一種具有降血糖兼調(diào)脂作用的新型表位組合肽及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種新型肽及其用途，尤其是具有降血糖兼調(diào)脂作用的新型雙表位肽 及其用途，以及含有該新型肽及其主要組成片段的衍生物和類似物的藥物制劑與藥物組合 物，本發(fā)明涉及藥學(xué)及醫(yī)學(xué)相關(guān)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 糖尿?。―iabetes mellitus，DM)是以胰島素相對或絕對不足為特征的代謝性疾 病，胰島素相對或絕對不足引發(fā)高血糖，進而導(dǎo)致三大營養(yǎng)物質(zhì)代謝紊亂，胰島素絕對缺乏 為1型糖尿病，胰島素相對缺乏為2型糖尿病。1型糖尿病又名胰島素依賴型糖尿?。═ype ldiabetes mellituS，TlDM)是由遺傳和環(huán)境因素相互作用而引起的一種自身免疫性疾病。 由于機體自身反應(yīng)性免疫應(yīng)答攻擊胰島0細胞，使其遭破壞、功能缺失，從而導(dǎo)致胰島素 絕對缺乏所引起的糖尿病。由于0細胞具有產(chǎn)生胰島素和調(diào)節(jié)血糖的功能，0細胞群的 毀壞最終導(dǎo)致了血糖的失調(diào)和高糖血癥的發(fā)生。T1DM是由T細胞介導(dǎo)的器官特異性自身 免疫性疾病，自身免疫性疾病是因機體免疫系統(tǒng)對自身成分發(fā)生免疫應(yīng)答而導(dǎo)致的疾病狀 態(tài)。通過一定的免疫途徑來誘導(dǎo)機體對致自身免疫性疾病自身抗原的耐受能有效預(yù)防自身 免疫性疾病的發(fā)生。糖尿病帶來的危害，幾乎都來自它的并發(fā)癥。
[0003] 動脈粥樣硬化是糖尿病的主要并發(fā)癥，是糖尿病患者死亡和致殘的重要原因，臨 床觀察表明，無論1型或2型糖尿病，常伴有動脈粥樣硬化性心腦血管疾病。糖尿病人因心 肌梗死而死亡者，可占糖尿病死亡人數(shù)的75% -80%。同樣，在冠心病人群中，高血糖人群 占總?cè)巳旱?/3,動脈粥樣硬化常常伴隨著血脂尤其是膽固醇的升高，高血脂是冠心病、心 肌梗死、等心血管疾病的危險因素。實驗研宄表明，多次小劑量注射STZ不僅可以誘導(dǎo)T1DM 模型，且該模型小鼠血清總膽固醇與甘油三酯會顯著升高。正常情況下膽固醇對于維持細 胞膜的完整性和體內(nèi)生命活動具有重要的意義，但體內(nèi)過多的膽固醇會引起動脈粥樣硬化 等心腦血管疾病。HMG-CoA還原酶（3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶，EC :1. 1. 1. 34) 是肝細胞合成膽固醇過程中的限速酶，抑制HMG-CoA還原酶能阻礙內(nèi)源性膽固醇合成。因 此抑制HMG-CoA還原酶活性來阻礙膽固醇的合成，可降低血膽固醇水平從而預(yù)防動脈粥樣 硬化，同時降低臨床心腦血管事件的發(fā)生概率。研宄表明，在血脂降低程度相似的條件下， 糖尿病和非糖尿病患者的相對危險分別降低了 21 %與23%。
[0004] P277肽是HSP60的437~460位的一段特異性多肽，共24個氨基酸，也是能與效 應(yīng)T細胞反應(yīng)的抗原決定簇，是在T1DM中發(fā)揮作用的特異片段。DiaPep277目前已進入 III期臨床研宄。已有實驗研宄發(fā)現(xiàn)按照國外DiaPep277相同的皮下給藥方式，用P277肽 進行給藥，能引起血管內(nèi)皮細胞損傷，并誘發(fā)肌體產(chǎn)生抗體從而誘發(fā)嚴重的動脈粥樣硬化； 將P277分成P1肽段（437~450)和P2肽段（448~460)兩部分，發(fā)現(xiàn)P1多肽為誘發(fā)機 體產(chǎn)生抗體的B表位肽段，具有促動脈粥樣硬化作用，而P2為主要的抗糖尿病T表位肽段， 沒有誘發(fā)動脈粥樣硬化。
[0005] B細胞是主要的抗原提呈細胞，而B細胞表位可以通過刺激B細胞反應(yīng)以及與Th2 型T淋巴細胞的相互作用來增強抗炎免疫功能。盡管T表位是主要的效應(yīng)表位而B細胞表 位僅是輔助性表位，B細胞表位仍然在抗T1DM中扮演著重要角色。我們運用B細胞表位預(yù) 測軟件以及在線預(yù)測工具，對糖尿病并發(fā)癥動脈粥樣硬化相關(guān)蛋白HMG-CoA還原酶B細胞 抗原表位分析，選擇一個線形B表位插入P2肽段的N端，形成新型雙表位肽H278P，該雙表 位肽可能具有降血糖，調(diào)節(jié)血脂以及預(yù)防或治療糖尿病、高血脂、動脈粥樣硬化、心腦血管 疾病的作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 發(fā)明目的：
[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種具有顯著降糖與調(diào)脂效果的新型雙表位肽H278P。
[0008] 技術(shù)方案：
[0009] -種新型雙表位肽H278P，由28個氨基酸組成，其特征是一個雙表位組合物， 由HMG-CoA還原酶的線性B表位HGRWIADPSPQNSTT與P277肽C端抗糖尿病的T表位 IPALDSLTPANED 組合而成，其氨基酸序列為：HGRWIADPSPQNSTTIPALDSLTPANED。
[0010] 所述的新型雙表位肽疫苗以及含有該序列的多肽在制備降血糖與調(diào)脂產(chǎn)品中的 應(yīng)用，所述新型雙表位肽在預(yù)防或治療糖尿病、高血脂、動脈粥樣硬化、心腦血管疾病中的 應(yīng)用。
[0011] 所述的新型肽通過氨基酸修飾、置換得到的氨基酸序列在制備降血糖與調(diào)脂產(chǎn)品 以及在預(yù)防或治療糖尿病、高血脂、動脈粥樣硬化、心腦血管疾病中的應(yīng)用。
[0012] 所述含新型肽的藥物組合物，其特征在于新型肽和一種或多種藥學(xué)上可接受的輔 料、藥物活性物質(zhì)或藥學(xué)可接受的載體。
[0013] 所述以新型雙表位肽H278P為有效成分的制劑為含有H278P的注射劑、緩釋劑、皮 下埋植劑、片劑、粉劑、顆粒劑、膠囊或者口服液。
[0014] 所述的輔料為填充劑、稀釋劑、賦形劑等。例如包括但不限于：乳糖、鹿糖、葡萄糖、 淀粉、纖維素類（如羧甲基纖維素、羥丙甲基纖維素等）、乙二醇、豆油、芝麻油、乙醇、無菌 生理鹽水、無菌水等。
[0015] 所述的藥物活性物質(zhì)為胰島素及其類似物、GLP-1及其類似物、Exendin-4及其 類似物、雙胍類、磺脲類；其中雙胍類包括苯乙雙胍、丁二胍、二甲雙胍；磺脲類藥物包括列 苯脲、米克胰、格列齊特、克糖利、格列波脲、格列喹酮、糖適平、美吡達、糖腎平；降低膽固醇 的他汀類藥物；抗血小板聚集藥物；噻唑烷二酮類藥物。他汀類藥物包括洛伐他汀、辛伐 他汀、普伐他汀、美伐他汀、氟伐他汀、阿托伐他汀、西立伐他汀、羅伐他??；抗血小板凝集藥 物包括阿司匹林、雙嘧達莫、前列環(huán)素、噻氯匹啶；噻唑烷二酮類藥物包括吡格列酮、羅格 列酮；所述的藥物載體為熱休克蛋白HSP60/65、門冬酰胺酶、門冬酰胺酶-TTP、門冬酰胺 酶-TTP-CETPC。
[0016] 所述的組合物在制備降血糖與調(diào)脂產(chǎn)品以及在預(yù)防或治療糖尿病、高血脂、動脈 粥樣硬化、心腦血管疾病中的應(yīng)用。
[0017] -種新型肽疫苗的制備方法，其特征在于其氨基酸序列的確定按照如下步驟實 現(xiàn)：
[0018] 運用B細胞抗原表位分析軟件以及在線分析工具篩選出糖尿病并發(fā)癥相關(guān)蛋白B 細胞抗原表位HGRWIADPSPQNSTT，插入P2肽段IPALDSLTPANED的N端，形成新型雙表位肽 H278P，由28個氨基酸組成。
[0019] 有益效果：
[0020] P277 肽 437VLGGGCALLRCIPALDSLTPANED460 是 HSP60 - 段特異性多肽，共 24 個氨基酸，也是能與效應(yīng)T細胞反應(yīng)的抗原決定簇，是在T1DM中發(fā)揮作用的特異片段。 DiaP印277目前已進入III期臨床研宄。已有實驗研宄發(fā)現(xiàn)按照國外DiaP印277相同的皮 下給藥方式，用P277肽進行給藥，能引起血管內(nèi)皮細胞損傷，并誘發(fā)肌體產(chǎn)生抗體從而誘 發(fā)嚴重的動脈粥樣硬化，并將P277分成P1肽段（437~450)和P2肽段（448~460)兩部 分，發(fā)現(xiàn)P1多肽為誘發(fā)機體產(chǎn)生抗體的B表位肽段，具有促動脈粥樣硬化作用，而P2為抗 糖尿病T表位肽段，沒有誘發(fā)動脈粥樣硬化。
[0021] 本發(fā)明的優(yōu)點在于用HMG-CoA還原酶（3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶，EC: 1. 1. 1. 34)線性B細胞抗原表位替換了 P277中有促動脈粥樣硬化作用的P1肽段（437~ 450)，插入到P2肽段的上游N端，獲得一種能夠有效降糖與調(diào)脂的新型雙表位肽H278P。
【附圖說明】
[0022] 圖1ESI-MS測定本發(fā)明新型肽H278P的分子量。
[0023] 圖2新型雙表位肽對STZ造模后的糖尿病小鼠治療實驗中的血糖值的影響。
[0024] 圖3新型雙表位肽對STZ造模后的糖尿病小鼠治療實驗中血脂的影響（A:成模后 第7周與第13周膽固醇水平；B:成模后第7周與第13周甘油三酯水平；C:成模后第7周 與第13周高密度脂蛋白膽固醇水平）。
【具體實施方式】
[0025] 實施例1:新型多肽H278P的制備過程
[0026] 合成一種新型雙表位肽其氨基酸序列為：HGRWIADPSPQNSTTIPALDSLTPANED (命名 為 H278P，見 SEQ ID NO. 1)，P277(VLGGGCALLRCIPALDSLTPANED，見 SEQ ID N0.2)上述肽類 均由吉爾生化上海有限公司采用FM0C固相合成法合成，HPLC檢測純度> 90%。
[0027] H278P具體合成過程如下：