一種直投式凝乳酶制劑的制備方法及其產(chǎn)物和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種直投式凝乳酶制劑的制備方法及其產(chǎn)物 和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 凝乳酶是干酪生產(chǎn)中的關(guān)鍵性酶，它對干酪的質(zhì)構(gòu)形成及特有風味的形成有非常 重要的作用。國際市場上凝乳酶中動物來源的約占70%，微生物的占30 %，隨著干酪工業(yè) 的不斷發(fā)展，動物來源的凝乳酶已遠不能滿足生產(chǎn)需要，各國研宄者不斷地尋找新的來源。 目前發(fā)現(xiàn)微生物可產(chǎn)生一定活力的凝乳酶主要是放線菌、細菌和霉菌等，包括放線菌中鏈 霉菌屬、小單孢菌屬、馬杜拉放線菌屬、根霉、總狀毛霉、微小毛霉、米黑毛霉、粟疫菌、寄生 內(nèi)座殼菌、易脆毛霉以及其他通過基因工程或輻照獲得的高產(chǎn)凝乳酶的菌株等。
[0003]將篩選出的高產(chǎn)凝乳酶菌株通過優(yōu)化培養(yǎng)條件后，確定較佳的凝乳酶提取的方法 和條件，成為當今國內(nèi)外凝乳酶研宄的一個重要的方向。然而，目前國內(nèi)微生物源凝乳酶需 從發(fā)酵液提取獲得后才能投入商業(yè)化應(yīng)用，其提取方法主要涉及了硫酸銨分步法鹽析、氯 化鈉鹽析法以及乙醇分步提取法等，且提取的凝乳酶多集中于對毛霉相關(guān)研宄，其純化過 程還需要通過層析柱處理，過程較為復(fù)雜且增大了凝乳酶的損失率。
[0004] 目前我國對凝乳酶的研宄較淺，生產(chǎn)干酪的凝乳酶主要依靠國外進口。只 有少數(shù)科研單位對產(chǎn)凝乳酶的菌種及制備工藝進行了較系統(tǒng)的研宄。中國專利申請 (CN 103740618A)公開了類芽抱桿菌屬的一個新菌種（Paenibacillus damxungensis sp. nov.)，并將其中的模式菌株BD3526于2013年10月14日保藏在中國微生物菌種保藏 管理委員會普通微生物中心（CGMCC)，該菌株的保藏編號為：CGMCC No.8333。中國專利申 請（CN 103865842A)公開了類芽孢桿菌（Paenibacillus sp.)CGMCC No. 8333 菌株的麩皮 培養(yǎng)物上清液具有凝乳酶活力，然而，麩皮原料作為一種小麥加工的副產(chǎn)品，目前尚無明確 的產(chǎn)品標準，從而導(dǎo)致不同來源的麩皮發(fā)酵上清液中的凝乳酶活力高低不一，波動性極大， 這給該類芽孢桿菌及其發(fā)酵產(chǎn)物的工業(yè)化應(yīng)用帶來了很大障礙。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 因此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題就是針對目前凝乳酶的天然來源和產(chǎn)量嚴重不 足，而利用不同來源的麩皮培養(yǎng)基培養(yǎng)類芽孢桿菌所得上清液中的凝乳酶活力高低不一， 波動性極大的技術(shù)問題，提供了一種直投式凝乳酶制劑的制備方法及其產(chǎn)物和應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明所述制備方法創(chuàng)造性地使用脫脂乳作為培養(yǎng)介質(zhì)，將所得具有凝乳酶活力 的發(fā)酵上清或其凍干制劑直接應(yīng)用于干酪的制備工藝。相比傳統(tǒng)制備方法，本發(fā)明公開的 制備方法大幅簡化了凝乳酶制劑的應(yīng)用步驟，最大限度地保留了凝乳酶活力，從而有效降 低了凝乳酶制劑的生產(chǎn)與應(yīng)用成本。此外，與現(xiàn)有制備方法相比本發(fā)明方法使用的脫脂乳 培養(yǎng)基成分性質(zhì)明確，成分含量穩(wěn)定，解決了由于發(fā)酵基料成分不穩(wěn)定造成的所得凝乳酶 的活性波動幅度極大的問題，為類芽孢桿菌及其發(fā)酵產(chǎn)物的工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)以及在干酪 制備中的應(yīng)用提供了極大的保障。
[0007] 盡管類芽孢桿菌（Paenibacillus sp. )CGMCC No. 8333菌株的麩皮培養(yǎng)物上清液 具有凝乳酶活力已有披露，但其凝乳酶活力因麩皮的不同產(chǎn)地或批次等因素會產(chǎn)生較大的 波動。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，該菌株的脫脂乳發(fā)酵液同樣具有優(yōu)良的凝乳酶活力，更重要的是，本 發(fā)明所述的制備方法所用的發(fā)酵基料為脫脂乳時，該培養(yǎng)基的成分明確而且含量穩(wěn)定，與 麩皮培養(yǎng)基相比具有更穩(wěn)定的凝乳酶產(chǎn)出效率，因此利用脫脂乳培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)類芽孢桿 菌所得發(fā)酵液上清或者凍干粉可直接應(yīng)用于標準化程度較高的大規(guī)模工業(yè)化干酪生產(chǎn)制 備工藝。
[0008] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案之一是：一種直投式凝乳酶制劑 的制備方法，所述制備方法包括以下步驟：利用脫脂乳培養(yǎng)類芽孢桿菌（Paenibacillus sp.) 25°C~35°C，震蕩培養(yǎng)20~120小時得到發(fā)酵液，將所得發(fā)酵液離心后取上清液即得。
[0009] 其中所述類芽孢桿菌為產(chǎn)凝乳酶的類芽孢桿菌，較佳地為CGMCC No. 8333菌株。該 類芽孢桿菌的模式菌株BD3526已于2013年10月14日保藏在中國微生物菌種保藏管理委 員會普通微生物中心（CGMCC)，它的分類命名是類芽孢桿菌（Paenibacillus sp.)，其保藏 編號為：CGMCC No. 8333(具體內(nèi)容請參見中國專利申請CN 103740618A)。
[0010] 其中所述脫脂乳為本領(lǐng)域常規(guī)所述的脫脂乳，所述脫脂乳的制備方法為本領(lǐng)域常 規(guī)的制備方法。其中所述脫脂乳更佳地是將鮮乳經(jīng)過脫脂和除菌后制得的，所述脫脂的方 法較佳地是將生鮮乳通過脂肪分離機處理，如離心等加工方式處理所得；更佳地是由脫脂 乳粉加水還原制備得到。較佳地，所述脫脂乳由5% -15%的脫脂乳粉和補足至100%的水 還原制得，更佳地，所述脫脂乳由6% -12%的脫脂乳粉和補足至100%的水還原制得，最佳 地，所述脫脂乳由10%的脫脂乳粉和90%的水還原制得，所述百分比為質(zhì)量百分比。
[0011] 其中所述的培養(yǎng)的溫度較佳地為28 °C~35 °C，更佳地為30 °C ;所述震蕩培養(yǎng)的震 蕩速度較佳地為200rpm ;震蕩培養(yǎng)的時間較佳為24h~96h，更佳地為4288h~72h，最佳 地為48h。
[0012] 其中所述離心的溫度較佳地為2°C~4°C，離心的速度較佳地為6000g~15, 000g， 離心的時間較佳地為5min~15min更佳地為10min。當離心速度過高，或者離心時間過長 時，會顯著降低所得凝乳酶制劑的活力，最終影響酶制劑的凝乳效果。
[0013] 較佳地，所述制備方法還包括將所得上清液冷凍干燥的步驟，所述冷凍干燥較佳 地為真空冷凍干燥，所述真空冷凍干燥的溫度較佳地為-44°C~-40°C。
[0014] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案之二是：本發(fā)明所述制備方法所得 的直投式凝乳酶制劑。本發(fā)明制備所得直投式凝乳酶制劑的凝乳酶活力更穩(wěn)定，而且該直 投式凝乳酶制劑的應(yīng)用方法更為簡單方便。
[0015] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案之三是：本發(fā)明所述直投式凝乳酶 制劑在制備凝乳酶中的應(yīng)用。本發(fā)明所述凝乳酶的制備方法為本領(lǐng)域常