一種高產(chǎn)猴頭菌誘變菌株h07及制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及到一種高產(chǎn)猴頭菌誘變菌株H07及制備方法，為一種新的菌株品種， 本發(fā)明還提供了該菌株的培育方法，屬于生物發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 猴頭菌屬于一種藥食兩用真菌，在分類學(xué)上隸屬真菌界，擔(dān)子菌門，擔(dān)子菌綱，猴 菇目，猴菇科。猴頭菌所含有的營養(yǎng)成分與目前人工栽培的其他食用菌相比都居第一、二 位。對(duì)猴頭菌的基礎(chǔ)與臨床應(yīng)用研究證實(shí)猴頭菌擁有可靠的藥效。它具有營養(yǎng)神經(jīng)作用， 治療消化道疾病，抗腫瘤，并有促進(jìn)人體新陳代謝，提高免疫力，增強(qiáng)人體抗病的活性能力。 因?yàn)槠涠靖弊饔蒙?，藥效可靠，所以它具有很大的開發(fā)利用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是提供一株猴頭菌誘變菌株H07,為一種新的菌株，其菌絲體干重及 有效成分多糖、腺苷、蛋白質(zhì)的產(chǎn)量和原始菌株相比具有顯著提高。
[0004] 本發(fā)明還提供了該菌株的培育方法，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0005] 本發(fā)明所述的猴頭菌誘變菌株H07:于2014年12月26日在中國典型培養(yǎng)物保 藏中心保藏，保藏地址：武漢大學(xué)，分類名稱：猴頭菌H07 Hericium erinaceus H07 ;保藏登 記號(hào)為 CCTCC NO :M 2014669。
[0006] 本發(fā)明所述的猴頭菌誘變菌株H07,用以下方法誘變選育而制得，以猴頭菌（CICC 14026)為出發(fā)菌株，采用化學(xué)誘變處理技術(shù)，選育出高產(chǎn)的猴頭菌高產(chǎn)突變菌株H07。
[0007] 猴頭菌誘變菌株H07的特征為：菌絲體干重、多糖、腺苷和蛋白質(zhì)的含量均有明顯 提高，其中菌絲體干重較原出發(fā)菌株提高了 73%，腺甘含量提高了 20%，蛋白質(zhì)含量提高了 51%，多糖含量提高了 69%。
[0008] 該猴頭菌誘變菌株H07菌絲生長快速，菌絲體為乳白色，可進(jìn)行快速液體深層培 養(yǎng)，該菌株的液體深層發(fā)酵特征如下： (1) 一級(jí)斜面菌種 斜面培養(yǎng)基：葡萄糖 18~20g/L，胰蛋白陳 18~20g/L，KH2P042~3g/L，MgSO4. 7H20 I. 0~2· Og/L，維生素 B10.0 5~0· lg/L，瓊脂 15. 0~18· Og/L ; 斜面菌種培養(yǎng)溫度26 ± I °C，3~5天菌絲長滿斜面，放冰箱（2~4°C )保存?zhèn)溆茫?(2) 二級(jí)搖瓶菌種 種子培養(yǎng)基：葡萄糖 18~20g/L，胰蛋白陳 18~20g/L，KH2P042~3g/L，MgSO4. 7H20 I. 0~2· Og/L，維生素 B10.0 5~0· lg/L ; 種子培養(yǎng)方法：將斜面母種接入液體種子培養(yǎng)基，在26±1°C，120~160r/min的搖床培 養(yǎng)6d ; (3) 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng) 將種子液按5%接種量接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基(葡萄糖20~25g/L，胰蛋白陳20~25g/L， KH2P042~4g/L，MgS04. 7Η20 2· 0~4· Og/L，維生素 B1O. 1~0· 2g/L沖進(jìn)行液體發(fā)酵，發(fā)酵培養(yǎng)基 裝液量為250mL的搖瓶裝IOOmL,培養(yǎng)溫度26°C，搖床轉(zhuǎn)速為150rpm，培養(yǎng)5d后收獲菌絲 體； (4) 100L發(fā)酵罐放大培養(yǎng) 將種子液按6%接種量接入60L液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，于100L發(fā)酵罐中進(jìn)行液體深層發(fā) 酵培養(yǎng)，26°C，180r/min，通氣量4L/min，初始pH為5. 0,培養(yǎng)48h。
[0009] 本發(fā)明培養(yǎng)猴頭菌誘變菌株H07的培養(yǎng)基，其特征在于是由以下原料按重量份數(shù) 比制成的：葡萄糖 20. 032g/L，胰蛋白陳 19. 976g/L，ΚΗ2Ρ043· 021/L，MgS04. 7H20 I. 793g/L， 維生素 B10.0 95g/L。
[0010] 本發(fā)明的積極效果在于：誘變的猴頭菌誘變菌株經(jīng)10次以上傳代培養(yǎng)不退化，具 有遺傳穩(wěn)定性，菌絲體干重、多糖、腺苷和蛋白質(zhì)的含量均有明顯提高，其中菌絲體干重較 原出發(fā)菌株提高了 73%，腺甘含量提高了 20%，蛋白質(zhì)含量提高了 51%，多糖含量提高了 69%。
【附圖說明】
[0011] 圖1為原出發(fā)菌株與株突變株的有效成分比較； 圖2為葡萄糖濃度和胰蛋白胨濃度對(duì)D值影響的響應(yīng)面和等高線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0012] 為了便于理解本發(fā)明，特例舉以下實(shí)施例。其作用被理解為是對(duì)本發(fā)明的闡釋而 非對(duì)本發(fā)明的任何形式的限制。
[0013] 實(shí)施例1: 猴頭菌誘變菌株H07的誘變和選育方法。
[0014] 本發(fā)明所述獲得高產(chǎn)猴頭菌誘變菌株的誘變方法為亞硝基胍化學(xué)誘變。
[0015] 1)將猴頭菌（CICC 14026)菌株，以3%接種量接種至產(chǎn)孢培養(yǎng)基中，產(chǎn)孢培養(yǎng)基的 培養(yǎng)為：葡萄糖 20. 032g/L，胰蛋白陳 19. 976g/L，ΚΗ2Ρ043· 021/L，MgSO4. 7H20 I. 793g/L，維 生素&0.0958/1。26°C恒溫?fù)u床中150r/min培養(yǎng)4天后，將猴頭菌菌株，接種于斜面培養(yǎng) 基中（葡萄糖 20g/L，胰蛋白陳 20g/L，KH2P043g/L，MgSO4. 7H20 2. Og/L，維生素 B1O. lg/L，瓊 脂18. Og/L)，23~26°C恒溫箱中培養(yǎng)5天，向斜面試管中注入無菌生理鹽水，振蕩后用無菌 脫脂棉過濾，稀釋成濃度為2 X 107~3 X IO7個(gè)/mL的孢子懸液； 2) 在培養(yǎng)皿中加入亞硝基胍IOmg及0. 5mL丙酮后，用PH=6. 0無菌磷酸緩沖液9mL溶 解亞硝基胍，亞硝基胍終濃度為lmg/mL，加入步驟1)中得到的孢子懸液lmL，開始誘變；分 別誘變2~25min之后，取菌懸液于無菌蒸餾水中逐級(jí)稀釋，至濃度為3 X IO7個(gè)/mL，斜面培 養(yǎng)基培養(yǎng)3~5天后，將菌株于96孔板保存； 3) 利用平板初步篩選生長迅速的菌株； 4) 將篩選獲得的菌株在搖瓶中復(fù)蘇，傳代后26°C 150rmp恒溫?fù)u床中培養(yǎng)3~5天，得菌 絲體。
[0016] 5)獲得的高產(chǎn)誘變猴頭菌誘變菌株經(jīng)過連續(xù)傳代，培養(yǎng)條件為26°C，150r/min恒 溫?fù)u床中培養(yǎng)80h，測定各代的菌絲體干重、多糖、腺苷和蛋白質(zhì)的含量，以篩選高產(chǎn)突變 株。采用HPLC法測定菌絲體中腺甘含量；采用苯酚一硫酸法測定多糖含量；利用考馬斯亮 藍(lán)法測定蛋白質(zhì)含量。
[0017] 共得到3株高產(chǎn)菌株分別命名為H07、H12、H15,其中H07的干重、多糖、腺苷和蛋 白質(zhì)含量均高于出發(fā)菌株，這3株突變株與出發(fā)菌株的有效成分比較見圖1。選取H07為高 產(chǎn)突變株，命名為：猴頭菌Hericium erinaceus，該誘變菌株已于2014年12月26日保藏 于《中國典型培養(yǎng)物保藏中心》，保藏號(hào)為：CCTCC NO :M 2014669,根據(jù)真菌的系統(tǒng)分類學(xué)和 鑒定的進(jìn)化樹表明，菌株屬于真菌界，擔(dān)子菌門，擔(dān)子菌綱，猴菇目，猴菇科。
[0018] 實(shí)施例2: 猴頭菌誘變菌株H07與出發(fā)菌株比較及遺傳穩(wěn)定性考察 1) 將原始出發(fā)菌株與誘變菌株H07分別再培養(yǎng)于種子培養(yǎng)基(葡萄糖20~25g/L，胰蛋 白陳 20~25g/L，KH2P042~4g/L，MgSO4. 7Η20 2. 0~4· Og/L，維生素 B1O. 1~0· 2g/L)中，于 26°C， 150r/min培養(yǎng)5d進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，猴頭菌誘變菌株菌絲體干重、多糖、腺苷和蛋白質(zhì)的含量 均有明顯提高，菌體體干重達(dá)6. 733g/L，較原始出發(fā)菌提高了 73% ;多糖含量可達(dá)I. 573g/ L，較原出發(fā)菌提高了 69% ;腺苷含量可達(dá)0. 0237/L，較原出發(fā)菌提高了 20% ;蛋白質(zhì)含量可 達(dá)I. 621g//L，較原出發(fā)菌提高了 51%。
[0019]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種猴頭菌誘變菌株H07 :分類名稱：猴頭菌H07 Hericium erinaceus H07 ;于2014 年12月26日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏地址：武漢大學(xué)，保藏登記號(hào)為CCTCC NO :M 2014669。
2. 權(quán)利要求1所述的猴頭菌誘變菌株H07的制備方法，包括以下步驟： 1) 將猴頭菌（CICC 14026)菌株，以3%接種量接種至產(chǎn)孢培養(yǎng)基中，產(chǎn)孢培養(yǎng)基的培 養(yǎng)為：葡萄糖 20. 032g/L，胰蛋白陳 19. 976g/L，KH2P043. 021/L，MgSO4. 7H20 I. 793g/L，維生 素B10.0 95g/L ;26°C恒溫?fù)u床中150r/min培養(yǎng)4天后，將猴頭菌菌株，接種于斜面培養(yǎng)基 中（葡萄糖 20g/L，胰蛋白陳 20g/L，KH2P043g/L，MgSO4. 7H20 2. Og/L，維生素 B1O. lg/L，瓊脂 18. Og/L)，23~26°C恒溫箱中培養(yǎng)5天，向斜面試管中注入無菌生理鹽水，振蕩后用無菌脫 脂棉過濾，稀釋成濃度為2 X 107~3 X IO7個(gè)/mL的孢子懸液； 2) 在培養(yǎng)皿中加入亞硝基胍IOmg及0. 5mL丙酮后，用PH=6. 0無菌磷酸緩沖液9mL溶 解亞硝基胍，亞硝基胍終濃度為lmg/mL，加入步驟1)中得到的孢子懸液lmL，開始誘變；分 別誘變2~25min之后，取菌懸液于無菌蒸餾水中逐級(jí)稀釋，至濃度為3 X IO7個(gè)/mL，斜面培 養(yǎng)基培養(yǎng)3~5天后，將菌株于96孔板保存； 3) 利用平板初步篩選生長迅速的菌株； 4) 將篩選獲得的菌株在搖瓶中復(fù)蘇，傳代后26°C 150rmp恒溫?fù)u床中培養(yǎng)3~5天，得菌 絲體； 5) 獲得的高產(chǎn)誘變猴頭菌誘變菌株經(jīng)過連續(xù)傳代，培養(yǎng)條件為26°C，150r/min恒溫?fù)u 床中培養(yǎng)80h，測定各代的菌絲體干重、多糖、腺苷和蛋白質(zhì)的含量，以篩選高產(chǎn)突變株。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種猴頭菌誘變菌株及其培育方法，于2014年12月26日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏地址：武漢大學(xué)，分類名稱：猴頭菌H07 Hericium erinaceus H07；保藏登記號(hào)為CCTCC NO：M 2014669。該菌株是通過化學(xué)誘變篩選分離得到的，其菌絲體干重提高了73%，多糖含量提高了69%，腺苷含量提高了20%，蛋白質(zhì)含量提高了51%。本發(fā)明的猴頭菌誘變菌株經(jīng)10代以上傳代培養(yǎng)不退化，具有遺傳穩(wěn)定性。本發(fā)明還公開了猴頭菌誘變菌株的最適發(fā)酵培養(yǎng)基。CCTCC NO：M 201466920141226
【IPC分類】C12R1-645, C12N1-14, C12N15-01
【公開號(hào)】CN104877914
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510289395
【發(fā)明人】滕利榮, 張峻榕, 逯家輝, 胡爽, 孟慶繁, 閆國棟, 蔡廣勝, 張洋, 權(quán)宇彤
【申請(qǐng)人】吉林大學(xué)
【公開日】2015年9月2日
【申請(qǐng)日】2015年6月1日