一種用于γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶檢測(cè)的熒光探針及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶檢測(cè)的熒光探針及其制備方法與應(yīng)用，具 體涉及一種用于γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶檢測(cè)的熒光探針及其制備方法和一種γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶 檢測(cè)試劑盒，屬于分子檢測(cè)和分子成像領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] γ -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶是谷氨酰循環(huán)中的關(guān)鍵酶，可特異性催化γ -谷氨酰基的轉(zhuǎn)移 反應(yīng)，在多種生理學(xué)過(guò)程中都發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。在臨床上，γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶是診斷 肝膽疾病的重要指標(biāo)，被廣泛應(yīng)用于肝病及其它臟器疾病的診斷和預(yù)后檢測(cè)。另外，γ-谷 氨酰轉(zhuǎn)肽酶在宮頸癌、卵巢癌、肝癌等癌癥中均出現(xiàn)高表達(dá)，是一種重要的癌癥標(biāo)志物。由 此可見(jiàn)，γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的檢測(cè)具有非常重要的意義。目前商品化的用來(lái)檢測(cè)γ-谷氨 酰轉(zhuǎn)肽酶的試劑盒有基于比色法的ELISA試劑盒以及基于香豆素的熒光檢測(cè)試劑盒，這些 試劑盒存在靈敏度低或分析波長(zhǎng)短等弊端。因此，發(fā)展一種新型的高靈敏性的檢測(cè)γ-谷 氨酰轉(zhuǎn)肽酶的長(zhǎng)波長(zhǎng)熒光探針具有非常大的應(yīng)用價(jià)值。
[0003] 甲酚紫具有高的量子產(chǎn)率和良好的穩(wěn)定性而被廣泛應(yīng)用于生物分析中，而基于甲 酚紫的檢測(cè)γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的高靈敏度熒光探針尚未見(jiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種用于γ -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶檢測(cè)的熒光探針及其制備方法， 還提供了一種γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶檢測(cè)試劑盒，本發(fā)明用于γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶檢測(cè)，操作簡(jiǎn) 便、成本低、檢測(cè)靈敏。
[0005] 本發(fā)明提供的化合物，其結(jié)構(gòu)式為式I。
[0006]
[0007] 本發(fā)明還提供了上述化合物式I的制備方法，該制備方法是先將甲酚紫與 Boc-L-谷氨酸-1-叔丁酯反應(yīng)生成酰胺類(lèi)化合物，然后進(jìn)一步水解得到上述化合物式I ; 包括如下步驟：1)在有機(jī)溶劑I中，將Boc-L-谷氨酸-1-叔丁酯中加入縮合劑活化，然后 再加入甲酚紫醋酸鹽反應(yīng)，得到中間產(chǎn)物；
[0008]
[0009] 2)在有機(jī)溶劑II中，將所述中間產(chǎn)物與脫保護(hù)試劑混合，反應(yīng)即得到所述式I所 示化合物。
[0010] 上述的方法，步驟1)中，所述有機(jī)溶劑I為二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺、四氫呋 喃或甲醇；
[0011] 所述縮合劑為2- (7-偶氮苯并三氮唑）-N，Ν，Ν'，Ν' -四甲基脲六氟磷酸酯（簡(jiǎn)稱(chēng) HATU)和/或N，N-二異丙基乙胺；
[0012] 所述活化的溫度可為0~40 °C，具體可為25 °C，所述活化的時(shí)間可為20~ 200min，具體可為 30min ;
[0013] 加入所述甲酚紫醋酸鹽反應(yīng)的溫度可為0~40°C，具體可為25°C，時(shí)間可為1~ l〇h，具體可為2. 5h ;
[0014] 所述Boc-L-谷氨酸-1-叔丁酯、所述縮合劑與所述甲酚紫醋酸鹽的摩爾比可為1 : 1~4 :1~4,具體可為1 :1 :1 ;
[0015] 步驟2)中，所述有機(jī)溶劑II為二氯甲烷、四氫呋喃、甲醇或乙腈；
[0016] 所述脫保護(hù)試劑為三氟乙酸、甲酸、乙酸或氯化氫，優(yōu)選三氟乙酸；
[0017] 所述脫保護(hù)試劑與中間產(chǎn)物的摩爾比為大于10。
[0018] 所述反應(yīng)的溫度可為0~40°C，具體可為25°C，時(shí)間可為3~24h，具體可為7h。
[0019] 本發(fā)明中，步驟1)結(jié)束之后還包括對(duì)所述中間產(chǎn)物分離純化的步驟，具體可為過(guò) 濾，收集沉淀，然后將沉淀進(jìn)行減壓蒸餾除去溶劑，然后柱層析，得到所述中將產(chǎn)物；
[0020] 步驟2)結(jié)束之后還包括將所述式I所示化合物分離提純的步驟，具體可為先將 所述有機(jī)溶劑II除去，然后依次用乙醚和二氯甲烷萃取，即得到所述式I所示化合物。
[0021] 本發(fā)明式I所述化合物應(yīng)用于制備用于γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶檢測(cè)的熒光探針中，該 熒光探針熒光激發(fā)波長(zhǎng)為585nm和發(fā)射波長(zhǎng)為615nm。
[0022] 本發(fā)明式I所述化合物還應(yīng)用于γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶檢測(cè)和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶成像 中。
[0023] 本發(fā)明還提供了一種γ -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶檢測(cè)試劑盒，它包括γ -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶檢 測(cè)的熒光探針和溶劑組成的熒光探針儲(chǔ)備液；
[0024] 所述γ -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶檢測(cè)的熒光探針為權(quán)利要求1所述化合物。
[0025] 上述的試劑盒中，所述γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶檢測(cè)的熒光探針的摩爾濃度可為0. 01~ 10mM，具體可為0. 25mM ;
[0026] 所述溶劑為水、甲醇和二甲基亞砜中至少一種。
[0027] 本發(fā)明還提供了上述的試劑盒對(duì)Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的檢測(cè)方法，包括如下步驟： 1)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：以585nm為激發(fā)波長(zhǎng)，測(cè)定一系列不同濃度的γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶標(biāo)準(zhǔn)反 應(yīng)液在發(fā)射波長(zhǎng)為615nm處的熒光強(qiáng)度，記為F ;并測(cè)定試劑空白在發(fā)射波長(zhǎng)為615nm處的 熒光強(qiáng)度，記為Ftl，以γ -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的濃度C為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度變化值Λ F為縱坐標(biāo)， 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；
[0028] 其中，AF = F-Fci;所述一系列不同濃度的γ -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)液由所述 γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶試劑盒中的熒光探針儲(chǔ)備液、γ -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液和緩沖 液混勻組成；
[0029] 2)檢測(cè)待測(cè)樣品中γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的含量：將上述步驟1)中所述γ-谷氨酰 轉(zhuǎn)肽酶標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液替換為待測(cè)樣品，按照上述步驟1)所述方法檢測(cè)所述待測(cè)樣品在發(fā) 射波長(zhǎng)為615nm處的熒光強(qiáng)度，記為F'，同時(shí)測(cè)定試劑空白在發(fā)射波長(zhǎng)為615nm處的熒光強(qiáng) 度，記為匕'，將（F'-F;)帶入上述步驟1)所得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，即得到所述待測(cè)樣品中γ-谷氨 酰轉(zhuǎn)肽酶的含量。
[0030] 上述的檢測(cè)方法，所述一系列不同濃度的γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)液中，所述 γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的濃度可為1~50U/L，具體濃度依次可為1、5、10、25、40和50U/L ;
[0031 ] 所述緩沖液為pH在6~9之間磷酸鹽緩沖液，所述磷酸鹽為Na2HP04、NaH 2PO4* KH2PO4中的至少一種，所述磷酸鹽的濃度為0. 01~0. 5M，優(yōu)選為0.0 lM ;
[0032] 所述一系列不同濃度的γ -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)液的體積均為2mL ;
[0033] 所述一系列不同濃度的γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)液中，所述熒光探針儲(chǔ)備液的 摩爾濃度可為〇. 01~1〇禮，具體可為250 μ Μ，體積均為80 yL ;
[0034] 所述γ -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液由所述γ -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶溶于水中配成， 其濃度為50000U/L。
[0035] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了上述的試劑盒在γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶檢測(cè)及生物樣品分析中 的應(yīng)用。
[0036] 上述的應(yīng)用，所述生物樣品為血清或細(xì)胞，本發(fā)明可對(duì)血清或細(xì)胞中γ-谷氨酰 轉(zhuǎn)肽酶進(jìn)行定量分析；
[0037] 所述試劑盒在使用時(shí)，所述Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶檢測(cè)的熒光探針的測(cè)試濃度可為 100ηΜ-20 μ Μ，具體可為 10 μ Μ。
[0038] 本發(fā)明制備出了基于甲酚紫的長(zhǎng)波長(zhǎng)的熒光探針（式I )，該探針可選擇性地被 γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶水解從而實(shí)現(xiàn)對(duì)該酶的測(cè)定；而且，本發(fā)明探針（式I )制備的試劑盒能 用于血清及細(xì)胞中γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的檢測(cè)。
[0039] 本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0040] 1、本發(fā)明熒光探針是橙色的固體，在溶液中呈淺黃色，與γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶反應(yīng) 后，肉眼即可觀察到溶液變?yōu)槊黠@的粉紫色。
[0041] 2、本發(fā)明具有長(zhǎng)的熒光激發(fā)波長(zhǎng)（585nm)和發(fā)射波長(zhǎng)^15nm)
[0042] 3、本發(fā)明對(duì)γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的響應(yīng)呈線(xiàn)性關(guān)系，可以用于該酶的定量測(cè)定。
[0043] 4、本發(fā)明應(yīng)用時(shí)顯色反應(yīng)僅在γ -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶存在的條件下發(fā)生，其它常見(jiàn)的 無(wú)機(jī)鹽、氨基酸、水解酶等均不產(chǎn)生干擾。
[0044] 5、本發(fā)明化合物溶解性好，其用有機(jī)溶劑配成的母液試劑盒可直接用于緩沖體系 中γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的檢測(cè)。
[0045] 6、靈敏度高，選擇性好，可用于血清中γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的定量分析。
[0046] 7、本發(fā)明具備好的生物相容性，可用于細(xì)胞或細(xì)胞中γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的檢測(cè)； 因此，該探針是一種優(yōu)良的可廣泛用于γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶檢測(cè)的分析試劑。
[0047] 8、本發(fā)明具有操作簡(jiǎn)便，成本低，快速，靈敏等優(yōu)點(diǎn)，易于推廣和應(yīng)用。
【附圖說(shuō)明】
[0048] 圖1為本發(fā)明式I所示化合物的化學(xué)反應(yīng)方程式與合成路線(xiàn)。
[0049] 圖2為本發(fā)明試劑盒對(duì)γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的紫外可見(jiàn)吸收及顏色響應(yīng)圖，其中圖 2a為式I所示化合物（10 μ Μ)的吸收光譜，圖2b為式I所示化合物（10 μ Μ)與γ -谷氨酰 轉(zhuǎn)肽酶（50U/L)反應(yīng)后的吸收光譜。
[0050] 圖3為本發(fā)明試劑盒對(duì)不同濃度γ -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的熒光響應(yīng)圖，圖3中γ -谷 氨酰轉(zhuǎn)肽酶的濃度從下到上依次為〇, 1，5, 10, 20, 25, 30, 40, 50, 75和100U/L。
[0051] 圖4為本發(fā)明試劑盒的熒光增量對(duì)γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶濃度的工作曲線(xiàn)。
[0052] 圖5為本發(fā)明試劑盒分別用于ΝΙΗ-3Τ3和HepG2細(xì)胞的共聚焦成像圖。
[0053] 圖6為本發(fā)明試劑盒分別用于正常培養(yǎng)的H印G2細(xì)胞以及預(yù)先與抑制劑孵育過(guò)的 HepG2細(xì)胞的共聚焦成像圖。
【具體實(shí)施方式】
[0054] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0055] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0056] 實(shí)施例1、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶檢測(cè)的熒光探針（式I )的制備
[0057] 按照?qǐng)D1所示的化學(xué)反應(yīng)流程圖進(jìn)行制備。
[0058] 步驟1):將151mg Boc-L-谷氨酸-1-叔丁醋（0. 5mmol)溶于5mL二氯甲燒中， 加入190mg HATU(0.5mmol)及200 yL N，N-二異丙基乙胺混合，繼續(xù)攪拌30分鐘后，加入 160mg甲酚紫醋酸鹽（0. 5mmol)，25°C下繼續(xù)反應(yīng)2. 5小時(shí)，過(guò)濾，濾液減壓蒸干，得到的粗 產(chǎn)品。用柱層析分離（硅膠G，200-300目）提純得到中間產(chǎn)物，中間產(chǎn)物為橙色固體。
[0059] 結(jié)構(gòu)確證結(jié)果如下！1H NMR (400MHz, 298K, DMS0-d6) : δ 10. 45 (s, 1H)，8. 59 (d, 1H，J =7. 2Hz), 8. 14 (d, 1H, J = 6. 8Hz), 7. 88 (m, 4H), 7. 48 (m, 1H), 7. 19 (d, 1H, J = 8. 0Hz), 6. 40 ( s，1H)，3· 90 (m，1H)，2· 07 (m，4H)，I. 42 (s，9H)，I. 40 (s，9H) · ESI-MS (m/z) : 547. 3, C30H35N4O6'
[0060] 步驟2):將53mg中間產(chǎn)物溶于6mL二氯甲烷中，逐滴滴入2mL三氟乙酸。室溫 下反應(yīng)7小時(shí)后，減壓蒸干，得到的粗產(chǎn)品用乙醚和二氯甲烷各洗三次，得到最終產(chǎn)物（式 I )，產(chǎn)品為橙色固體。
[0061] 結(jié)構(gòu)確證結(jié)果如下：? NMR(600MHz, 298K, CF3COOD) : δ 9. 13 (s, 1H)，