一種弱化發(fā)酵過程中乙酸積累以增強l-色氨酸產(chǎn)量的基因工程菌及其構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種弱化發(fā)酵過程中乙酸積累以增強L-色氨酸產(chǎn)量的基因工程菌及 其構(gòu)建方法,特別是利用蛋白質(zhì)工程的定點突變方法來降低比活力的技術(shù)及利用Red重組 技術(shù),通過兩步無痕替換法在基因組上進行基因置換的技術(shù),屬于代謝工程和基因工程領(lǐng) 域。
【背景技術(shù)】
[0002] L-色氨酸(L-tryptophan, L-Trp)作為人體內(nèi)的一種必需氨基酸,廣泛應(yīng)用于醫(yī) 藥、食品、飼料等行業(yè)。近年來,國外通過代謝工程的手段,逐漸培育出一批高產(chǎn)的L-Trp生 產(chǎn)菌株,但其在發(fā)酵過程中仍存在發(fā)酵后期L-Trp生產(chǎn)速率下降明顯,副產(chǎn)物積累等問題, 尤其是副產(chǎn)物乙酸的積累。當(dāng)乙酸濃度超過2g/L時就會影響菌株的生長及L-Trp的合成, 為盡可能的減少發(fā)酵過程中乙酸的積累以保證菌體的正常生長,發(fā)酵過程中必須保證溶氧 充足,然而這在工業(yè)化生產(chǎn)中不僅增加成本而且也很難達到實驗室提供的溶氧條件。因此 減少發(fā)酵過程中乙酸的積累及降低菌體對溶氧的需求,對提高L-Trp的工業(yè)化生產(chǎn)具有重 要意義。
[0003] 大腸桿菌通過兩條途徑生成乙酸:⑴丙酮酸氧化酶途徑,丙酮酸在PoxB作用下生 成乙酸;⑵乙酰磷酸途徑,acetyl-CoA在Pta (磷酸乙?;D(zhuǎn)移酶)作用下生成acetyl-p, 然后AckA(乙酸激酶)催化acetyl-p生成乙酸,而后者是生成乙酸的主要途徑。磷酸乙酰 基轉(zhuǎn)移酶是微生物體內(nèi)乙酸代謝途徑AckA-pta中的一個關(guān)鍵酶,也是在工業(yè)微生物發(fā)酵 過程中產(chǎn)生副產(chǎn)物乙酸的關(guān)鍵酶之一。因此獲得比活力降低的磷酸乙酰基轉(zhuǎn)移酶突變體, 并對基因組上的原編碼基因進行替換,編碼比活力降低的磷酸乙?;D(zhuǎn)移酶,有助于減少 發(fā)酵過程中乙酸的積累,從而有利于實現(xiàn)菌株的高密度發(fā)酵,而且有利于增加L-色氨酸的 生成。本發(fā)明以L-色氨酸生產(chǎn)菌株(重組大腸桿菌)FB-04(記作TS)(J Ind Microbiol Biotechnol,2011,38:1921 - 1929)為出發(fā)菌株,在其基因組上將磷酸乙?;D(zhuǎn)移酶編碼基 因內(nèi)的一個堿基進行替換,導(dǎo)致其編碼的第69位脯氨酸替換成亮氨酸,降低了磷酸乙?;?轉(zhuǎn)移酶的比活力,發(fā)酵過程中副產(chǎn)物乙酸的積累減少,L-色氨酸產(chǎn)量增加,為工業(yè)化發(fā)酵生 產(chǎn)其他氨基酸提供借鑒。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004] 本發(fā)明提供了一種弱化發(fā)酵過程中乙酸積累以增強L-色氨酸產(chǎn)量的基因工程 菌,其特征在于,在L-色氨酸生產(chǎn)菌株(重組大腸桿菌)FB-04(記作TS) (J Ind Microbiol Biotechnol,2011,38:1921 - 1929)基因組上將磷酸乙?;D(zhuǎn)移酶編碼基因內(nèi)的一個堿基 進行替換,導(dǎo)致其編碼的第69位脯氨酸替換成亮氨酸,降低了磷酸乙?;D(zhuǎn)移酶的比活 力,發(fā)酵過程中副產(chǎn)物乙酸的積累減少,L-色氨酸產(chǎn)量增加。
[0005] 所述磷酸乙?;D(zhuǎn)移酶突變體以大腸桿菌TS磷酸乙?;D(zhuǎn)移酶氨基酸序列(與 NCBI登錄號:NP_416800. 1所示氨基酸序列相同)為出發(fā)序列,將第69位脯氨酸替換成亮 氨酸得到的突變體。
[0006] 能表達權(quán)利要求1所述磷酸乙酰基轉(zhuǎn)移酶突變體的基因工程菌或轉(zhuǎn)基因細胞系, 及在基因組上進行無痕替換的載體也屬于本專利要求保護的范圍。
[0007] 本發(fā)明不僅提供一種制備所述磷酸乙酰基轉(zhuǎn)移酶突變體的方法,還提供一種制備 所述突變菌株的方法。利用Red重組方法,通過兩步無痕法在基因組上進行基因置換。
[0008] 具體而言,是以大腸桿菌TS磷酸乙?;D(zhuǎn)移酶核苷酸序列為出發(fā)序列,將其內(nèi)部 一個堿基進行替換,使第69位脯氨酸替換成亮氨酸,并在TS基因組上進行磷酸乙?;D(zhuǎn)移 酶編碼基因的置換,使其編碼的氨基酸第69位脯氨酸替換成亮氨酸得到的突變菌株。
[0009] 所述制備一種弱化發(fā)酵過程中乙酸積累以增強L-色氨酸產(chǎn)量的基因工程菌的方 法,具體步驟如下:
[0010] 1)利用Swiss-model軟件對源自大腸桿菌磷酸乙酰基轉(zhuǎn)移酶進行模擬,獲得磷酸 乙酰基轉(zhuǎn)移酶空間結(jié)構(gòu),通過對磷酸乙?;D(zhuǎn)移酶的序列以及空間結(jié)構(gòu)進行分析,確定要 突變的氨基酸位點。
[0011] 2)根據(jù)大腸桿菌磷酸乙?;D(zhuǎn)移酶氨基酸序列(NCBI登錄號:NP_416800. 1),將 其所對應(yīng)的編碼核苷酸序列(Genbank登陸號NC_000913. 3 :2414747-2416891)克隆到質(zhì)粒 pET-24a(+)中,構(gòu)建重組質(zhì)粒。
[0012] 3)設(shè)計突變引物,對磷酸乙?;D(zhuǎn)移酶基因序列進行定點突變,將所述位點的氨 基酸進行替換,獲得含有突變磷酸乙?;D(zhuǎn)移酶序列的重組載體。
[0013] 4)設(shè)計重疊PCR引物,分別以pKD13質(zhì)粒和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168)基因組為模版,通過重疊PCR的方法得到卡那霉素和SacB基 因相連的DNA片段,將此片段克隆到pMD18載體中,構(gòu)建用于無痕替換的質(zhì)粒kan-sacB/ pMD18。
[0014] 5)設(shè)計含磷酸乙?;D(zhuǎn)移酶基因同源臂的重組引物,以kan-sacB/pMD18質(zhì)粒為 模版,采用PCR方法得到兩端含同源臂的kan-sacB DNA片段,將此片段轉(zhuǎn)入到TS菌中,利 用Red重組獲得基因組上磷酸乙?;D(zhuǎn)移酶基因被kan-sacB DNA片段替換的突變菌株。
[0015] 6)以3)所述突變的重組載體為模板,將用PCR方法得到的突變的磷酸乙酰基轉(zhuǎn)移 酶基因轉(zhuǎn)入到5)所述的菌株中,利用Red重組獲得基因組上磷酸乙酰基轉(zhuǎn)移酶突變的突變 菌株。
[0016] 本發(fā)明提供的磷酸乙酰基轉(zhuǎn)移酶突變體比活力顯著降低,為突變前的60. 4%。相 對于采用篩菌或誘變等手段,縮短了改造時間。將色氨酸生產(chǎn)菌株TS的基因組上的磷酸乙 ?;D(zhuǎn)移酶編碼基因替換成帶有相應(yīng)突變的突變體,得到L-色氨酸突變菌株TS-PtaP69L。 將該磷酸乙?;D(zhuǎn)移酶突變體應(yīng)用于工業(yè)微生物發(fā)酵領(lǐng)域,有利于在微生物高密度發(fā)酵過 程中減少乙酸的積累,增加發(fā)酵目的產(chǎn)物的產(chǎn)生,具有廣闊的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0017] 圖 lkan-sacB/pMD18 質(zhì)粒圖譜
[0018] 圖2突變菌株(TS_PtaP69L)與對照(TS)搖瓶發(fā)酵乙酸含量
[0019] 圖3突變菌株(TS-PtaP69L)與對照(TS)搖瓶發(fā)酵色氨酸含量
[0020] 圖4突變菌株(TS-PtaP69L)與對照(TS) 3L發(fā)酵罐發(fā)酵乙酸含量
[0021] 圖5突變菌株(TS-PtaP69L)與對照(TS) 3L發(fā)酵罐發(fā)酵色氨酸含量
【具體實施方式】
[0022] 實施例1 :野生型磷酸乙?;D(zhuǎn)移酶基因的克隆及重組菌株的構(gòu)建
[0023] 以磷酸乙?;D(zhuǎn)移酶編碼基因序列(Genbank登陸號NC_000913. 3: 2414747-2416891)為模板,設(shè)計擴增引物P1和P2,采用PCR方法擴增磷酸乙?;D(zhuǎn)移酶 基因pta,克隆到pMD18載體(商業(yè)化工具載體),連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109,轉(zhuǎn)化產(chǎn)物 涂布含100mg/L氨芐青霉素的LB平板。經(jīng)37°C培養(yǎng)過夜,挑選菌落,接入LB液體培養(yǎng)基, 8-10h后提取質(zhì)粒,命名為pta/pMD18,將此質(zhì)粒進行序列測定。結(jié)果表明插入片段為一個 2145bp的DNA片段,編碼一個含有704個氨基酸的蛋白質(zhì)。將pET24a(+)質(zhì)粒和含有pta 基因的T載體分別進行Nde I和Hind III雙酶切,酶切產(chǎn)物割膠回收后,再用T4連接酶連接。 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli JM109感受態(tài)細胞,經(jīng)37°C培養(yǎng)8h,挑轉(zhuǎn)化子在含有30mg/L卡納霉 素的LB中振蕩培養(yǎng),提取質(zhì)粒,酶切驗證,得到表達質(zhì)粒pta/pET24a(+)。
[0024] 將質(zhì)粒pta/pET24a(+)轉(zhuǎn)化E. coli BL21(DE3)宿主菌,涂布含卡納霉素(30mg/ L)的LB平板上,37°C培養(yǎng)8h,命名為pta/pET24a(+)/BL21 (DE3)。挑單菌落至液體LB中, 37 °C培養(yǎng)過夜,保存甘油管。
[0025] 磷酸乙酰基轉(zhuǎn)移酶編碼基因擴增引物:
[0026]正向引物 P1:5 '-AAACATATGTCCCGTATTATTATGCTGATCC-3'
[0027]反向引物 P2:5 ' -CCCAAGCTTTTACTGCTGCTGTGCAGACTG-3 '
[0028] 實施例2 :突變體的制備
[0029]1)突變體的構(gòu)建
[0030] 對來源于L-色氨酸生產(chǎn)菌株(重組大腸桿菌)FB-04 (記作TS) (J Ind Microbiol Biote