檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室結(jié)核分枝桿菌微環(huán)境表面污染的方法及其檢測(cè)試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。涉及檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室結(jié)核分枝桿菌微環(huán)境表面污 染的方法，具體涉及檢測(cè)生物安全實(shí)驗(yàn)室與醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室結(jié)核分枝桿菌微環(huán)境表面污染 的方法；尤其涉及檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌RD2區(qū)，該區(qū)域Rvl980c基因相關(guān)的檢測(cè)具有很高的靈 敏性與特異性。本發(fā)明還涉及檢測(cè)Rvl980c基因的方法和試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 據(jù)報(bào)道，從事傳染性病原微生物診斷與研究的工作人員，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行大量活 細(xì)菌培養(yǎng)或接觸感染動(dòng)物的操作過程中，因?qū)嶒?yàn)操作不可避免形成感染性氣溶膠而造成實(shí) 驗(yàn)區(qū)臺(tái)面、個(gè)人防護(hù)裝備的表面等微環(huán)境的污染，從而形成工作人員職業(yè)暴露，容易造成實(shí) 驗(yàn)室獲得性感染（laboratory acquired infection)。
[0003] 結(jié)核病是對(duì)人類公共衛(wèi)生、人類健康及經(jīng)濟(jì)社會(huì)具有很大挑戰(zhàn)的嚴(yán)重且古老的傳 染病，WHO統(tǒng)計(jì)報(bào)道全球結(jié)核病年發(fā)病數(shù)900萬，其中傳染性結(jié)核病人390萬，每年約有 220萬死于結(jié)核病。我國結(jié)核病的年發(fā)病數(shù)占全球14. 3%，位居第二位，2010年結(jié)核病流行 病學(xué)抽樣調(diào)查結(jié)果估算，全國活動(dòng)性肺結(jié)核患病率為392/10萬，其中傳染性肺結(jié)核患病率 為122/10萬?？刂平Y(jié)核病發(fā)展的有效方案是早期診斷和早期治療，自患者痰標(biāo)本分離培養(yǎng) M. tb是診斷結(jié)核病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)之一，同時(shí)M. tb藥敏試驗(yàn)的結(jié)果是指導(dǎo)臨床用藥的依據(jù)， 因此實(shí)驗(yàn)室操作人員經(jīng)常接觸含有大量活的結(jié)核分枝桿菌的實(shí)驗(yàn)標(biāo)本。
[0004] 研究顯示,結(jié)核分枝桿菌iMercWiasis, M. tb)是引起結(jié)核病的 主要病原，其細(xì)胞壁含有大量的分枝菌酸，對(duì)干燥、理化等因素抵抗能力強(qiáng)，在環(huán)境中長時(shí) 間保持活性與毒力，處于陰暗灰塵中可存活90-120天、痰中可存活6~8個(gè)月。少量M. tb的 吸入（1-10個(gè)細(xì)菌）即可造成肺內(nèi)感染。M.tb在衛(wèi)生部頒布的《人間傳染的病原微生物名 錄》中（2006)，屬第二類高致病性病原微生物，其活菌培養(yǎng)及動(dòng)物感染實(shí)驗(yàn)均需在BSL-3實(shí) 驗(yàn)室中進(jìn)行，臨床樣本的檢測(cè)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)開展。目前M.tb實(shí)驗(yàn)室獲得性感染仍時(shí) 有發(fā)生，提示在進(jìn)行M. tb相關(guān)活動(dòng)中實(shí)驗(yàn)室環(huán)境存在一定程度的污染尚未得到有效控制， 為保障實(shí)驗(yàn)室生物安全，因此實(shí)驗(yàn)室環(huán)境存在的污染環(huán)節(jié)及感染概率尚待重視。
[0005] 據(jù)調(diào)查，實(shí)驗(yàn)室M. tb相關(guān)的從業(yè)人員處于抗擊結(jié)核病的第一線，實(shí)驗(yàn)室獲得性結(jié) 核感染（laboratory acquired M.tb infection)發(fā)生率高，主要感染方式大多是由于實(shí)驗(yàn) 操作不當(dāng)導(dǎo)致M. tb感染性氣溶膠擴(kuò)散于微環(huán)境表面從而造成操作人員的吸入。Tiantao Cheng等利用大量程的粒子計(jì)數(shù)器實(shí)時(shí)檢測(cè)了進(jìn)行M.tb感染動(dòng)物的BSL-3實(shí)驗(yàn)室空氣污染 情況，結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)室核心區(qū)空氣中未檢測(cè)到感染性M. tb粒子。目前對(duì)M. tb實(shí)驗(yàn)室污染 的關(guān)鍵部位，及操作中可能發(fā)生較為嚴(yán)重的污染環(huán)節(jié)尚未見明確報(bào)道，對(duì)于M. tb實(shí)驗(yàn)室微 表面環(huán)境污染及操作中導(dǎo)致污染潛在可能性有待研究。
[0006] 綜上所述，為了控制結(jié)核分枝桿菌實(shí)驗(yàn)室獲得性感染，本領(lǐng)域迫切需要尋求實(shí)驗(yàn) 室微環(huán)境污染檢測(cè)的技術(shù)，并開發(fā)檢測(cè)微環(huán)境表面污染的檢測(cè)的方法、試劑盒，以及相關(guān)的 控制措施。
[0007] 與本發(fā)明相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)：
[1] . RILEY, R. L. , et al. , Air hygiene in tuberculosis: quantitative studies of infectivity and control in a pilot ward. Am Rev Tuberc, 1957. 75(3): p. 420-31.
[2] . Singh, K. , Laboratory-acquired infections. Clin Infect Dis, 2009. 49(1): p. 142-7.
[3] , WHO, WHO Global Tuberculosis Control WHO Report 2010. 2010.
[4] .衛(wèi)生部發(fā)布全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查結(jié)果，2011.。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是提供檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室結(jié)核分枝桿菌微環(huán)境表面污染的方法，具體涉及 檢測(cè)生物安全實(shí)驗(yàn)室與醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室結(jié)核分枝桿菌微環(huán)境表面污染的方法；尤其涉及檢 測(cè)結(jié)核分枝桿菌RD2區(qū)，該區(qū)域Rvl980c基因相關(guān)的檢測(cè)具有很高的靈敏性與特異性。本 發(fā)明還涉及檢測(cè)Rvl980c基因的方法和試劑盒。
[0009] 本發(fā)明提供了一種生物安全實(shí)驗(yàn)室及醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室結(jié)核分枝桿菌微環(huán)境表面 污染的方法，即檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌RD2區(qū)的Rvl980c基因，從而區(qū)別于BCG、恥垢分枝桿菌等 污染。
[0010] 為了特異的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室微環(huán)境表面M. tb的污染，需要選擇M. tb基因組特異性的 基因作為檢測(cè)的祀基因。本發(fā)明根據(jù)在線數(shù)據(jù)庫http://www. tbdb. org的全基因組比對(duì)軟 件Synteny MAP對(duì)M. tb、BCG、M. S全基因組序列進(jìn)行比對(duì)，選擇M. tb基因組DNA差異區(qū) (Region of difference，RD)作為檢測(cè) M. tb DNA 的祀基因。
[0011] 本發(fā)明中，所述的RV1980C基因位于RD2區(qū)序列中，擴(kuò)增的片段為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群 所特有的區(qū)域，從而區(qū)別于BCG、恥垢分枝桿菌等非結(jié)核分枝桿菌的污染。
[0012] 本發(fā)明的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室結(jié)核分枝桿菌微環(huán)境表面污染的方法,其包括：檢測(cè)樣本中 RD2區(qū)域Rvl980c基因的相對(duì)量，以此判斷所采樣區(qū)域結(jié)核分枝感染污染的嚴(yán)重程度。
[0013] 更具體的，本發(fā)明的檢測(cè)方法，其特征在于，其包括步驟：（a)抽提樣品的基因組 DNA，擴(kuò)增獲得Rvl980c基因序列中部分片段區(qū)域；（b)檢測(cè)步驟（a)擴(kuò)增片段的熒光值與 標(biāo)準(zhǔn)品熒光值比較，從而判斷生物實(shí)驗(yàn)室微環(huán)境表面結(jié)核分枝桿菌污染的嚴(yán)重程度。
[0014] 本發(fā)明的檢測(cè)方法尤其適用于檢測(cè)生物安全實(shí)驗(yàn)室與醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室結(jié)核分枝 桿菌微環(huán)境表面污染。
[0015] 本發(fā)明中，所述的擴(kuò)增Rvl980c基因片段引物序列如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示。
[0016] 上述方法中涉及的測(cè)序、擴(kuò)增、抽提基因組DNA等技術(shù)均可采用本領(lǐng)域的常規(guī)操 作方法。例如，所述的擴(kuò)增可以采用實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)；其中，退火的溫度是60攝氏度。循 環(huán)數(shù)為30。
[0017] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，與特異性擴(kuò)增RD2區(qū)Rvl980c片段引物的序列如SEQ ID NO :1 和 SEQ ID NO :2 所示。
[0018] 本發(fā)明證實(shí)了 RD2區(qū)Rv980c基因檢測(cè)可用于生物安全實(shí)驗(yàn)室及醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室 結(jié)核分枝桿菌微環(huán)境表面污染的檢測(cè)，并且具有高特異性與靈敏性。在此基礎(chǔ)上完成了本 發(fā)明。
[0019] 本發(fā)明提供了一種檢測(cè)樣品是否存在結(jié)核分枝桿菌污染及污染嚴(yán)重程度的方法， 包括步驟： (a) 用Rvl980c基因序列特異性引物擴(kuò)增樣品的基因組DNA，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；和 (b) 與提供的標(biāo)準(zhǔn)重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增產(chǎn)物熒光值對(duì)照從而檢測(cè)樣品中結(jié)核分枝桿菌 的相對(duì)量。
[0020] 結(jié)核分枝桿菌RD2區(qū)域基因 Rvl980c位點(diǎn)的詳細(xì)序列可參見網(wǎng)址http://www. ncbi. nlm. nih. gov/中登錄號(hào)為NC_000962. 3的核苷酸序列。
[0021] 本發(fā)明提供了一種檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌基因片段的方法，它包括檢測(cè)結(jié)核