一種羊奶中摻雜牛奶或豆?jié){的快速檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及食品安全檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體是羊奶中摻雜牛奶或豆?jié){的快速檢測試 劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 據(jù)營養(yǎng)學(xué)專家介紹，羊奶在國際營養(yǎng)學(xué)界被稱為"奶中之王"，羊奶中含有的維生 素和微量元素都明顯的高于牛奶，美國、歐洲的部分國家均把羊奶視為營養(yǎng)佳品，在歐洲鮮 羊奶的售價是牛奶的7倍。羊奶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)構(gòu)成與人奶的基本相同，含有大量的乳清蛋 白，且不含牛奶中的某些可致過敏的異性蛋白。因此，任何體質(zhì)的嬰兒，特別是胃腸較弱、體 質(zhì)較差的嬰兒都可以接受羊奶。近年來，羊奶制品在市場上得到了消費者的認(rèn)可，不少消費 者選擇了喝羊奶，且羊奶制品的價格也高于普通的牛奶制品。在市場利益的驅(qū)動下，一些沒 有羊奶資源的企業(yè)也紛紛推出了羊奶制品，一時間市場上真假羊奶制品難辨。有些企業(yè)在 羊奶中摻入牛奶或者豆?jié){，冒充羊奶，嚴(yán)重侵害了消費者的利益。我國乳品工業(yè)與發(fā)達國家 的差距仍然十分明顯，質(zhì)量參差不齊，尤其是液態(tài)奶、奶粉及奶制品中摻假現(xiàn)象非常普遍， 摻假手段多種多樣，不斷變換，而我國摻假檢測環(huán)節(jié)十分薄弱。在這樣嚴(yán)峻的情況下，我國 奶業(yè)想得到健康的發(fā)展，就迫切需要解決上述問題，需要對大量的液態(tài)奶，奶粉及奶制品等 進行實時快速的摻假測定。所以開發(fā)一種快速有效的檢測摻假問題的試劑盒勢在必行。
[0003] 目前常用的檢測技術(shù)主要有：感官鑒評、傳統(tǒng)實驗、近紅外光譜技術(shù)檢測、ELISA 法等。這些方法存在靈敏度低、準(zhǔn)確率不高、重復(fù)性差等缺點。以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)為 基礎(chǔ)的技術(shù)已逐步成為了食品中動物源性成分種屬鑒定的核心方法。近年來實時熒光PCR 技術(shù)的飛速發(fā)展大大提高了食品中物種鑒別的效率和靈敏度，并使得成分含量的定量溯源 成為可能。在目標(biāo)基因選擇方面，動物細胞線粒體基因組DNA序列既具有高度物種特異性 可變區(qū)，又具有保守性的保守區(qū)，這樣只需在相對保守區(qū)設(shè)計一對通用引物，在可變區(qū)設(shè)計 相應(yīng)特異探針，能夠保證檢測過程中不會出現(xiàn)物種間非特異性擴增而導(dǎo)致交叉和干擾，此 外目前對羊奶中同時檢測牛奶和豆?jié){成分的熒光定量PCR檢測研究還沒報到，因此，建立 一種帶有擴增內(nèi)標(biāo)的羊奶和牛奶及豆?jié){源性熒光定量PCR檢測方法將對羊奶、牛奶及奶制 品安全的快速監(jiān)管具有重要的創(chuàng)新性實踐意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種快速準(zhǔn)確檢測羊奶中是否摻雜牛奶或豆?jié){的檢測試劑 盒。
[0005] 為實現(xiàn)上述目的，該試劑盒包括一對羊奶和牛奶共用引物，豆?jié){特異引物及對應(yīng) 的3種檢測探針，其中還有一條人工合成外源性內(nèi)參序列及相應(yīng)引物和探針。
[0006] 本發(fā)明從牛、山羊或綿羊及豆?jié){的線粒體基因組DNA(mtDNA)的16SrRNA基因序列 的物種特異性出發(fā)，探索并完善一種快速準(zhǔn)確檢測羊奶中是否摻雜牛奶或豆?jié){的檢測試劑 盒。
[0007] 分子信標(biāo)具有高靈敏性，高特異性、相較于TaqMan探針熒光本底低，不僅可以用 于基因的定量、定性檢測，還可以應(yīng)用到基因點突變等分析，基于這些優(yōu)點，本試劑盒采用 分子信標(biāo)探針（MB)法4重多色熒光定量PCR檢測技術(shù)，同時能檢測牛奶，羊奶及豆?jié){三種 成分，而且本試劑盒中加入外源性內(nèi)參作為內(nèi)標(biāo)，可有效避免因樣本含有PCR抑制物而產(chǎn) 生的假陰性結(jié)果。
[0008] 本試劑盒包括：PCR緩沖液、MgC12和dNTPs的反應(yīng)混合物，Taq酶，超純水，高特 異性擴增的牛、羊及大豆引物混合物，對上述物種進行特異檢測的探針混合物，以及內(nèi)標(biāo)引 物，人工構(gòu)建內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒及探針混合物。
[0009] 本試劑盒在引物設(shè)計方面：根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中查找牛、山羊和綿羊線粒體基因 組上的16SrRNA基因序列，以及大豆kti-s(GI :510514)基因序列，應(yīng)用同源分析工具 Clastaw軟件對其同源性比對，利用引物設(shè)計軟件Primerf. 0根據(jù)篩選出的核心片段兩端 相似序列設(shè)計一對通用引物，使用BeaconDesigner2. 0設(shè)計特異分子信標(biāo)（MB)探針，將 設(shè)計好的探針和引物在NCBI數(shù)據(jù)庫中BLAST分析其特異性，進一步用在線軟件（http:// mfold. rna. albany. edu/ ? q = mfold)確定其二級結(jié)構(gòu)。探針分別采用4種不同發(fā)光基團 對各個探針的5'端進行熒光素修飾，牛奶探針（NP)用CY3標(biāo)記，羊奶探針（YP)用JOE標(biāo) 記，豆楽探針LectinP用FAM標(biāo)記，內(nèi)標(biāo)探針（IACP)用ROX標(biāo)記，3'端的淬滅基團用Dabcyl 修飾。
[0010]用于快速準(zhǔn)確檢測羊奶中是否摻雜牛奶或豆?jié){的引物為：
[0011] 大豆特異引物：
[0012] LectinF :5' CTCTACTCCACCCCCATCCACAT-3'
[0013] LectinR :5, AGAAAGAAGGCAAGCCCATCTG-3'
[0014] 牛奶、羊奶通用特異引物：
[0015] UF : 5，AAGACGAGAAGACCCTTGGACTTTA-3 '
[0016] UR : 5，GATTGCGCTGTTATCCCTAGGGTA-3 '
[0017] 內(nèi)參引物：
[0018] IACF: 5，AgACCACCAAATgCCCCTATC-3 '
[0019] IACR: 5，CgAgATTgAgATCTTCTgCgAC-3，
[0020] 用于快速準(zhǔn)確檢測羊奶中是否摻雜牛奶或豆?jié){的探針為：
[0021] 牛奶（NP):
[0022] 5, CGAGCGATAGAGTGATTTGACTTGTGGGTCGCTCG-3'
[0023] 羊奶（YP) :5' CGTCCAAAAGAAATAAATTTAACCACTGGACG-3'
[0024] 豆?jié){（LectinP) :5, CGCCGCTTCCTTCAACTTCACGCGGCG-3'
[0025] 內(nèi)參（IACP) :5, -gCgAggTCCCCTAgAAgAAgAACTCCCTCgC-3，
[0026] 本發(fā)明所用PCR復(fù)合擴增反應(yīng)的條件：優(yōu)先選用20ul的PCR擴增體系包括pH值 為8. 9,鎂離子濃度為2. 5mM，4種dNTP的終濃度各為250 μ M，Taq酶的用量為0. 2U/μ L，引 物探針混合物中的引物、探針的終濃度為0. 4μΜ，及l(fā)pg/ul的內(nèi)標(biāo)DNA。
[0027] 20ul反應(yīng)體系如下：
[0028] 試劑名稱 I濃度 I用量UlT
[0029] 使用所述的試劑i進行PCR擴'時，擴增k段反應(yīng)可任何型號的熒光定量PCR 儀上進行，擴增程序：95°C Imin ;45個循環(huán)，95°C 5s，60°C 34s，在此收集熒光信號。
[0030] 其中所檢測牛奶，羊奶及奶粉的基因組DNA提取方法首次采用Chelex-IOO加熱釋 放DNA及玻璃奶純化基因組DNA的辦法進行提取，具體實施步驟如下
[0031] 1、白細胞收集
[0032] ①取牛奶或羊奶2ml，或者奶粉20mg溶于2ml無菌水中，將樣品于2500r/mln，4°C 離心30分鐘；
[0033] ②棄去離心管的上層乳脂和中間層乳液，保留其底部沉淀，向底部加 lmLPH7. 4
[0034] 滅菌的PBS (磷酸緩沖液），將底部沉淀吹打懸浮并轉(zhuǎn)移至I. 5mL的離心管中，在 3500r/min，常溫（20-25°C )下離心10分鐘，棄去上層液體，保留底部沉淀；
[0035] 2、棄上清后，加入 5% 的 Chelex-100280ul 及 20mg/ml 蛋白酶K20ul，56°C保溫 30min以上。
[0036] 3、高速震蕩 5-10s，100°C煮沸 8min ;
[0037] 4、高速震蕩5_10s，13000r/min離心3min,將上清轉(zhuǎn)移至離心柱中，13000r/min離 心Imin，收集液體
[0038] 5、向收集液體中加入 GlassMilk20ul,加 600ulgDNABindingBuffer,充分混勻， 65°水浴15min，中間要反轉(zhuǎn)幾次；
[0039] 6、室溫放置5min，中間反轉(zhuǎn)幾次；
[0040] 7、4000rpm離心Imin,棄上清，留管底；
[0041] 8、70%酒精5