng)日】2015年4月30日