反應(yīng)的作用。
[0023] 作為一種優(yōu)選，所述RPA反應(yīng)是在37°C恒溫水浴中進(jìn)行。
[0024] 作為一種優(yōu)選，所述RPA反應(yīng)的時(shí)間為15-30分鐘。
[0025] 作為一種優(yōu)選，所述RPA反應(yīng)的最佳反應(yīng)時(shí)間為20分鐘。
[0026] 作為一種優(yōu)選，所述2. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)為：對(duì)進(jìn)行RPA反應(yīng)得到的擴(kuò)增產(chǎn) 物進(jìn)行檢測(cè)，確定獼猴桃是否感染所述潰瘍病菌。
[0027] 本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明是利用RPA反應(yīng)在恒溫水浴中進(jìn)行得到的目標(biāo)產(chǎn)物， 具有快速、靈敏、方便、特異性等特點(diǎn)。RPA反應(yīng)對(duì)條件要求不高，在恒溫培養(yǎng)箱、水浴鍋、人 體溫等能夠維持所需溫度的任何條件即可保持RPA反應(yīng)具有較高的活性，無需昂貴的儀器 設(shè)備。與常規(guī)PCR方法相比，本發(fā)明篩選獲得的引物對(duì)目標(biāo)片段的擴(kuò)增具有較高的特異性 和穩(wěn)定性，反應(yīng)無引物二聚體，且模仿體內(nèi)復(fù)制機(jī)理，反應(yīng)不需要退火過程，整個(gè)反應(yīng)簡(jiǎn)單 快速。本發(fā)明方法已經(jīng)成功應(yīng)用于獼猴桃潰瘍病菌病害的檢測(cè)，并證明了 RPA是一種檢測(cè) 獼猴桃潰瘍病菌病害的有效手段。
【附圖說明】
[0028] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例1的RPA引物篩選示意圖，其中M為Marker 2000、1為引物 RPA-PsalF 和 R、2 為引物 RPA-Psa2F 和 R。
[0029] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例2的不同RPA反應(yīng)時(shí)間對(duì)檢測(cè)的影響，其中M為Marker2000 ; 1 為 5min、2 為 10min、3 為 20min、4 為 30min、5 為 40min、6 為 60min、7 為 120min。
[0030] 圖3是本發(fā)明實(shí)施例3的RPA和PCR靈敏度檢測(cè)圖，其中A為RPA反應(yīng)、B為PCR反 應(yīng)；1表示DNA濃度為50ng/ y 1、2表示DNA濃度為lng/ y 1、3表示DNA濃度為0. 5ng/ y 1、 4表示DNA濃度為0. 25ng/ y 1、5表示DNA濃度為0. 15ng/ y 1、6表示DNA濃度為0. 05ng/ y 1〇
[0031] 圖4是本發(fā)明實(shí)施例4的RPA各PCR對(duì)田間樣品特異性檢測(cè)圖，其中M為Marker 2000 ; 1-2為PCR，3-4為RPA ; 1和3為獼猴桃發(fā)病枝干，2和4獼猴桃健康枝干。
【具體實(shí)施方式】
[0032] 為了更加理解本發(fā)明，下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)發(fā)明所述采用重組酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增 技術(shù)檢測(cè)獼猴桃潰瘍病菌的方法進(jìn)行詳細(xì)說明，但所述實(shí)施例并不限制本發(fā)明。
[0033] 材料與試劑
[0034] 材料：
[0035] 獼猴桃健康枝條，感染潰瘍病菌的枝條。采自中國四川蒼溪、雅安、都江堰，采集枝 條保存于4°C冰箱中。
[0036] 主要試劑：
[0037] TwistAmp Basic試劑盒購自英國TwistDx公司；
[0038] 細(xì)菌DNA提取試劑盒購自天根生物有限公司。
[0039] 實(shí)施例1 :
[0040] 1?引物設(shè)計(jì)：
[0041] 本實(shí)驗(yàn)根據(jù)獼猴桃潰瘍病菌16S-23S rDNA序列設(shè)計(jì)了多組RPA引物，然后優(yōu)選出 其中兩組引物進(jìn)行RPA擴(kuò)增反應(yīng)，這兩組引物序列為：
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種采用重組酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)獼猴桃潰瘍病菌的上游引物，其特征在于， 核苷酸序列為：CCTGATAAGGGTGAGGTCGGCAGITCGAATC。
2. -種采用重組酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)獼猴桃潰瘍病菌的下游引物，其特征在于， 核苷酸序列為：TCACGCACCCTTCAATCAGGATGGAATGCTC。
3. -種采用重組酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)獼猴桃潰瘍病菌的引物對(duì)，其特征在于，上 游引物核苷酸序列為CCTGATAAGGGTGAGGTCGGCAGTTCGAATC，下游引物核苷酸序列為：TCACG CACCCTTCAATCAGGATGGAATGCTC。
4. 一種采用權(quán)利要求1-3所述引物進(jìn)行重組酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)獼猴桃潰瘍病 菌的方法，其特征在于，主要包括以下步驟： 1) 獼猴桃潰瘍病菌總DNA的提?。? 2) 重組酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（RPA)反應(yīng)：以獼猴桃潰瘍病菌總DNA為模板，進(jìn)行RPA反應(yīng)， 得到擴(kuò)增產(chǎn)物； 3) 2. 5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
5. 如權(quán)利要求4所述一種采用重組酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)獼猴桃潰瘍病菌的方法， 其特征在于，還包括RPA反應(yīng)引物的設(shè)計(jì)。
6. 如權(quán)利要求4所述一種采用重組酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)獼猴桃潰瘍病菌的方法， 其特征在于，所述RPA反應(yīng)是在37 °C恒溫水浴中進(jìn)行。
7. 如權(quán)利要求4所述一種采用重組酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)獼猴桃潰瘍病菌的方法， 其特征在于，所述RPA反應(yīng)的時(shí)間為15-30分鐘。
8. 如權(quán)利要求4所述一種采用重組酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)獼猴桃潰瘍病菌的方法， 其特征在于，所述RPA反應(yīng)的最佳反應(yīng)時(shí)間為20分鐘。
9. 如權(quán)利要求4所述一種采用重組酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)獼猴桃潰瘍病菌的方 法，其特征在于，所述RPA反應(yīng)為：向含有凍干酶粉的0.2mlTwistAmpBasic反應(yīng)管中加 入再水化緩沖液29. 5yL，去離子水12. 2yL，然后分裝在兩個(gè)0. 2ml的反應(yīng)管中，取1管， 加入引物各IUL(10ymol/L)，病菌基因組DNA2yL(50ng/yL)，最后加入醋酸鎂溶液 1. 25yL(280mmol/L)，充分混勻后在37°C恒溫水浴中反應(yīng)15-30分鐘，得到擴(kuò)增產(chǎn)物。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種采用重組酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)獼猴桃潰瘍病菌的方法，屬于植物細(xì)菌學(xué)診斷技術(shù)領(lǐng)域。該方法主要包括：獼猴桃潰瘍病菌總DNA的提取，RPA反應(yīng)和2.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，從分子水平對(duì)獼猴桃潰瘍病菌進(jìn)行快速檢測(cè)。本發(fā)明具有快速、靈敏、方便、特異性等特點(diǎn)。與常規(guī)PCR方法相比，本發(fā)明篩選獲得的引物對(duì)目標(biāo)片段的擴(kuò)增具有較高的特異性和穩(wěn)定性，擴(kuò)增時(shí)間短，反應(yīng)不需退火，在恒溫培養(yǎng)箱、水浴鍋、人體溫等能夠維持所需溫度的任何條件即可保持RPA反應(yīng)具有較高的活性，無需昂貴的儀器設(shè)備。本發(fā)明成功建立了獼猴桃潰瘍病菌的檢測(cè)體系，并通過樣品檢測(cè)驗(yàn)證了該體系的實(shí)用性，為獼猴桃潰瘍病菌的檢測(cè)提供了一種快速有效的新方法。
【IPC分類】C12N15-11, C12R1-38, C12Q1-04, C12Q1-68
【公開號(hào)】CN104762409
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510214094
【發(fā)明人】楊輝, 陳航, 龔國淑, 劉童, 李慶, 張敏
【申請(qǐng)人】四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年7月8日
【申請(qǐng)日】2015年4月30日