一種生物催化合成光學活性烷基內酯的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程技術領域，具體涉及生物催化轉化合成光學活性 (R) - (+) -4-己基-4- 丁內酯和（R) - (+) -5-戊基-5-戊內酯的方法。
【背景技術】
[0002] 光學活性的手性內酯，比如（R)-(+)_4-己基-4-丁內酯和（R)-(+)_5-戊基-5-戊 內酯，是重要的香料添加劑，在釀酒、食品制造等領域應用廣泛?；瘜W法拆分是制備高光學 純度手性內酯的常用方法，通常的化學拆分方法一般以外消旋的手性內酯為起始原料，在 堿性條件下水解開環(huán)，然后進行酯化和烷氧基衍生化生成非對映異構體混合物，對該混合 物進行分離，獲得單一構型的化合物，然后再進行水解和環(huán)化，得到光學純的手性內酯化合 物?；瘜W拆分方法步驟繁多，分離條件苛刻，理論產率最高為50%，產品光學純度低，不利于 光學純手性內酯化合物的高效低成本大規(guī)模制造。
[0003] 近年來，基于整細胞或酶制劑的生物催化工藝在光學活性手性化合物合成領域 取得了巨大成功。目前，生物催化合成光學活性烷基取代的手性內酯仍屬于一個較新 的領域，許多研發(fā)工作尚處于起步階段。G6tz等利用化學-酶法組合催化合成烷基衍 生的（S) - y -戊內酯（Appl. Microbiol. Biotechnol. 2013, 97:3865 - 3873)，需要使用 兩種不同的酶組合，成本較高，并且手性取代基為較短的甲基，無法合成含長鏈烷基取 代的手性內酯。陳兵等通過內酯酶催化合成2-羥基取代的手性烷基內酯（Adv. Synth. Catal. 2009, 351:2959-2966 ;Chem. Commun. 2010, 46:2754 - 2756)，但對 2 位無取代的烷基 內酯的催化合成效果不好。因此，開發(fā)簡單、高效、低成本的生物催化較長烷基取代的手性 內酯化合物合成方法，具有重要的工業(yè)應用價值。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術存在的缺陷而提供一種工藝簡單，環(huán)境 友好，具有很好的工業(yè)應用前景的生物催化合成光學活性烷基內酯的方法。
[0005] 本發(fā)明的目的可以通過以下技術方案來實現(xiàn)：一種生物催化合成光學活性烷基內 酯的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：
[0006] (1)使用生物催化劑催化羰基酸不對稱還原合成光學活性羥基酸；
[0007] ⑵在酸性環(huán)境中，使光學活性羥基酸環(huán)化生成光學活性內酯化合物。
[0008] 所述的生物催化劑來源于近平滑假絲酵母（Candida parapsilosis)，優(yōu)選的為來 源于近平滑假絲酵母CGMCC2. 3539。
[0009] 所述的生物催化劑為近平滑假絲酵母細胞；或者是將近平滑假絲酵母菌體破碎后 獲得的含有羰基還原酶的無細胞提取物。
[0010] 所述的生物催化劑可通過以下方法獲得：
[0011] ⑴靜息細胞的制備
[0012] 將近平滑假絲酵母菌CGMCC2. 3539在滅菌（121°C，20min)的豐富培養(yǎng)基（甘油 1%，蛋白胨0.5%，牛肉膏0.8%，瓊脂1.5% )斜面上劃線，于30°C靜置培養(yǎng)1-2天。
[0013] 取一環(huán)斜面菌種，接入種子培養(yǎng)基（甘油1 %，蛋白胨0. 5 %，牛肉膏0. 8 %，pH7. 0) 中，25-37°C培養(yǎng)24-48小時。再以該培養(yǎng)液作為種子，基于發(fā)酵培養(yǎng)基體積的接種量為 1-10% (v/v)接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，在25-37°C下150-250rpm搖床上培養(yǎng)24-48小時，培養(yǎng) 結束后離心得到靜息濕細胞。所述的發(fā)酵培養(yǎng)基可采用常規(guī)的培養(yǎng)基，其中各組分的含量 如下：甘油 10_50g/L，牛肉膏 l-20g/L，蛋白胨 l-20g/L，KH2P041-10g/L，Na2HP041-10g/L， NaCl 0? l-2g/L，MgS040. l-2g/L，pH 5-8。
[0014] (2)無細胞提取物的制備
[0015] 稱取收獲的濕細胞，懸浮于5~20倍體積質量比（v/w)的緩沖液中 (50mM，pH7. 0)，對細胞進行破碎處理。一般的，使用超聲波處理的方法進行細胞破碎，將細 胞懸浮液置于冰水浴中，超聲波功率為400W，超聲4s，間歇6s，計為一個循環(huán)，共進行99個 循環(huán)，將破碎液在4°C，lOOOOrpm高速離心，獲得的上清液即為無細胞提取物。
[0016] 無細胞提取物中的羰基還原酶活力測定：
[0017] 將含 2mmol/L 5-羰基癸酸和 0? lmmol/L NADPH 的 lmL 反應體系（100mmol/L Tris-HCl緩沖液，pH 7. 0)預熱至30°C，然后加入適量的無細胞提取物，30°C保溫反應，在 分光光度計上檢測340nm處NADPH的吸光度變化，記錄1分鐘內吸光度的變化值。
[0018] 按上述方法測定所述羰基還原酶的活力時，可用下式計算得到酶活力：
[0019] 酶活力（U) = EWXVX 107(6220X1)
[0020] 式中，EW為1分鐘內340nm處吸光度的變化；V為反應液的體積，單位為ml ;6220 為NADPH的摩爾消光系數(shù)，單位為L/(mol ?〇!!) ;1為光程距離，單位為cm。1個單位（U)羰 基還原酶對應于上述條件下每分鐘氧化1 U mol NADPH所需的酶量。
[0021] 所述的使用生物催化劑催化羰基酸不對稱還原的具體步驟為：在pH為6~8的緩 沖體系中，25~40°C條件下進行，加入底物4-羰基癸酸或5-羰基癸酸，羰基酸濃度（底物 濃度）為1~l〇〇g/L ;反應體系中還包含10~100g/L的葡萄糖，0~40kU/L的葡萄糖脫 氫酶和0~ImM的NADP+，反應時間為3~12h，間歇取樣，進行氣相色譜分析，直至產物濃 度不再持續(xù)上升時結束反應，生成光學活性的羥基酸。
[0022] 所述葡萄糖脫氫酶的獲得可參考文獻報道，例如參見Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology 2011，38,633_641〇
[0023] 所述的生物催化劑來源于近平滑假絲酵母細胞，即為上述靜息濕細胞時，每升反 應液的生物催化劑用量為10~l〇〇g近平滑假絲酵母細胞。
[0024] 所述的生物催化劑為含有羰基還原酶的無細胞提取物時，每升反應液的生物催化 劑用量為4-40kU羰基還原酶。
[0025] 所述的在酸性環(huán)境中，使光學活性羥基酸環(huán)化具體步驟為：將步驟（1)所得含有 羥基酸的反應液酸化至pH 1~2 (將反應液酸化，通常使用20% (w/v)的硫酸），60~80°C 加熱1~2h，促使羥基酸環(huán)化生成相應的內酯，使用水不溶性有機溶劑進行萃取，萃取液干