流感病毒通用核酸檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域；具體說(shuō)來(lái)，本發(fā)明確立了一群重要病毒(即流感病毒)的通用檢測(cè)方法，用于甲、乙、丙等三個(gè)型的流感病毒以及新發(fā)現(xiàn)的一些流感病毒的檢測(cè)，在科學(xué)研宄、醫(yī)學(xué)臨床診斷和獸醫(yī)臨床診斷上有較大的使用價(jià)值。
[0002]
【背景技術(shù)】
[0003]流感病毒是人、禽、馬、豬等動(dòng)物重要的病原，可以分為甲、乙、丙三個(gè)型。甲型流感病毒還可以分為H1N1、H3N2、H5N8、H9N2等亞型。最近，從牛體內(nèi)分離到的流感病毒與甲、乙、丙三個(gè)型的流感病毒都有顯著不同，因此可以當(dāng)作一個(gè)新型的流感病毒。
[0004]病毒核酸檢測(cè)是病毒檢測(cè)重要方法之一。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)流感病毒的各種核酸檢測(cè)方法都是僅針對(duì)一個(gè)型或一個(gè)亞型的流感病毒，沒(méi)有針對(duì)所有型的流感病毒的通用核酸檢測(cè)方法。
[0005]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明針對(duì)上述現(xiàn)有流感病毒檢測(cè)技術(shù)的不足，開(kāi)展了深入研宄和測(cè)試，建立了甲、乙、丙等三個(gè)型的流感病毒以及新發(fā)現(xiàn)的一些流感病毒通用核酸檢測(cè)方法。該方法包括以下三個(gè)方面內(nèi)容:
(一)確立了核酸檢測(cè)所需要的引物序列，針對(duì)流感病毒PBl等基因中保守區(qū)域，設(shè)計(jì)引物序列，其中上游引物序列含有20個(gè)堿基，序列為ccagttggwggtaatgaaaa(即序列表中SEQID N0.1，其中w是簡(jiǎn)并堿基，表示堿基a和堿基t的混合物)，下游上游引物序列含有26個(gè)堿基，序列為gttgacagcatgttraacatkcccat(即序列表中SEQ ID N0.2，其中r是簡(jiǎn)并堿基，表示堿基g和堿基a的混合物，k也是簡(jiǎn)并堿基，表示堿基g和堿基t的混合物)；
(二)確立了檢測(cè)反應(yīng)種類(lèi)，可以采用多種檢測(cè)反應(yīng)，包括普通的逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(通常，這類(lèi)反應(yīng)產(chǎn)物用核酸電泳進(jìn)行檢測(cè))、熒光逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(通常，這類(lèi)反應(yīng)產(chǎn)物用熒光物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè))或依賴(lài)核酸序列擴(kuò)增反應(yīng)(通常，這類(lèi)反應(yīng)產(chǎn)物用電化學(xué)發(fā)光物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè))；目前，普通逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和熒光逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)最有推廣價(jià)值。
[0007](三)確立了檢測(cè)反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，以普通逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)為例，在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)管中依次加入純水7.5微升、2倍一步法逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)緩沖液12.5微升(含有dATP、dGTP、dTTP、dCTP等四種核苷酸)、一步法逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)所需要的逆轉(zhuǎn)錄酶和核酸聚合酶的混合物I微升、第一步所合成的上游引物I微升(濃度為10微摩爾每升)、第一步所合成的下游引物I微升(濃度為10微摩爾每升)、需要檢測(cè)的流感病毒核酸2微升(從臨床樣品或其他樣品中用核酸提取試劑盒提取的)；然后將逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系密閉，置于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀器(國(guó)內(nèi)常稱(chēng)為PCR儀)上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，反應(yīng)條件為42攝氏度30分鐘，然后94攝氏度2分鐘，再進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)為94攝氏度30秒，55攝氏度30秒，72攝氏度30秒，循環(huán)結(jié)束后72攝氏度延伸5至10分鐘；反應(yīng)結(jié)束后，在反應(yīng)產(chǎn)物中加入含有顏色的核酸電泳緩沖液，進(jìn)行瓊脂糖核酸凝膠電泳，如果出現(xiàn)大小約為430至480個(gè)堿基對(duì)的核酸電泳條帶，則判斷為陽(yáng)性，否則判斷為陰性。
[0008]
【具體實(shí)施方式】
[0009]下面通過(guò)實(shí)施例，說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于這個(gè)實(shí)施例。
[0010]本實(shí)施例用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，對(duì)流感病毒進(jìn)行通用核酸檢測(cè)，包括如下步驟:
第一步(合成引物):按照本發(fā)明指定的核酸序列(即序列表中SEQ ID N0.1和SEQ IDN0.2)，人工合成逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)所需要的上游引物和下游引物；
第二步(配置逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系):在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)管中依次加入純水7.5微升、2倍一步法逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)緩沖液12.5微升(含有dATP、dGTP、dTTP、dCTP等四種核苷酸)、一步法逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)所需要的逆轉(zhuǎn)錄酶和核酸聚合酶的混合物I微升、第一步所合成的上游引物I微升(濃度為10微摩爾每升)、第一步所合成的下游引物I微升(濃度為10微摩爾每升)、需要檢測(cè)的流感病毒核酸2微升(從臨床樣品或其他樣品中用核酸提取試劑盒提取的);
第三步(進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)):將第二步配置好的逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系密閉后，置于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀器(國(guó)內(nèi)常稱(chēng)為PCR儀)上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，反應(yīng)條件為42攝氏度30分鐘，然后94攝氏度2分鐘，再進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)為94攝氏度30秒，55攝氏度30秒，72攝氏度30秒，循環(huán)結(jié)束后72攝氏度延伸5至10分鐘；第四步(逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)結(jié)果檢測(cè)):在第三步的反應(yīng)產(chǎn)物中加入含有顏色的核酸電泳緩沖液，進(jìn)行瓊脂糖核酸凝膠電泳，如果出現(xiàn)大小約為430至480個(gè)堿基對(duì)的核酸電泳條帶，則判斷為陽(yáng)性，否則判斷為陰性。
[0011]實(shí)際應(yīng)用結(jié)果:對(duì)98份人甲型流感病毒標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性臨床樣品、對(duì)46份人乙型流感病毒標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性臨床樣品、128份禽甲型流感病毒標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性臨床樣品、3份牛流感病毒標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，以及300份來(lái)自禽和人的標(biāo)準(zhǔn)陰性樣品，用上述流感病毒通用核酸檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示該技術(shù)的靈敏度為99.27%，特異性為99.33%。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.流感病毒通用的核酸檢測(cè)技術(shù)，可采用普通逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、熒光逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、依賴(lài)核酸序列擴(kuò)增反應(yīng)等檢測(cè)反應(yīng)，其特征是可以檢出甲、乙、丙等三個(gè)型的流感病毒和新發(fā)現(xiàn)的流感病毒，至少可以檢出甲型和乙型流感病毒。
2.流感病毒通用的核酸檢測(cè)技術(shù)，其特征有兩個(gè):一是可以檢出甲、乙、丙等三個(gè)型的流感病毒和新發(fā)現(xiàn)的流感病毒，至少可以檢出甲型和乙型流感病毒；二是采用普通逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或熒光逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。
3.流感病毒通用的核酸檢測(cè)技術(shù)，其特征有三個(gè):一是可以檢出甲、乙、丙等三個(gè)型的流感病毒和新發(fā)現(xiàn)的流感病毒，至少可以檢出甲型和乙型流感病毒；二是采用針對(duì)流感病毒PBl基因保守的區(qū)域而設(shè)計(jì)的一對(duì)引物；三是采用普通逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或熒光逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。
4.流感病毒通用的核酸檢測(cè)技術(shù)，可采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、熒光逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、依賴(lài)核酸序列擴(kuò)增反應(yīng)等檢測(cè)反應(yīng)，其特征有兩個(gè):一是可以檢出甲、乙、丙等三個(gè)型的流感病毒和新發(fā)現(xiàn)的流感病毒，至少可以檢出甲型和乙型流感病毒；二是檢測(cè)反應(yīng)采用的一條引物的序列為ccagttggwggtaatgaaaa，或與ccagttggwggtaatgaaaa序列有10個(gè)或10個(gè)以上的堿基序列相同的序列(本段文字中，引物序列均為5撇端至3撇端，a、t、g、c表示相應(yīng)的堿基，w代表簡(jiǎn)并堿基，表示堿基a和堿基t的混合物)。
5.流感病毒通用的核酸檢測(cè)技術(shù)，可采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、熒光逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、依賴(lài)核酸序列擴(kuò)增反應(yīng)等檢測(cè)反應(yīng)，其特征有兩個(gè):一是可以檢出甲、乙、丙等三個(gè)型的流感病毒和新發(fā)現(xiàn)的流感病毒，至少可以檢出甲型和乙型流感病毒；二是檢測(cè)反應(yīng)采用的一條引物的序列為gttgacagcatgttraacatkcccat，或與gttgacagcatgttraacatkcccat序列有10個(gè)或10個(gè)以上的堿基序列相同的序列(本段文字中，引物序列均為5撇端至3撇端，a、t、g、c表示相應(yīng)的堿基，r和k代表簡(jiǎn)并堿基，r表示堿基g和堿基a的混合物，k表示堿基g和堿基t的混合物)。
6.流感病毒通用的核酸檢測(cè)技術(shù)，其特征有三個(gè):一是采用普通逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或熒光逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；二是檢測(cè)反應(yīng)采用的兩條引物，其序列分別為ccagttggwggtaatgaaaa 矛口 gttgacagcatgttraacatkcccat，10 10以上的堿基序列相同的序列(本段文字中，引物序列均為5撇端至3撇端，a、t、g、c表示相應(yīng)的堿基，w、r和k代表簡(jiǎn)并堿基，w表示堿基a和堿基t的混合物，r表示堿基g和堿基a的混合物，k表示堿基g和堿基t的混合物)。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，它確立了甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒和新發(fā)現(xiàn)的一些流感病毒的通用核酸檢測(cè)方法，含有三個(gè)技術(shù)要點(diǎn)： 確立了核酸檢測(cè)所需要的引物序列；確立了檢測(cè)反應(yīng)種類(lèi)；確立了檢測(cè)反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。該通用核酸檢測(cè)方法可以用于流感病毒科學(xué)研究，也可以用于動(dòng)物或人的臨床診斷檢測(cè)。
【IPC分類(lèi)】C12Q1-70, C12Q1-68
【公開(kāi)號(hào)】CN104762413
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510000953
【發(fā)明人】陳繼明, 王素春
【申請(qǐng)人】中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心
【公開(kāi)日】2015年7月8日
【申請(qǐng)日】2015年1月4日