采用重組酶介導等溫擴增技術檢測獼猴桃潰瘍病菌的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物細菌學診斷技術領域，特別涉及采用等溫擴增技術來檢測植物病 菌，具體為一種采用重組酶介導等溫擴增技術檢測獼猴桃潰瘍病菌的方法。
【背景技術】
[0002] 我國是獼猴桃的主要產(chǎn)區(qū)，其種植面積和產(chǎn)量均居世界之首。獼猴桃潰瘍病是一 種毀滅性的病害，對我國獼猴桃各大產(chǎn)區(qū)都有不同程度的危害，嚴重威脅到我國獼猴桃產(chǎn) 業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，被列為全國森林植物檢疫防治對象。此病來勢兇猛，發(fā)病時會直接影響到 獼猴桃的產(chǎn)量及果實質(zhì)量，給我國獼猴桃產(chǎn)業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。
[0003] 獼猴桃潰瘍病危害嚴重及防治困難，一直是獼猴桃生產(chǎn)和理論上的一個重要問 題。目前很難找到一種有效的方法進行防治。其病原菌為丁香假單胞菌獼猴桃致病變種 (Pseudomonas syringae pv. actinidiae, PSA)，該菌有較長的潛伏期，致病力強，一旦侵 染，2-3年后將造成大規(guī)模毀園，因此，早期對其準確檢測是獼猴桃細菌性潰瘍病防治的重 要前提。因此，建立高效、快速、方便、準確的檢測方法尤為重要，這有助于苗木的早期診斷 和及時防治。
[0004] 傳統(tǒng)的生理生化方法鑒定獼猴桃潰瘍病菌，是一種繁瑣，費時的方法，且往往達不 到預期的效果，不能實現(xiàn)對病菌的早期檢測。近年來，分子檢測技術的發(fā)展為植物病原菌的 鑒定提供了更為有力的工具，此項技術可以直接從DNA層面確定病原菌，使得病原的鑒定， 病害的診斷變得更為快速準確。聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR)是一 種常用的病菌分子檢測技術，由變性一退火一延伸三個基本反應步驟構成：①模板DNA的 變性：模板DNA經(jīng)加熱至94°C左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈 DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應做準備；②模板DNA與引物的退火 (復性）：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55°C左右，引物與模板DNA單鏈的互補 序列配對結合；③引物的延伸：DNA模板一引物結合物在72°C，DNA聚合酶（如TaqDNA聚 合酶）的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基互補配對與半保留復制原理， 合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈，重復循環(huán)變性一退火一延伸三過程就 可獲得更多的"半保留復制鏈"，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。PCR技術需要一 定的溫度條件和適宜的變性、退火和延伸時間來滿足反應要求，過程控制不好，容易出現(xiàn)假 陽性或無法擴增目標條帶，耗時過長。
[0005]重組酶介導等溫擴增（Recombinase Polymerase Amplification, RPA)技術被認 為是可以取代PCR的核酸檢測技術。RPA技術本質(zhì)上就是一個恒溫的反應過程，其最合適的 溫度在37°C -42°C之間，無需變性，變溫，退火等過程，在常溫下反應即可，反應過程簡單， 一般十五分鐘左右即可獲得可檢出的擴增產(chǎn)物。目前這種技術已經(jīng)被應用于冠狀病毒，HIV 病毒，癌癥等方面的檢測，但在植物病菌學領域，特別是在獼猴桃潰瘍病菌的早期檢測卻沒 有相關的應用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為解決上述技術問題，本發(fā)明將重組酶介導等溫擴增技術應用到獼猴桃潰瘍病菌 的診斷及防治領域，建立一種早期診斷方法。
[0007] 本發(fā)明提供了一種采用重組酶介導等溫擴增技術檢測獼猴桃潰瘍病菌的方法。該 方法主要包括獼猴桃潰瘍病菌總DNA的提取，RPA反應和2. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，從分 子水平對獼猴桃潰瘍病菌進行快速檢測。
[0008] 本發(fā)明所述一種采用重組酶介導等溫擴增技術檢測獼猴桃潰瘍病菌的方法，主要 包括以下步驟：
[0009] 1)重組酶介導等溫擴增（RPA)引物的設計；
[0010] 2)獼猴桃潰瘍病菌的培養(yǎng)；
[0011] 3)獼猴桃潰瘍病菌總DNA的提??；
[0012] 4)RPA 反應；
[0013] 5) 2. 5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0014] RPA的引物設計比PCR引物長，一般需要達到30-35bp個堿基長度，引物過短會降 低重組率，影響擴增速度和檢測靈敏度。作為一種優(yōu)選，所述引物設計為：
[0015] RPA Psal-F: 5' -CCTGATAAGGGTGAGGTCGGCAGTTCGAATC-3'
[0016] RPA Psal-R:5,-TCACGCACCCTTCAATCAGGATGGAATGCTC-3，
[0017] 作為一種優(yōu)選，所述獼猴桃潰瘍病菌的培養(yǎng)為：將獼猴桃潰瘍病菌放入液體LB培 養(yǎng)基中，在22°C條件下培養(yǎng)12小時。
[0018] 作為一種優(yōu)選，所述獼猴桃潰瘍病菌總DNA的提取為：將上述培養(yǎng)液離心后收集 潰瘍病菌，從病菌中提取總DNA。
[0019] 作為一種優(yōu)選，所述RPA反應為：以獼猴桃潰瘍病菌的DNA為模板，將RPA反應管 放在37°C恒溫水浴15-30分鐘，得到擴增的目標產(chǎn)物。
[0020] RPA反應主要依賴于三種酶：重組酶蛋白，單鏈DNA結合蛋白及DNA聚合酶。重組 酶蛋白可以在ATP的參與下結合單鏈DNA(引物）并形成DNA核蛋白微絲，核蛋白微絲兩端 都可以延長，并且可以通過前端伸長后端縮短的方法向雙鏈DNA分子運動。微絲能夠拽住 周圍的DNA分子，將單鏈的寡核苷酸序列與DNA序列進行比對，當找到匹配的序列時，兩個 分子就會緊密結合到一起確保重組跟著發(fā)生。DNA的螺旋構象以及核蛋白微絲的長度對搜 索識別同源序列的效率起重要作用，在單鏈結合蛋白的幫助下，模板DNA開始解鏈，引物入 侵雙鏈DNA并開始配對形成復制所需自由的3'羥基末端，在DNA聚合酶的作用下進行復制 延伸，所形成新的DNA互補鏈反應產(chǎn)物也是以指數(shù)級增長，整個反應過程進行的非常快，一 般十幾分鐘即可得到可檢測的獼猴桃潰瘍病菌的擴增產(chǎn)物。
[0021] 作為本發(fā)明具體實施例中的一種優(yōu)選方式，所述RPA反應可以通過下述方式實 現(xiàn)：向含有凍干酶粉的〇. 2ml TwistAmp Basic反應管中加入再水化緩沖液29. 5 y L，去離 子水12. 2 y L，然后分裝在兩個0. 2ml的反應管中，向兩管中各加入引物1 y L(10 ymol/L)， 細菌基因組DNA2 y L (50ng/ y L)，最后加入醋酸鎂溶液1. 25 y L (280mmol/L)，充分混勻后 在37°C恒溫水浴中反應15-30分鐘，得到擴增產(chǎn)物。
[0022] 凍干粉中含有RPA反應的幾種酶，包括重組酶、單鏈結合蛋白及聚合酶等，再水化 緩沖液的作用是溶解這些酶類，并在RPA反應中提供穩(wěn)定的緩沖體系，醋酸鎂具有啟動RPA