一種新型的雙表位組合肽及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種新型的雙表位組合肽及其用途，尤其是具有調(diào)血糖兼具調(diào)脂作用 的新型肽及其用途，以及含有該新型肽及其主要組成片段的衍生物和類似的藥物制劑，本 發(fā)明涉及藥學(xué)及醫(yī)學(xué)相關(guān)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 糖尿病（Diabetes mellitus，DM)是由于胰島素絕對或相對不足而引起的、以高 血糖和多發(fā)并發(fā)癥并存等為特點的內(nèi)分泌代謝性疾病，是最常見的慢性病之一。通常將糖 尿病分為兩大類型，1型糖尿?。═ype ldiabetes mellitus，TlDM)是由于分泌胰島素的細 胞被破壞導(dǎo)致的一種自身免疫性疾病；2型糖尿?。═ype 2diabeteS mellituS，T2DM)是患 者不能有效利用自身分泌的胰島素，并在發(fā)病過程中伴隨著胰島素抵抗、胰島素分泌障礙 以及肝糖原輸出過多等許多代謝性障礙。目前認(rèn)為TIDM是T細胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病， 以遺傳性為基礎(chǔ)，在某些環(huán)境因素（微生物、化學(xué)物質(zhì)、食物成分）的作用下，誘發(fā)以胰島炎 為病理特征的胰島B細胞自身免疫反應(yīng)，損傷胰島0細胞使其喪失合成和分泌胰島素的功 能，引起代謝素亂。
[0003] 動脈粥樣硬化（AS)是糖尿病常見的并發(fā)癥之一，是一組稱為動脈硬化的血管病 中最常見、最重要的一種。特點是受累動脈的病變從內(nèi)膜開始，先后有多種病變合并存在， 包括局部有脂質(zhì)和復(fù)合糖類積聚、纖維組織增生和鈣質(zhì)沉著形成斑塊，并有動脈中層的逐 漸退變，繼發(fā)性病變尚有斑塊內(nèi)出血、斑塊破裂及局部血栓形成。糖尿病致動脈粥樣硬化可 遍及全身各重要器官，可累及大血管，也可累及微血管，引起冠心病、腦血管意外、腎動脈硬 化、糖尿病腎病、糖尿病視網(wǎng)膜病變，神經(jīng)系統(tǒng)病變、糖尿病足等，危害嚴(yán)重。大多數(shù)糖尿病 患者死于心、腦血管動脈粥樣硬化或糖尿病腎病。
[0004] 高血脂癥，即血清膽固醇、甘油三酯增高、高密度脂蛋白降低，是引起心腦血管疾 病的一個主要原因。經(jīng)多次實驗研宄證實，用腹腔注射STZ得到的1型糖尿病小鼠血清中 甘油三酯和總膽固醇比正常小鼠顯著升高，高密度脂蛋白顯著降低。大量的流行病學(xué)調(diào)查 和研宄均表明，高脂血癥是動脈粥樣硬化、冠心病、高血壓、糖尿病、膽結(jié)石等多種疾病的重 要因素，嚴(yán)重危害人類健康。心腦血管病發(fā)生的機理很多，其中脂質(zhì)代謝紊亂是其中重要的 病因之一。目前研宄表明，甘油三酯、總膽固醇升高以及高密度脂蛋白下降可促進動脈粥 樣硬化的形成，從而造成血管病變、循環(huán)障礙及血流動力學(xué)改變，最終導(dǎo)致心腦血管病的發(fā) 生。因此，降低甘油三酯、總膽固醇、升高高密度脂蛋白可以治療高血脂癥以及心腦血管病。
[0005] P277肽是HSP60的437~460位的一段特異性多肽，共24個氨基酸，也是能與效 應(yīng)T細胞反應(yīng)的抗原決定簇，是在T1DM中發(fā)揮作用的特異片段。DiaP印277目前以進入III 期臨床研宄。已有實驗研宄發(fā)現(xiàn)按照國外DiaPep277相同的皮下給藥方式，用P277肽進行 給藥，能引起血管內(nèi)皮細胞損傷，并誘發(fā)機體產(chǎn)生抗體從而誘發(fā)嚴(yán)重的動脈粥樣硬化；并將 P277分成P1肽段（437~450)和P2肽段（448~460)兩部分，發(fā)現(xiàn)P1多肽具有一定的促 動脈粥樣硬化作用，而P2多肽卻沒有，并且P2能夠誘發(fā)等同于P277的免疫反應(yīng)，且P2多 肽涵蓋了 Elias報道的自身免疫性糖尿病相關(guān)的T表位片段，證明P2可能是P277用于治 療糖尿病的關(guān)鍵T細胞表位。
[0006] 3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶是膽固醇合成的關(guān)鍵性酶， 能夠抑制HMG-CoA還原酶活性的物質(zhì)具有很好的降血脂活性。他汀類藥物主要通過抑制 HMG-CoA還原酶活性實現(xiàn)降血脂作用。高血糖與高血脂有密不可分的關(guān)系，臨床上已經(jīng)將 他汀類藥物運用到糖尿病病人的治療，因此，選用HMG-CoA還原酶作為靶點，通過免疫抑制 HMG-CoA還原酶活性可以達到治療糖尿病的目的。
[0007] 抗原表位是免疫原抗原性的物質(zhì)基礎(chǔ)，開展對抗原表位的研宄將對抗原的診斷以 及分子疫苗的設(shè)計等具有重要的意義。T細胞表位與B細胞表位之間存在相互作用，B細胞 表位的存在可以增強T細胞表位的作用。因此發(fā)明人運用B細胞抗原表位分析軟件以及在 線分析工具對糖尿病并發(fā)癥相關(guān)蛋白HMG-CoA還原酶的B細胞抗原進行分析，得到B表位， 與P277肽C端的T細胞表位IPALDSLTPANED串聯(lián)得到新型雙表位組合肽H2-P2,所得到的 新型肽預(yù)計可以降低STZ誘導(dǎo)的1型糖尿病小鼠的血糖，并且能夠調(diào)節(jié)血脂，并且有望用于 1型糖尿病、動脈粥樣硬化、高血脂癥和心腦血管病藥物的開發(fā)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 發(fā)明目的：
[0009] 本發(fā)明的目的是提供一種具有調(diào)血糖兼具調(diào)脂效果的新型肽H2-P2。
[0010] 技術(shù)方案：
[0011] -種新型肽H2-P2,其特征是一種雙表位組合肽，其氨基酸組成如SEQ ID No. 1所 示序列，主要組成片段為HMG-CoA還原酶的B表位EPEIELPRER和P277肽C端的T細胞表 位 IPALDSLTPANED。
[0012] 所述新型肽H2-P2在調(diào)血糖、調(diào)脂產(chǎn)品上的應(yīng)用，所述的新型肽在制備防治1型糖 尿病、動脈粥樣硬化、高血脂癥和心腦血管病藥物中的應(yīng)用。
[0013] 所述的新型肽和一種或多種藥學(xué)上可接受的輔料、藥物活性物質(zhì)或藥學(xué)上可接受 的載體所組成的藥物組合物以及制劑在調(diào)血糖、調(diào)脂產(chǎn)品上的應(yīng)用，所述的新型肽和一種 或多種藥學(xué)上可接受的輔料、藥物活性物質(zhì)或藥學(xué)上可接受的載體所組成的藥物組合物以 及制劑在預(yù)防或治療1型糖尿病、動脈粥樣硬化和心腦血管病藥物中的應(yīng)用。
[0014] 所述的以新型肽H2-P2為有效成分的制劑為含有H2-P2的注射劑、緩釋劑、皮下埋 植劑、片劑、粉劑、顆粒劑、膠囊或者口服液。
[0015] 所述的輔料為填充劑、稀釋劑、賦形劑等。例如包括但不限于：乳糖、鹿糖、葡萄糖、 淀粉、纖維素類（如羧甲基纖維素、羥丙甲基纖維素等）、乙二醇、豆油、芝麻油、乙醇、無菌 生理鹽水、無菌水等。
[0016] 所述的藥物載體為熱休克蛋白HSP60/65、門冬酰胺酶-TTP、門冬酰胺 酶-TTP-CETPC，藥物活性物質(zhì)為胰島素及其類似物、GLP-1及其類似物、Exendin-4及其類 似物、磺脲類、雙胍類、他汀類；其中磺脲類包括格列苯脲、格列齊特、米克胰、格列博脲、克 糖利、格列喹酮、糖適平、糖腎平、美吡達；所述的雙胍類包括苯乙雙胍、二甲雙胍、丁二胍； 他汀類包括洛伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、阿托伐他汀、西立伐他汀、瑞舒伐他 汀。
[0017] -種新型的雙表位組合肽疫苗的制備方法，其特征在于氨基酸序列的確定按照 如下步驟實現(xiàn)：運用 B細胞抗原表位分析軟件以及在線分析工具對糖尿病并發(fā)癥相關(guān) 蛋白HMG-CoA還原酶的B細胞抗原進行分析，得到B表位，與P277肽C端的T細胞表位 IPALDSLTPANED串聯(lián)得到新型雙表位組合肽H2-P2,其氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示。
[0018] 有益效果：
[0019] P277 肽 437VLGGGCALLRCIPALDSLTPANED460 是 HSP60 - 段特異性多肽，共 24 個氨基酸，也是能與效應(yīng)T細胞反應(yīng)的抗原決定簇，是在T1DM中發(fā)揮作用的特異片段。 DiaP印277目前已進入III期臨床研宄。已有實驗研亢發(fā)現(xiàn)按照國外DiaP印277相同的皮 下給藥方式，用P277肽進行給藥，能引起血管內(nèi)皮細胞損傷，并誘發(fā)機體產(chǎn)生抗體從而誘 發(fā)嚴(yán)重的動脈粥樣硬化，并將P277分成P1肽段（437~450)和P2肽段（448~460)兩部 分，發(fā)現(xiàn)P1多肽具有一定的促動脈粥樣硬化作用，而P2多肽卻沒有，并且P2能夠誘發(fā)等同 于P277的免疫反應(yīng)，且P2多肽涵蓋了 Elias報道的自身免疫性糖尿病相關(guān)的T表位片段， 證明P2可能是P277用于治療糖尿病的關(guān)鍵T細胞表位。
[0020] 本發(fā)明公開了 HMG-CoA還原酶的一個B細胞表位EPEIELPRER，與P277肽C端的T 細胞表位IPALDSLTPANED串聯(lián)得到新型雙表位組合肽H2-P2,序列如SEQ ID No. 1所示，通 過實驗證明，H2-P2具有降血糖以及調(diào)節(jié)血脂的作用，可用于制備預(yù)防或治療1型糖尿病、 動脈粥樣硬化、高血脂癥和心腦血管病的多肽疫苗，具有重要的理論價值的廣闊的應(yīng)用前 景，能夠產(chǎn)生重大的社會效益和經(jīng)濟效益。
【附圖說明】
[0021] 圖1ESI-MS測定本發(fā)明新型肽H2-P2的分子量
[0022] 圖2新型肽H2-P2對不同劑量STZ造模后的1型糖尿病小鼠血糖值的影響（A : 40mg/kg ；B ：35mg/kg)
[0023] 圖3新型肽H2-P2對35mg/kgSTZ造模后1型糖尿病小鼠血脂的影響（A:甘油三 醋；B :總膽固醇；C :尚密度脂蛋白）
[0024] 圖例說明：與溶劑組相比：#p < 0? 01 ;*p < 0? 05 與 P277 組相比：# p < 0? 01 ;#p < 0? 05
【具體實施方式】
[0025] 實施例1:新型多肽H2-P2的制備過程
[0026] 合成一種雙表位組合肽，其氨基酸序列如SEQ NO. 1所示，命名為H2-P2,另陽性藥 P277,氨基酸序列如SEQ NO. 2所示，上述肽類均由吉爾生化上海有限公司采用FM0C固相合 成法合成，HPLC檢測純度> 90%。
[0027] H2-P2具體合成過程如下：
[0028] 1.選擇樹脂