SEQ ID N0:6為普通PCR引物，分別擴(kuò)增包含CYP2D6*10 和 SULT1A1*2 基因多態(tài)性的 DNA 片段；其中 SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4 與 SEQ ID N0:7 為ARMS引物，用于分別特異性擴(kuò)增含有CYP2D6*10C密碼子CCT，CYP2D6*10T密碼子TCT， SULT1A1*2G密碼子CGC的DNA片段。3條ARMS引物分別在3'模板堿基與待擴(kuò)增類型的堿 基配對，同時(shí)在其3'末端倒數(shù)第2-3位增加一個或者兩個堿基錯配，以增強(qiáng)特異性。
[0025] 各引物序列列舉如下：
[0026] CYP2D6*10上游引物5'-GGCCATCTTCCTGCTCCTGGTGG-3' SEQ ID NO: 1
[0027] CYP2D6*10 下游引物 5'-TCGAAGCAGTATGGTGTGTTCTGGA-3， SEQ ID NO:2
[0028] CYP2D6*10C ARMS 引物 5'-CAGTGGCAGGGGGCCTGGTAC-3' SEQ ID NO:3
[0029] CYP2D6*10T ARMS 引物 5'-CAGTGCAGGGGGCCTGGTAT-3' SEQ ID NO:4
[0030] SULT1A1*2 上游引物 5'-TTTCTAGGAGAAGTGGCCAGAT-3' SEQ ID NO:5
[0031] SULT1A1*2 下游引物 5'-GTTCTTCTTCATCTCCTTGAA-3' SEQ ID NO:6
[0032] SULT1A1*2G ARMS 引物 5'-CCACGGTCTCCTCTGGCAGGGTCC-3' SEQ ID NO:7
[0033] 在一些具體實(shí)施方案中，所述特異性探針5'端修飾有FAM或VIC，3'端修飾有非 焚光淬滅基團(tuán)NFQ (Non-Fluorescent Quencher)，該基團(tuán)本身不產(chǎn)生焚光，因此可以大大降 低本底信號的強(qiáng)度，同時(shí)該特異性探針上還連接有MGB修飾基團(tuán)，可以將該探針的Tm值提 高10°C左右，因此同樣的Tm值，MGB探針可以比普通Taqman探針設(shè)計(jì)的更短，使得探針在 識別具有單個核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)時(shí)，特異性更強(qiáng)。
[0034] 在一些具體實(shí)施方案中，，所述2組特異性探針序列分別為SEQ ID NO: 8與SEQ ID N0:9, SEQ ID NO: 10 與 SEQ ID NO: 11，且其中 SEQ ID N0:8 與 SEQ ID N0:9 探針分別特異 性檢測 CYP2D6*10T、CYP2D6*10C 模板 DNA，SEQ ID NO: 10 與 SEQ ID NO: 11 探針分別特異性 檢測 SULT1A1*2G、SULT1A1*2A 模板 DNA ;
[0035] 各探針序列列舉如下：
[0036] CYP2D6*10C 檢測探針 5'-FAM-GCTGCACGCTACCCAC-NFQ-MGB-3， SEQ ID NO:8
[0037] CYP2D6*10T 檢測探針 5'-VIC-GGGCCTGGTGAG-NFQ-MGB-3， SEQ ID NO:9
[0038] SULT1A1*2G檢測探針5'-FAM-GTTTGTGGGGCGC-NFQ-MGB-3， SEQ ID NO: 10
[0039] SULT1A1*2A 檢測探針 5'-VIC-GTTTGTGGGGCAC-NFQ-MGB-3' SEQ ID NO: 11
[0040] 在一些具體實(shí)施方案中，使用內(nèi)標(biāo)系統(tǒng)監(jiān)測該熒光定量PCR反應(yīng)是否存在抑制， 由于待檢測的樣品中的某些成分可能含有導(dǎo)致PCR出現(xiàn)部分或完全抑制；此外，擴(kuò)增儀可 能存在高于允許范圍的孔間差，導(dǎo)致不同管間擴(kuò)增效率差異，另外人為加樣錯誤也可能導(dǎo) 致假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，因此本發(fā)明在一些具體實(shí)施方案中采用內(nèi)標(biāo)系統(tǒng)來消除上述隱患， 保證了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。該內(nèi)標(biāo)系統(tǒng)優(yōu)選包含內(nèi)標(biāo)引物、內(nèi)標(biāo)探針，本發(fā)明實(shí)施例中個可 采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其它內(nèi)標(biāo)系統(tǒng)。
[0041] 在一些具體實(shí)施方案中，所述內(nèi)標(biāo)系統(tǒng)包含內(nèi)標(biāo)引物和內(nèi)標(biāo)探針。所述內(nèi)標(biāo)引物 序列為SEQ ID NO: 12和SEQ ID NO: 13,所述內(nèi)標(biāo)探針序列為SEQ ID NO: 14;所述內(nèi)標(biāo)探針 5'端修飾有R0X，3'端修飾有BHQ2。
[0042] 在一些具體實(shí)施方案中，所述內(nèi)標(biāo)系統(tǒng)針對人類基因組保守區(qū)域設(shè)計(jì)，具有高度 的靈敏性和擴(kuò)增特異性，其中包含的內(nèi)標(biāo)引物序列如下所示：
[0043] 內(nèi)標(biāo)正向引物 F:5' -CGCGAACTCACCCGT-3' SEQ ID NO: 12
[0044] 內(nèi)標(biāo)反向引物 R:5' -CACTAGGCGCTCACTGT-3' SEQ ID NO: 13
[0045] 在一些具體實(shí)施方案中，內(nèi)標(biāo)探針Y端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)，如R0X、FAM、VIC等，3' 端標(biāo)記有不發(fā)光熒光淬滅基團(tuán)，如BHQ2等。當(dāng)探針完整的時(shí)候，報(bào)告基團(tuán)所發(fā)射的熒光能 量被淬滅基團(tuán)吸收，儀器檢測不到信號。隨著PCR的進(jìn)行，Taq酶在DNA鏈延伸過程中遇到 與模板結(jié)合的探針，其5' -3'外切核酸酶活性就會將探針切斷，報(bào)告基團(tuán)遠(yuǎn)離熒光淬滅 基團(tuán)，產(chǎn)生熒光信號。因此檢測到的信號強(qiáng)度就代表了模板DNA的拷貝數(shù)。
[0046] 在一些具體實(shí)施方案中，所述內(nèi)標(biāo)探針為：
[0047] R0X-5'-CACCTTCCCCATGGTGTCT-3' -BHQ2 SEQ ID NO: 14
[0048] 在一些具體實(shí)施方案中，酶溶液中含有Taq酶，其為PCR反應(yīng)所必需的且該酶溶液 還含有UNG酶，其中UNG酶（uracil-N-glycosylase)為尿嘧啶-N-糖基化酶，其特點(diǎn)是最 佳活性溫度為50°C，95°C滅活，其作用原理是選擇性水解斷裂含有dU的雙鏈或單鏈DNA中 的尿嘧啶糖苷鍵，形成的有缺失堿基的DNA鏈。在PCR反應(yīng)中，使用UNG酶可預(yù)防非特異性 PCR擴(kuò)增和污染。
[0049] 在一些具體實(shí)施方案中，本發(fā)明檢測試劑盒還包括陽性對照液和空白對照液，設(shè) 置陽性對照和空白對照可監(jiān)測實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)的正常進(jìn)行，所述陽性對照液中含有本發(fā) 明中涉及的 CYP2D6 兩種多態(tài)性CYP2D6*10T，CYP2D6*10C，SULT1A1 兩種多態(tài)性 SULT1A1*2A， SULT1A1*2G的4種質(zhì)粒DNA混合液，該質(zhì)?？蔀楸绢I(lǐng)域技術(shù)人員熟知的質(zhì)粒，這4種質(zhì)粒濃 度相同，均為2500拷貝/ μ 1 ;所述空白對照液為Tris-HCl (IOmM)緩沖液。
[0050] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種用于檢測CYP2D6和SULT1A1基因多態(tài)性的方法， 該方法包括以下步驟：
[0051] (1)設(shè)計(jì)并篩選特異性擴(kuò)增與檢測CYP2D6和SULT1A1基因多態(tài)性的引物組合和探 針組合；制備本發(fā)明的CYP2D6和SULT1A1基因多態(tài)性檢測試劑盒。
[0052] (2)獲得待測樣品基因組DNA ;
[0053] (3)進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增：每個樣本分兩個反應(yīng)管分別檢測CYP2D6和SULT1A1 基因的多態(tài)性，每管中加入特異性引物組和探針組、PCR反應(yīng)緩沖液、Taq酶、UNG酶、內(nèi)標(biāo)系 統(tǒng)，將上述獲得的基因組DNA先后取相同的量加入所述2個反應(yīng)管中并同時(shí)進(jìn)行PCR反應(yīng)。
[0054] 在一些具體實(shí)施方案中，以25 μ 1反應(yīng)體系為例，向反應(yīng)管中加入待檢測樣品后 得到的混合物中各組分終濃度及含量如下：
[0055] PCR 緩沖液 12. 5-15 μ 1 各條引物 0.2 μ M-I μ M 各條探針 0. 1 μ Μ-0. 5 μ M Taq 酶 0· 5 U-L 0 U UNG 酶 0.1 U-0· 5 U 樣品DNA 2 μ 1 加水至 25 μ 1。
[0056] 上述體系僅為示例性，在實(shí)際應(yīng)用中可以按照比例擴(kuò)大或縮小該混合物體積及其 中各組分含量。
[0057] 具體地，在上述25 μ 1反應(yīng)體系中，所述各對引物包括上述步驟（1)中的7條特異 性引物，1對內(nèi)標(biāo)引物，所述各條探針包括上述步驟（1)中的特異性探針，所述樣品為基因 組 DNA。
[0058] 具體地，在步驟（3)中的熒光定量PCR反應(yīng)條件為：
[0059] 37 °C處理10分鐘，95 °C預(yù)變性5分鐘，
[0060] 40個循環(huán)：95°C 15秒，60°C 60秒并收集焚光信號。
[0061] 在上述PCR反應(yīng)后，所得結(jié)果按表1進(jìn)行結(jié)果判定：
[0062] 表1.結(jié)果判定
[0063]
[0064] 本發(fā)明的檢測方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、結(jié)果真實(shí)可信的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)該檢測方 法操作簡單快速，能在90分鐘內(nèi)完成檢測，并且結(jié)果判讀簡單客觀，便于分析。
[0065] 以下通過具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)一步闡述。
[0066] 實(shí)施例1
[0067] 制備本發(fā)明的CYP2D6和SULT1A1基因多態(tài)性檢測試劑盒，包括以下步驟：
[0068] 1.引物及探針合成：
[0069] 設(shè)計(jì)并合成 2 組特異性引物 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3 與 SEQ ID N0:4;SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6 與 SEQ ID N0:7;2 組特異性探針 SEQ ID N0:8 與 SEQ ID N0:9, SEQ ID