rop2000 (Thermo Fisher)定 量，然后將不同樣本的產(chǎn)物按照相同的摩爾數(shù)混合，得到混合的PCR產(chǎn)物。
[0035] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，其中文庫(kù)制備的步驟如下：
[0036] 步驟一對(duì)混合的PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量，并取50ng進(jìn)行如下步驟建庫(kù)；
[0037] 對(duì)混合后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量，優(yōu)選熒光定量的方法，如Qubit? 2. 0熒光定量?jī)x (Invitrogen)，取50ng進(jìn)行如下所述步驟建庫(kù)；
[0038] 步驟二將混合的PCR產(chǎn)物進(jìn)行3'末端修復(fù)和3'末端添加堿基A ;
[0039] 混合后的PCR產(chǎn)物，通過(guò)優(yōu)選的T4聚核苷酸激酶、Klenow片段聚合酶、Klenow片 段（3' -5' exo-)聚合酶、dNTP、dATP的作用同時(shí)進(jìn)行3'末端修復(fù)和3'末端添加堿基A ;
[0040] 步驟三將3'末端添加堿基A的產(chǎn)物連接測(cè)序接頭，以便獲得測(cè)序接頭連接產(chǎn)物；
[0041] 3'末端添加上堿基A的產(chǎn)物，通過(guò)優(yōu)選的T4DNA連接酶的作用，與測(cè)序通用的接頭 進(jìn)行連接，以便得到接頭連接效率高的連接產(chǎn)物；
[0042] 步驟四將測(cè)序接頭連接產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中PCR循環(huán)數(shù)為6輪，獲得測(cè)序文 庫(kù)；
[0043] 以接頭連接后的產(chǎn)物為模板，使用Illumina公司通用的建庫(kù)PCR引物，包括一條 通用的上游引物，和一條帶有標(biāo)簽（Index)序列的下游引物，使用高效的PCR擴(kuò)增酶進(jìn)行 PCR，其中PCR循環(huán)數(shù)選擇6輪。使用帶有標(biāo)簽（Index)序列的引物進(jìn)行PCR以后，可以將 不同來(lái)源的文庫(kù)進(jìn)行混合，然后上機(jī)測(cè)序。
[0044] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，為了有效提高建庫(kù)各步驟中的產(chǎn)物純度、減少雜質(zhì)干擾、有 利于后續(xù)步驟的進(jìn)行，可以對(duì)文庫(kù)制備中各步驟的產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，純化方法包括但不 限于磁珠純化、純化柱純化、2%瓊脂糖膠電泳純化，優(yōu)選磁珠純化。
[0045] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，使用QPCR的方法對(duì)測(cè)序文庫(kù)進(jìn)行質(zhì)檢定量，其中使用 Illumina phix control kit v3 作為標(biāo)準(zhǔn)品。
[0046] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，通過(guò)二代測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，優(yōu)選Illumina Miseq平臺(tái)， Miseq的測(cè)序讀長(zhǎng)可以達(dá)到2*300,因此我們的目標(biāo)片段長(zhǎng)度可達(dá)500bp左右。
[0047] 為了進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，下面結(jié)合本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例作進(jìn)一步詳細(xì) 描述：
[0048] 1、提取基因組DNA
[0049] 樣本為臨床全血樣本，DNA 抽提米用 High Pure PCR Template Preparation Kit (Roche)，具體步驟如下：
[0050] a)第一次使用新的試劑盒時(shí)：
[0051] i.用4. 5ml的無(wú)菌水完全溶解蛋白酶K粉末，使用完畢后放于-20°C儲(chǔ)存；
[0052] ii.向裝有Wash-buffer的瓶子中加入80ul的無(wú)水乙醇，并混勾；
[0053] b)將 Elution Buffer 于 7〇 度預(yù)熱；
[0054] c)取 I. 5ml 離心管，加入 200ul 血樣，200ul Binding Buffer，40ul Proteinase K，立即70度溫浴十分鐘；
[0055] d)加入IOOul異丙醇并混合完全；
[0056] e)將一個(gè)High Filter Tube插入一個(gè)收集管中，用移液管移取樣品到過(guò)濾管的上 層緩沖液池中，8000 Xg.離心Imin ;
[0057] f)從收集管中取下過(guò)濾管，棄濾液和收集管，將過(guò)濾管和一個(gè)新的收集管組裝起 來(lái)，加入500ul Inhibitor Removal Buffer到過(guò)濾管的上層緩沖液池中，8000Xg離心 Imin ；
[0058] g)從收集管中取下過(guò)濾管，棄濾液和收集管，將過(guò)濾管和一個(gè)新的收集管組裝起 來(lái)，加入500ul Wash Buffer到過(guò)濾管的上層緩沖液池中，8000Xg.離心Imin;
[0059] h)從收集管中取下過(guò)濾管，棄濾液和收集管，將過(guò)濾管和一個(gè)新的收集管組裝起 來(lái)加入500ul Wash Buffer到過(guò)濾管的上層緩沖液池中，8000Xg.離心Imin;
[0060] i)棄濾液，并額外全速離心整個(gè)High Filter TubelOs，棄收集管；
[0061] j)將過(guò)濾管插入一個(gè)新的無(wú)菌的I. 5ml微型離心管，加入70 μ 1預(yù)熱的Elution Buffer至過(guò)濾管的上層緩沖液池中，8000Xg.離心lmin，即得到基因組DNA。
[0062] 2、重亞硫酸鹽處理基因組DNA
[0063] 采用 EZDNA Methylation-Gold KUtm(ZYMO)試劑盒，具體步驟如下：
[0064] a) CT Conversion Reagent 的制備：添加 900ul 水，50ul 的Μ-Dissolving Buffer， 和300ul的M-Dilution Buffer到一管CT Conversion Reagent中，在室溫下溶解并且在 搖床上搖動(dòng)IOmin ;
[0065] b)M-WASH BUFFER的制備：加入24ml無(wú)水乙醇至M-WASH BUFFER瓶中，并在瓶蓋 上做好標(biāo)記；
[0066] c)在PCR管中添加：
[0067] ① DNA量500ng，根據(jù)濃度算好體積，用水來(lái)補(bǔ)至20 μ 1
[0068] ② 130ul 的 CT Conversion Reagent
[0069] 輕彈試管或移液器操作來(lái)混合樣品；
[0070] d)將樣品管放到循環(huán)變溫器并按以下步驟操作：
[0071] ① 98°C放置 IOmin
[0072] ② 64。〇放置2.511
[0073] e)將柱子放入 Collection Tube 中，并加入 600ul 的 M-Binding Buffer，并將步 驟2的樣品加入到柱子中，蓋上蓋子將柱顛倒數(shù)次來(lái)混合樣品；
[0074] f)全速（>10, OOOx g)離心 30sec，棄廢液；
[0075] g)添加 200ul 的 M-Wash Buffer 到柱中，全速離心 30sec ;
[0076] h)添加 2OOul 的 M-Desphonation Buffer 到柱中并且在室溫（2〇°C _3〇°C )下放 置 15-20min ;
[0077] i)全速離心30sec，棄廢液；
[0078] j)加 200ul 的 M-Wash Buffer 到柱中，全速離心 30sec ;
[0079] k)再添加 200ul 的 M-Wash Buffer 并且離心 30sec ;
[0080] 1)直接添加 IOul的M-Elution Buffer到柱基質(zhì)中，將柱放置在I. 5ml的管中，全 速離心來(lái)洗脫DNA。
[0081] 3、針對(duì)不同基因片段和樣本使用不同的PCR引物擴(kuò)增
[0082] 本實(shí)施例中，采用兩個(gè)基因片段，基因名稱分別為⑶H13和SEPT9,均為人源的基 因，引物序列如下表：
[0085] 本實(shí)例中，針對(duì)108個(gè)樣品檢測(cè)上述兩個(gè)基因片段的DNA甲基化，采用3個(gè)堿基的 標(biāo)簽序列區(qū)分樣本，因此上下游分別有11個(gè)標(biāo)簽序列，每個(gè)樣本有唯一的上下游標(biāo)簽序列 組合。所使用的標(biāo)簽序列如下表：
[0086]
[0087] PCR擴(kuò)增體系為：
[0088]
[0090] PCR反應(yīng)條件：
[0091]
[0092] PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用I. 5%的瓊脂糖膠電泳膠回收，膠回收試劑盒采用GeneJET Gel Extraction Kit(Thermo)試劑盒，最后20ul洗脫產(chǎn)物。
[0093] 4、PCR產(chǎn)物混合
[0094] 取Iul凝膠回收的產(chǎn)物用NanoDrop2000 (Thermo Fisher)定量，然后將不同樣本 的產(chǎn)物按照相同的摩爾數(shù)混合，得到混合的PCR產(chǎn)物。
[0095] 5、文庫(kù)制備
[0096] 步驟一對(duì)混合后的PCR產(chǎn)物使用Qubit? 2. 0 (Invitrogen)進(jìn)行定量，取50ng建 庫(kù)；然后對(duì)50ng待建庫(kù)的DNA使用Agencourt AMPure XP beads純化，具體步驟如下：
[0097] a)將 AMPure XP beads 置于室溫下至少 30min ;
[0098] b)向I. 5mL