入第三步獲得的葡萄汁中進(jìn) 行發(fā)酵，前期發(fā)酵溫度控制在14~16°C，發(fā)酵過程中定時(shí)檢測發(fā)酵溫度、比重、酒精度；當(dāng) 發(fā)酵液酒精度達(dá)到2% vol時(shí)，降溫至12~14°C發(fā)酵；當(dāng)酒精度達(dá)到3~5% vol時(shí)，迅速 降溫至0°C，游離二氧化硫調(diào)至40~50mg/L，終止發(fā)酵；
[0065] 第五步，后處理，選擇皂土作為澄清劑，按0. 4~0. 6g/L的比例將皂土添加到10 倍皂土量的冷水中充分溶解，在溶漲過程中不斷攪拌，完全溶解后，停止攪拌放置過夜；第 二天使用前再攪拌15~30分鐘即可使用；已下皂土的酒液，低溫靜置10~15天，待酒澄 清后即可過濾，裝瓶前經(jīng)過冷凍處理，除菌過濾，無菌灌裝，制得成品。
[0066] 以下采用實(shí)施例來詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施方式，借此對本發(fā)明如何應(yīng)用技術(shù)手段 來解決技術(shù)問題，并達(dá)成技術(shù)效果的實(shí)現(xiàn)過程能充分理解并據(jù)以實(shí)施。
[0067]實(shí)施例1中藥養(yǎng)生提取成分1
[0068] 將人參55g、女貞子30g、山藥35g、鹿鸞20g、蒲黃25g、靈芝30g、枸杞子25g、山苦 草20g、紅梗草15g、馬尾連20g、藍(lán)布正30g、山大黃25g、山茱萸25g、英絲子20g、玉竹25g、 刺五加30g、冬蟲夏草25g、黃精35g、何首烏25g、杜仲30g和黃芪30g分別洗凈，粉碎，混 合，將混合均勻后的混合物溶解于醇濃度為90%的乙醇中，每100g混合物對應(yīng)的乙醇的添 加量為300g，浸漬36小時(shí)，隨后采用滲漉法以每分鐘2ml的速度緩緩滲漉，收集滲漉液，滲 漉液靜置過夜，過濾，過濾液除去溶劑，粉碎，過200目篩，獲得中藥養(yǎng)生提取成分。
[0069] 實(shí)施例2中藥養(yǎng)生提取成分2
[0070] 將人參53g、女貞子28g、山藥33g、鹿鸞18g、蒲黃23g、靈芝28g、枸杞子23g、山苦 草18g、紅梗草13g、馬尾連18g、藍(lán)布正28g、山大黃23g、山茱萸23g、英絲子18g、玉竹23g、 刺五加28g、冬蟲夏草23g、黃精33g、、何首烏23g、杜仲28g和黃芪28g分別洗凈，粉碎，混 合，將混合均勻后的混合物溶解于醇濃度為90%的乙醇中，每100g混合物對應(yīng)的乙醇的添 加量為300g，浸漬36小時(shí)，隨后采用滲漉法以每分鐘2ml的速度緩緩滲漉，收集滲漉液，滲 漉液靜置過夜，過濾，過濾液除去溶劑，粉碎，過200目篩，獲得中藥養(yǎng)生提取成分。
[0071] 實(shí)施例3中藥養(yǎng)生提取成分3
[0072] 將人參57g、女貞子32g、山藥37g、鹿茸22g、蒲黃27g、靈芝32g、枸杞子27g、山苦 草22g、紅梗草17g、馬尾連22g、藍(lán)布正32g、山大黃27g、山茱萸27g、菟絲子22g、玉竹27g、 刺五加32g、冬蟲夏草27g、黃精37g、、何首烏27g、杜仲32g和黃芪32g分別洗凈，粉碎，混 合，將混合均勻后的混合物溶解于醇濃度為90%的乙醇中，每100g混合物對應(yīng)的乙醇的添 加量為300g，浸漬36小時(shí)，隨后采用滲漉法以每分鐘2ml的速度緩緩滲漉，收集滲漉液，滲 漉液靜置過夜，過濾，過濾液除去溶劑，粉碎，過200目篩，獲得中藥養(yǎng)生提取成分。
[0073] 實(shí)施例4毒理學(xué)檢測
[0074] 急性毒性實(shí)驗(yàn)
[0075] 選擇昆明種小鼠20只，雌性各半，體重（20+2)g，將實(shí)施例1制備的中藥養(yǎng)生提取 成分溶解在水中，獲得生藥濃度為lg/ml的溶液，灌服小鼠，經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)，未能檢測出口服 給藥的LD 5(I，故測其最大耐受量，以3. 0ml/10g體重的給藥體積，灌服2次/d，間隔6h，給藥 后觀察7d，記錄動(dòng)物死亡及毒副反應(yīng)癥狀，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，將全部動(dòng)物處理，解剖，肉眼觀察各 主要臟器組織病變情況，2次灌服300g生藥/kg后，動(dòng)物活動(dòng)，進(jìn)食進(jìn)水未見任何異常，觀察 7d動(dòng)物死亡，肉眼尸檢未見主要臟器組織的明顯異常，因此，中藥顆粒劑的最大給藥量為> 300g 生藥 /kg。
[0076] 長期毒性實(shí)驗(yàn)
[0077] 選擇40只雄性SD大鼠，體質(zhì)量（180±20) g，隨機(jī)分為2組，空白對照組和中藥組， 每組20只，空白對照組給予蒸餾水，將實(shí)施例1制備的中藥養(yǎng)生提取成分溶解在水中，獲 得生藥濃度為lg/ml的溶液，灌服大鼠，灌服量為50g生藥/kg，每周一至周六上午灌胃給 藥1次，連續(xù)180d，給藥體積為2mL/100g體重，給藥前及給藥期間每天觀察大鼠一般狀態(tài)、 體征、攝食量、飲水及糞便情況。給藥90d時(shí)于末次給藥24h后，各組抽取6只，雌雄各半； 180d時(shí)末次給藥24h后，各組抽取6只，雌雄各半；停藥后30d各組抽取6只，雌雄各半，用 烏拉坦麻醉，從腹部主動(dòng)脈取血，各組均殺取動(dòng)物，檢查血液學(xué)和血液生化指標(biāo)，取血后，立 刻掊取心、肝、腎、脾、肺、腎上腺、甲狀腺、胸腺、睪丸、卵巢、子宮、腦、前列腺等臟器稱重，根 據(jù)體重計(jì)算器官重量系數(shù)并作病理學(xué)檢查。
[0078] 經(jīng)檢查，在連續(xù)給藥期間，動(dòng)物的活動(dòng)、體重、攝食量、大便和毛發(fā)光澤程度未見異 常，動(dòng)物未見死亡，肉眼未見明顯病變，各組大鼠外周血象檢查均在正常范圍，血液指標(biāo)均 在正常范圍，中藥組大鼠臟器系數(shù)與空白對照組相比沒有顯著差異。
[0079] 實(shí)施例5中藥養(yǎng)生酒
[0080] 將挑選的葡萄破碎后送入12°C的低溫罐中，帶皮浸漬10小時(shí)，然后壓榨，獲得葡 萄汁，將葡萄汁倒入澄清罐中，隨后加入食品級(jí)質(zhì)量濃度為6%的亞硫酸溶液，調(diào)節(jié)葡萄汁 中游離S0 2的含量為40mg/L，在15°C進(jìn)行自然澄清6小時(shí)，分離出葡萄汁，控制溫度在15°C， 按2g/100L(葡萄汁）的量將果膠酶加入到前面獲得的葡萄汁中，再進(jìn)行第二次澄清，等澄 清后分離，得到澄清的液體，隨后加入蜂蜜和實(shí)施例1制備的保健養(yǎng)生中草藥提取成分，蜂 蜜的加入量為300g/100L(葡萄汁），實(shí)施例1制備的保健養(yǎng)生中草藥提取成分的加入量為 70g/100L(葡萄汁），按8g/100L(葡萄汁）的量將酵母菌接入前面獲得的葡萄汁中進(jìn)行發(fā) 酵，前期發(fā)酵溫度控制在15°C，發(fā)酵過程中定時(shí)檢測發(fā)酵溫度、比重、酒精度；當(dāng)發(fā)酵液酒 精度達(dá)到2% vol時(shí)，降溫至12~14°C發(fā)酵；當(dāng)酒精度達(dá)到3~5% vol時(shí)，迅速降溫至 〇°C，游離二氧化硫調(diào)至40~50mg/L，終止發(fā)酵，選擇皂土作為澄清劑，按0. 5g/L的比例將 皂土添加到10倍皂土量的冷水中充分溶解，在溶漲過程中不斷攪拌，完全溶解后，停止攪 拌放置過夜；第二天使用前再攪拌15~30分鐘即可使用；已下皂土的酒液，低溫靜置10~ 15天，待酒澄清后即可過濾，裝瓶前經(jīng)過冷凍處理，除菌過濾，無菌灌裝，制得成品。
[0081] 實(shí)施例6動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
[0082] 動(dòng)物
[0083] 昆明種健康小鼠（體重18~22g) 50只，隨機(jī)分為2組，每組25只，分別為對照組 和中藥養(yǎng)生酒組；12月齡Wi star健康雌性大鼠60只，體重350~380g，隨機(jī)分為3組，每 組20只，分別為空白對照組，模型對照組和中藥養(yǎng)生酒組。
[0084] 樣品
[0085] 實(shí)施例5制備的中藥養(yǎng)生酒，CHROMA牌印度墨汁，64mg碳粒/ml，以1 %明膠4倍 稀釋。
[0086] 另備0? 1 % Na2C03、846注射液（麻醉用）、血清過氧化脂質(zhì)（LP0)試劑盒、超氧化 物歧化酶（S0D)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px)試劑盒、血清Ca試劑盒、血清P試 劑盒（以上試劑盒均購于長春市匯力生物工程技術(shù)公司）。
[0087] 主要器材
[0088] 0. 25ml注射器、4號(hào)針頭、尖頭吸管、分光光度計(jì)、分析天平、法國DMS公司生產(chǎn) CHALLENGER雙能X線骨密度測定儀。
[0089] 方法
[0090] 免疫試驗(yàn)
[0091] 設(shè)保健養(yǎng)生酒16. 7mL/kg ? bw(相當(dāng)于人體推薦劑量的10倍）。酒基對照組予以 等體積的葡萄原酒（制備方法與實(shí)施例5相同，沒有添加中草藥養(yǎng)生提取成分）。每天灌胃 一次，灌胃體積為0. 2mL/10g ? bw，連續(xù)灌胃30d。
[0092] 全部小鼠飼料及飼養(yǎng)管理?xiàng)l件相同。連續(xù)飼喂7d，第8d給小鼠自尾靜脈注入稀釋 印度墨汁〇. lml/10g體重，注射后lmin和llmin用吸管（預(yù)先用肝素溶液濕潤）分別從眶 后靜脈叢取血20 y 1，溶于1% Na2C03溶液中搖勻，以721分光光度計(jì)于675nm處比色。于 第2次采血后將小鼠脫白處死，稱取體重和肝、脾重量，按下列公式計(jì)算廓清指數(shù)K及校正 廓清指數(shù)A。
[0093] K = (lgOD「lgOD2) AH) ;A = 3 V KX 體重八肝重 + 脾重）
[0094] 代謝試驗(yàn)
[0095] 以Wistar大鼠進(jìn)行。除空白對照組外，其余組大鼠全部以846注射液0. 1ml/只 肌肉注射麻醉后，手術(shù)摘出雙側(cè)卵巢。經(jīng)1周手術(shù)創(chuàng)恢復(fù)后正式試驗(yàn)，空白對照組和模型對 照組投喂標(biāo)準(zhǔn)日糧，飲用自來水，中藥養(yǎng)生酒組除飼喂標(biāo)準(zhǔn)日糧外，飲服保健養(yǎng)生酒8. 3mL/ kg *bw(相當(dāng)于人體推薦劑量的5倍）。12周后