一種多樣本多片段dna甲基化高通量測序方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及高通量基因組甲基化DNA檢測領(lǐng)域，尤其涉及一種多樣本多片段DNA 甲基化高通量測序方法。
【背景技術(shù)】
[0002] DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳調(diào)控因子。在哺乳動物細(xì)胞中，DNA甲基化通常 發(fā)生在CpG二核苷酸的胞嘧啶上，形成5甲基胞嘧啶。DNA甲基化的改變，尤其是抑癌基因 啟動子區(qū)的高甲基化在多種腫瘤的形成和發(fā)展過程當(dāng)中起著重要的作用，同時DNA低甲基 化也與癌基因的過表達和染色體的不穩(wěn)定相關(guān)。
[0003] 當(dāng)前，研宄DNA甲基化的方法有基因組整體甲基化檢測的甲基化DNA免疫共沉 淀芯片（microarray analysis following methylated DNA immunoprecipitation, MeMe DIP-chip)、甲基化 DNA 免疫共沉淀測序（sequencing analysis following methylated DNA immunoprecipitation, MeDIP-seq)、簡化的表觀亞硫酸氫鹽測序技術(shù)（reduced representation bisulfite sequencing, RRBS)、重亞硫酸鹽全基因組測序（bisulfite genomic sequencing)和特異基因位點甲基化檢測的傳統(tǒng)的重亞硫酸鹽克隆測序、焦磷酸 測序。其中，單個基因位點DNA甲基化檢測的金標(biāo)準(zhǔn)是重亞硫酸鹽克隆測序，其利用重亞硫 酸鹽將基因組DNA中的未甲基化的胞嘧啶（C)修飾為尿嘧啶（U)，甲基化的胞嘧啶（C)保持 不變，在PCR擴增中，尿嘧啶（U)變成胸腺嘧啶（T)，然后將PCR產(chǎn)物連接到特定載體上，轉(zhuǎn) 化到感受態(tài)細(xì)菌中，挑取10個以上單克隆菌株進行一代測序，根據(jù)參考序列中胞嘧啶位置 C/T的頻率來判斷該位點的甲基化程度。
[0004] 最近有文獻報道了一種新的定量檢測特異片段DNA甲基化的方法，這種方法結(jié)合 了重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化、特異性片段擴增、依賴轉(zhuǎn)座酶的建庫方式和第二代測序，稱為重亞硫酸 鹽擴增子測序（BiSulfite Amplicon Sequencing，BSAS)。這種方法可以對特異基因組區(qū)域 內(nèi)的甲基化胞嘧啶進行精準(zhǔn)的絕對定量。但是該文章中使用的是依賴轉(zhuǎn)座酶的建庫方式， 使用Illumina公司的Nextera XT建庫試劑盒，使用雙向標(biāo)簽序列Index，每個測序芯片上 可以最多同時檢測96個樣本。
[0005] 重亞硫酸鹽克隆測序方法是一種可靠性和精確度很高的方法，能明確目的片段中 每一個CpG位點的甲基化狀態(tài)，但是不足之處是至少要測序10個以上克隆才能獲得可靠數(shù) 據(jù)，過程較為繁瑣，耗時耗資過多。
[0006] BSAS的缺點是對于PCR產(chǎn)物使用轉(zhuǎn)座酶酶切以后，就不能檢測PCR產(chǎn)物兩端被酶 切掉序列的甲基化狀態(tài)；每個樣本需要構(gòu)建一個文庫。而且，還有文獻報道擴增子測序中會 出現(xiàn)等位基因間PCR重組的現(xiàn)象。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 針對上述重亞硫酸鹽擴增子測序中存在的問題，本發(fā)明提供了一種針對多樣本多 片段的DNA甲基化高通量檢測方法，該方法能夠在一個文庫中同時分析多個樣本、多個目 標(biāo)片段的DNA甲基化狀態(tài)，片段長度可以達到500bp左右，并且PCR重組發(fā)生率低，該方法 還具有起始樣本量少、針對性強、成本低、充分利用測序通量等優(yōu)點。
[0008] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：
[0009] -種多樣本多片段DNA甲基化高通量測序方法，其特征在于包括以下步驟：步驟 一：提取基因組DNA，對基因組DNA進行重亞硫酸鹽處理，然后對處理好的基因組DNA進行 PCR擴增，其中針對不同基因片段使用不同的PCR引物，相同的基因片段使用標(biāo)簽序列區(qū)分 不同的樣本；
[0010] 步驟二：將步驟一中不同的PCR產(chǎn)物進行混合，使用混合好的PCR產(chǎn)物進行測序文 庫制備；
[0011] 步驟三：對測序文庫進行QPCR質(zhì)檢定量；
[0012] 步驟四：上機測序，對不同樣本特異性片段甲基化狀況進行高精度分析。
[0013] 為優(yōu)化上述技術(shù)方案，具體措施還包括：
[0014] 上述樣品基因組DNA可以來源于任意物種，包括但不限于動物、植物、昆蟲的基因 組 DNA。
[0015] 上述步驟1中PCR引物針對不同基因、不同的擴增區(qū)域設(shè)計，片段長度可以達到 500bp左右（最長片段長度大于500bp);同時在上下游PCR引物的5'端分別加上3個堿基 以上的標(biāo)簽序列，含不同標(biāo)簽序列的上下游引物分別組合用以區(qū)分不同的樣本。
[0016] 上述步驟一中進行PCR擴增所使用的聚合酶包括針對重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)換后的DNA的 熱啟動taq酶、常規(guī)的r-taq酶或其它聚合酶擴增，優(yōu)選的是針對重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)換后的DNA 的熱啟動taq酶；還包括對擴增產(chǎn)物進行1. 5%的瓊脂糖膠電泳純化的步驟。
[0017] 還包括將純化回收的產(chǎn)物定量，然后將不同樣本的產(chǎn)物按照相同的摩爾數(shù)混合， 得到混合的PCR產(chǎn)物的步驟。
[0018] 上述對步驟二的文庫制備利用如下步驟進行：
[0019] 步驟1，對混合后的PCR產(chǎn)物進行定量，優(yōu)選熒光定量的方法，取50ng進行文庫制 備；
[0020] 步驟2,將混合的PCR產(chǎn)物進行3'末端修復(fù)和3'末端添加堿基A ;優(yōu)選通過T4聚 核苷酸激酶、Klenow片段聚合酶、Klenow片段（3' -5' exo_)聚合酶、dNTP、dATP的作用同 時進行3'末端修復(fù)和3'末端添加堿基A ;
[0021] 步驟3,，將3'末端添加堿基A的產(chǎn)物連接測序接頭，獲得測序接頭連接產(chǎn)物；3' 末端添加上堿基A的產(chǎn)物，通過優(yōu)選的T4DNA連接酶的作用，與測序通用的接頭進行連接， 得到接頭連接效率高的連接產(chǎn)物；
[0022] 步驟4,將測序接頭連接產(chǎn)物進行PCR擴增，其中PCR循環(huán)數(shù)為6輪，獲得測序文 庫；
[0023] 還包括對文庫制備中各步驟的產(chǎn)物進行純化回收的步驟，純化方法包括但不限于 磁珠純化、純化柱純化、2 %瓊脂糖膠電泳純化，優(yōu)選磁珠純化。
[0024] 本發(fā)明還提供了根據(jù)上述的方法建立的測序文庫。
[0025] 本發(fā)明還提供了根據(jù)上述的方法檢測多個樣本、多個目標(biāo)片段的DNA甲基化狀 ??τ O
[0026] 針對重亞硫酸鹽擴增子測序中存在的問題，本發(fā)明提供了一種針對多樣本多片段 的DNA甲基化高通量檢測方法，該方法能夠在一個文庫中同時分析多個樣本、多個目標(biāo)片 段的DNA甲基化狀態(tài)，片段長度可以達到500bp左右，并且PCR重組發(fā)生率低，該方法還具 有起始樣本量少、針對性強、成本低、充分利用測序通量等優(yōu)點。
【附圖說明】
[0027] 圖1顯示了實施例中所有樣本在CDH13片段內(nèi)每個胞嘧啶位點甲基化的水平。
[0028] 圖2顯示了實施例中所有樣本在SEPT9片段內(nèi)每個胞嘧啶位點甲基化的水平。
【具體實施方式】
[0029] 本發(fā)明的主要技術(shù)流程：提取基因組DNA，然后對基因組DNA進行重亞硫酸鹽處 理，然后對處理好的基因組DNA進行PCR擴增，其中針對不同基因片段使用不同的PCR引 物，相同的基因片段使用標(biāo)簽（barcode)序列區(qū)分不同的樣本，然后將不同的PCR產(chǎn)物進行 混合，混合好的PCR產(chǎn)物進行測序文庫的制備，然后對文庫進行QPCR質(zhì)檢定量，然后上機測 序，最后進行不同樣本特異性片段甲基化狀況的高精度分析。
[0030] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，其中樣品基因組DNA可以來源于任意物種，包括但不限于 動物、植物、昆蟲的基因組DNA。
[0031] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，將抽提的基因組DNA進行重亞硫酸鹽處理，如利用EZ DNA Methylation-Gold KitTM(ZYMO)使非甲基化胞喃啶轉(zhuǎn)化為尿喃啶。
[0032] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，其中PCR引物首先針對不同基因、不同的擴增區(qū)域設(shè)計，片 段長度最長可達500bp左右；其次在上下游PCR引物的5'端分別加上3個堿基以上的標(biāo)簽 (barcode)序列，含不同barcode的上下游引物分別組合用來區(qū)分不同的樣本。
[0033] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，將區(qū)分樣本的引物組合設(shè)計好以后，以重亞硫酸酸鹽轉(zhuǎn)化 后的DNA為模板進行PCR擴增，其中所使用的聚合酶包括針對重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)換后的DNA的 熱啟動taq酶、常規(guī)的r-taq或其它聚合酶擴增，優(yōu)選的是針對重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)換后的DNA的 熱啟動taq酶；對擴增產(chǎn)物進行1. 5%的瓊脂糖膠電泳純化。
[0034] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，將純化回收的產(chǎn)物使用NanoD