細胞毒性t淋巴細胞及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及一種用于治療結直腸腫瘤的⑶8+細胞毒性T淋巴 細胞及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 結直腸癌（包括結腸癌、直腸癌和肛門癌）是常見的消化道惡性腫瘤，在全球范圍 內為男性第3位、女性第2位高發(fā)性惡性腫瘤，每年新發(fā)約120萬例，死亡約60萬例。隨著 社會經濟發(fā)展、居民生活方式的轉變，以及人口老齡化的加劇，我國結直腸癌的發(fā)病和死亡 呈明顯上升趨勢，且發(fā)病年齡有所提前。隨著手術、化療及放療等傳統(tǒng)的腫瘤治療方法的規(guī) 范化，結直腸惡性腫瘤患者的生存期已經得到明顯延長，但傳統(tǒng)的治療方法并不能完全治 愈腫瘤，而且對機體抗腫瘤免疫功能也造成一定的損傷。
[0003] 隨著從細胞和分子水平上對腫瘤免疫研宄的深入，免疫治療已經在前列腺癌、胃 癌、黑色素瘤等實體腫瘤治療方面取得顯著療效，基于抗腫瘤特異性免疫重建的免疫治療 是目前國際上公認的繼手術、放療和化療之后最有希望完全消滅體內腫瘤細胞并根治的目 的，將成為未來腫瘤治療的一個主要方向。T淋巴細胞作為免疫細胞治療的主要效應細胞， 可特異性識別腫瘤，呈克隆化擴增并在體內形成免疫記憶，介導持久抗腫瘤特異性免疫效 應。通過提高病人自身免疫系統(tǒng)的功能，增強特異性腫瘤殺傷細胞的分化能力，在細胞水平 上殺傷腫瘤細胞，有效抑制腫瘤細胞的轉移、擴散和復發(fā)，且副反應輕微具有良好的臨床治 療效果，克服了腫瘤傳統(tǒng)治療方式的"不徹底、易轉移、副作用大"等弊端。通常認為培養(yǎng)后 產生的CD8+細胞毒性T淋巴細胞（CTL)在人體內起了主要殺傷腫瘤細胞的作用。CD8+CTL 細胞可識別腫瘤細胞表面的腫瘤抗原肽-MHC I類分子復合物，被激活后增殖、分化并通過 Fasl/Fas、顆粒酶等多種途徑在荷瘤早期、腫瘤緩解期或術后殘余瘤細胞中殺傷腫瘤細胞。 而CD8+CTL細胞的激活需要腫瘤抗原致敏和抗原遞呈細胞（APC)所提供的共刺激信號以及 由細胞因子提供的第三類信號分子的共同作用。
[0004] B細胞作為一種APC，在外周血中的比例約6. 4~22%，與目前常用的樹突狀細胞 (DC細胞）相比較，數(shù)量遠高于DCs (約占0. 16~0. 68 % )，且DCs體外分離和純化較困難， 而B細胞在體外通過⑶40L刺激后可被大量擴增，且培養(yǎng)體系更加簡單、經濟。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的一個目的是提供一種用于治療結直腸腫瘤的⑶8+細胞毒性T淋巴細胞 及其制備方法。
[0006] 本發(fā)明所提供的用于治療結直腸腫瘤的CD8+細胞毒性T淋巴細胞的制備方法，具 體可包括如下步驟：將負載CEA61cid多肽的B細胞（離體）與CD8 +T細胞（離體）在體外共 培養(yǎng)，使所述CD8+T細胞活化，從而獲得用于治療結直腸腫瘤的CD8+細胞毒性T淋巴細胞； 所述CEA 61cid多肽的氨基酸序列為序列表中序列1，即氨基酸單字母縮寫序列是YLSGADLNL。
[0007] 在本發(fā)明方法中，進行所述體外共培養(yǎng)時，所述負載了 CEA61cid多肽的B細胞與所述 CD8+T細胞的配比（即細胞的數(shù)目比）可為1:10-1:50,優(yōu)選為1:20 ;進行所述體外共培養(yǎng) 的時間為7-8天，優(yōu)選為7天。
[0008] 在本發(fā)明方法中，所述負載CEA61cid多肽的B細胞可按照包括如下步驟的方法制備 得到：
[0009] (1)從離體人外周血單個核細胞（PBMC)中分離B細胞，采用含有rhIL-4和s⑶40L 的培養(yǎng)液培養(yǎng)所得B細胞，培養(yǎng)4-8天，使所述B細胞活化；
[0010] 其中，rhIL-4在所述培養(yǎng)液中的濃度為l-10ng/ml，優(yōu)選為5ng/ml ;sQ)40L在所述 培養(yǎng)液中的濃度為1-10 μ g/ml，優(yōu)選為5 μ g/ml。另外，所述培養(yǎng)液中還含有人AB血清，濃 度為1-20%體積分數(shù)，優(yōu)選為10%體積分數(shù)；轉鐵蛋白，濃度為1-20 μ g/ml，優(yōu)選為10 μ g/ ml ;和胰島素，濃度為1-20 μ g/ml，優(yōu)選為10 μ g/ml。
[0011] 活化后的B細胞表現(xiàn)為：增殖活躍，且細胞表面高表達⑶80、⑶86、MHC等抗原遞 呈相關分子。
[0012] (2)向培養(yǎng)有步驟⑴獲得的已活化的B細胞的培養(yǎng)液（同步驟⑴培養(yǎng)液配方） 中加入所述CEA 61cid多肽，繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)12-18h，使所述CEA 61(1)多肽負載到所述B細胞上， 即獲得所述負載CEA61cid多肽的B細胞。
[0013] 其中，所述CEA61cid多肽的加入量滿足如下條件：加入所述CEA61cid多肽后，所述 CEA61cid多肽在培養(yǎng)體系中的濃度為30-80 μ g/ml，優(yōu)選50 μ g/ml。
[0014] 本發(fā)明方法中，所述"將負載CEA_多肽的B細胞與CD8 +T細胞在體外共培養(yǎng)"是 在滋養(yǎng)層細胞上進行共培養(yǎng)的。所述滋養(yǎng)層細胞具體為所述人外周血單個核細胞（PBMC) 中的CD81fe附細胞（非CD8粘附細胞）。
[0015] 所述⑶8?附細胞（非⑶8粘附細胞）的作用是刺激⑶8 +細胞毒性T淋巴細胞 擴增。
[0016] 由本發(fā)明方法制備得到的CD8+細胞毒性T淋巴細胞以及由所述方法制備得到的 含有所述CD8+細胞毒性T淋巴細胞的整個共培養(yǎng)體系中全部細胞也屬于本發(fā)明的保護范 圍。
[0017] 本發(fā)明所述的CD8+細胞毒性T淋巴細胞以及由所述方法制備得到的含有所述CD8 + 細胞毒性T淋巴細胞的整個共培養(yǎng)體系中全部細胞在制備用于治療結直腸腫瘤的產品中 的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0018] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種用于治療結直腸腫瘤的制劑。
[0019] 本發(fā)明所提供的用于治療結直腸腫瘤的制劑含有本發(fā)明方法制備的CD8+細胞毒 性T淋巴細胞和胸腺肽α 1。
[0020] 在本發(fā)明制劑中，所述的CD8+細胞毒性T淋巴細胞或者由所述方法制備得到的含 有所述CD8+細胞毒性T淋巴細胞的整個共培養(yǎng)體系中全部細胞和所述胸腺肽α 1的配比 為6Χ 106-9Χ IO6個本發(fā)明CD8 +細胞毒性T淋巴細胞：5-20 μ g胸腺肽α 1，優(yōu)選8Χ 10 6個 本發(fā)明⑶8+細胞毒性T淋巴細胞：10 μ g胸腺肽α 1。
[0021] 在本發(fā)明的一個實施例中，本發(fā)明所述制劑的組成如下：每毫升所述制劑中含有 6 X 106-9 X IO6個本發(fā)明CD8 +細胞毒性T淋巴細胞，5-20 μ g胸腺肽α 1，余量為含有l(wèi)-20g/ L，優(yōu)選為10g/L人血白蛋白的生理鹽水，所述生理鹽水中NaCl的質量分數(shù)為0. 9%。優(yōu)選 地，本發(fā)明所述制劑的組成如下：每毫升所述制劑中含有8X IO6個本發(fā)明CD8 +細胞毒性T 淋巴細胞，10以8胸腺肽〇1，余量為含有1-2(^/1，優(yōu)選為1(^/1人血白蛋白的生理鹽水，所 述生理鹽水中NaCl的質量分數(shù)為0. 9%。
[0022] 在本發(fā)明制劑中，也可以以所述"由本發(fā)明方法制備得到的含有本發(fā)明CD8+細胞 毒性T淋巴細胞的整個共培養(yǎng)體系中全部細胞"替代"本發(fā)明所述CD8+細胞毒性T淋巴細 胞"。
[0023] 本發(fā)明的再一個目的是提供一種負載CEA61cid多肽的B細胞。
[0024] 本發(fā)明所提供的負載CEA61cid多肽的B細胞，具體為負載了氨基酸序列為序列表中 序列1多肽（所述CEA 61qd多肽）的B細胞。
[0025] 所述負載CEA61cid多肽的B細胞可按照前文所述方法制備得到。
[0026] 所述負載CEA61cid多肽的B細胞在制備所述CD8 +細胞毒性T淋巴細胞或者由所述 方法制備得到的含有所述CD8+細胞毒性T淋巴細胞的整個共培養(yǎng)體系中全部細胞中的應 用也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0027] 本發(fā)明通過采用活化B細胞代替DCs細胞負載特異性多肽抗原（序列1所示的 CEA61cid)后，刺激CD8+T細胞，激活后的CD8+T細胞最終分化為具有腫瘤特異性殺傷活性的細 胞毒性T淋巴細胞（CTL)，從而建立以B細胞活化及其負載特定抗原肽的方法。本發(fā)明對傳 統(tǒng)方法進行了改進，同時通過在體外制備大量抗原特異性CD8+CTL，并聯(lián)合胸腺肽al，兩者 作用互補，起到了協(xié)同增效的作用，極大提高了對腫瘤的殺傷效率，可直接、快速殺傷腫瘤 細胞起到治療作用，避免了由于腫瘤患者體內大量免疫抑制因子的存在，影響CTL的有效 活化和增殖，使其不足以與迅速增殖的腫瘤細胞抗衡的弊端，對常規(guī)治療無法清除的殘留 腫瘤細胞進行殺滅，有效防止腫瘤的復發(fā)和轉移。
【附圖說明】
[0028] 圖1為從人PBMC中分離的B細胞的比例（流式細胞檢測結果圖）。
[0029] 圖2為經B細胞誘導活化的特異性CTL細胞的比例，以及未經B細胞誘導活化的特 異性CTL細胞的比例（流式細胞檢測結果圖）。其中，A為經B細胞誘導活化的特異性CTL 細胞的比例，B為未經B細胞誘導活化的特異性CTL細胞的比例。
[0030] 圖3為51Cr釋放試驗測定CTL對靶細胞的殺傷活性結果圖。
[0031] 圖4為CEA抗原特異性CTL細胞的表型鑒定結果（流式細胞檢測結果圖）。
【具體實施方式】
[0032] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0033] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0034] 下述實施例中所用到的B細胞、⑶8+T細胞、非⑶8粘附細胞來源于捐贈者。
[0035] 重組人 IL-4(rhIL-4) :R&D 公司，貨號為 AFL204-01M ;重組人 CD40L(sCD40L) :R&D 公司，貨號為6420-CL-025。
[0036] 胸腺肽a 1 :為蘇州天馬醫(yī)藥集團天吉生物制藥有限公司產品，藥品批準文號 Η20103201。
[0037] HLA-A2+T2 空載細胞株：ATCC，ATCC 編號為 " ATCC?CRL -1992?"。
[0038] K562 細胞：ATCC，ATCC 編號為 "CCL-243?"。
[0039] 實施例1、用于治療結直腸腫瘤的⑶8+細胞毒性T淋巴細胞的制備
[0040] 一、CEA61qd多肽的制備
[0041] CEA天然表位CEA6(l5_61j^序列為YLSGANLNL。本發(fā)明在6位上以天冬氨酸（D) 替代天冬酰胺（N)，采用固相合成法合成新的修飾CEA抗原肽（CEA61J,氨基酸序列為 YLSGADLNL(序列1)。該抗原肽是與MHCI類分子具有高親和結合的多肽分子。
[0042] 二、負載CEA61qd多肽的B細胞的制備
[0043] 1、B細胞的分離鑒定
[0044] 通過⑶20磁珠分離離體HLA-A2陽性腫瘤患者的外周血單個核細胞（PBMC)中的 B細胞，以獲得高純度（90 %以上）的B細胞。
[0045] 通過流式細胞檢測技術，采用熒光標記抗體anti-⑶3-PERCP和anti-⑶19-APC 鑒定以上分選所得細胞中B細胞的純度，表型為⑶3XD19+的細胞即為B細胞。其中， 熒光標記抗體ant i-CD3-PerCP為德國美天旎生物技術有限公司產品，其產品目錄號為 130-094-965 ;anti-⑶19-APC為德國美天旎生物技術有限公司產品，其產品目錄號為 130-091-248。
[0046] 結果如圖1所示，從圖中可以看出，將上述分選后的B細胞比例達94. 8%。
[0047] 2、B細胞的活化
[0048] 將步驟1獲得的人B細胞濃度調整為3 X l〇7ml，采用含有rhIL-4和s⑶40L的培 養(yǎng)液（配方為：含有5ng/ml IL-4