十八個和少于一百個二硫鍵，或者 至少三個和少于十個二硫鍵，或者至少三個和少于八個二硫鍵的多肽；或者形成選自三個、 四個、五個、六個、七個、八個和九個的多個二硫鍵的多肽；或者是選自以下的多肽：(a)免 疫球蛋白重鏈、（b)免疫球蛋白輕鏈、（c)錳過氧化物酶和（d) (a)-(c)中任一的片段；或者 是英夫利昔單抗重鏈或輕鏈或者其片段，或者分別在SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31的至 少50%或80%的長度上具有與SEQ ID NO: 30或SEQ ID NO: 31的至少80%或90%的氨基 酸序列同一性，或者分別在SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15或SEQ ID N0:23的至少50%或 80% 的長度上具有與 SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15 或 SEQ ID NO: 23 的至少 80%或 90% 的 氨基酸序列同一性，或者具有SEQ ID N0:13、SEQ ID N0:15或SEQ ID N0:23的氨基酸序列； 或者是選自利用阿拉伯糖和利用木糖的酶如木糖異構(gòu)酶的多肽；或者是選自木質(zhì)素降解過 氧化物酶如猛過氧化物酶或多能過氧化物酶（versatile peroxidase)的多肽。
[0015] 在本發(fā)明的進一步的實施方式中，提供了包含兩個類型的表達構(gòu)建體的宿主細 胞，且在某些情況中，一個類型的表達構(gòu)建體通過包括將多核苷酸序列插入PBAD24多核 苷酸序列中的步驟的方法產(chǎn)生，和另一類型的表達構(gòu)建體通過包括將多核苷酸序列插入 PPR033多核苷酸序列中的步驟的方法產(chǎn)生。
[0016] 本發(fā)明的另一種情況是包含兩個或更多個類型的表達構(gòu)建體的宿主細胞，其中各 類型的表達構(gòu)建體包含誘導型啟動子，且其中宿主細胞具有編碼用于至少一個所述誘導 型啟動子的誘導劑的轉(zhuǎn)運蛋白的至少一個基因的基因功能的改變，且作為另一實例，其中 編碼轉(zhuǎn)運蛋白的基因選自araE、araF、araG、araH、rhaT、xylF、xylG和xylH，或特別地是 araE。作為進一步的實施方式，提供了包含兩個或更多個類型的表達構(gòu)建體的宿主細胞，其 中各類型的表達構(gòu)建體包含誘導型啟動子，且其中宿主細胞編碼代謝至少一個所述誘導型 啟動子的誘導劑的蛋白質(zhì)的至少一個基因的基因功能水平的降低，且作為進一步的實例， 其中編碼代謝至少一個所述誘導型啟動子的誘導劑的蛋白質(zhì)的基因選自araA、araB、araD、 prpB、prpD、rhaA、rhaB、rhaD、xylA和xylB。作為另外的實例，提供了包含兩個或更多個 類型的表達構(gòu)建體的宿主細胞，其中各類型的表達構(gòu)建體包含誘導型啟動子，且其中宿主 細胞編碼參與至少一個所述誘導型啟動子的誘導劑的生物合成的蛋白質(zhì)的至少一個基因 的基因功能水平的降低，該基因在進一步的實施方式中選自scpA/sbm、argK/ygfD、scpB/ ygfG、scpC/ygfH、rmlA、rmlB、rmlC 和 rmlDo
[0017] 本發(fā)明還提供包含兩個或更多個類型的表達構(gòu)建體的宿主細胞，其中各類型的所 述表達構(gòu)建體包含誘導型啟動子，且其中宿主細胞具有影響宿主細胞細胞質(zhì)的還原/氧化 環(huán)境的基因（其在一些實例中選自g〇r和gshB)的改變的基因功能；或者其中宿主細胞具 有編碼還原酶的基因（其在一些實施方式中是trxB)的降低的基因功能水平；或者其中宿 主細胞包含編碼至少一種二硫鍵異構(gòu)酶蛋白（其在一些實施方式中是DsbC)的至少一個表 達構(gòu)建體；或者其中宿主細胞包含編碼缺乏信號肽的DsbC形式的至少一個多核苷酸；或者 其中宿主細胞包含編碼Ervlp的至少一個多核苷酸。
[0018] 在本發(fā)明的其它方面中，提供了包含兩個或更多個類型的表達構(gòu)建體的宿主細 胞，其中各類型的所述表達構(gòu)建體包含誘導型啟動子，其中各類型的表達構(gòu)建體包含的誘 導型啟動子不是各其它類型的表達構(gòu)建體的誘導型啟動子，或者其中各類型的表達構(gòu)建體 包含的復制起點與各其它類型的表達構(gòu)建體的復制起點不同。
[0019] 作為本發(fā)明的特定實施例，提供了大腸桿菌宿主細胞，其包含兩個類型的表達構(gòu) 建體，其中一個類型的表達構(gòu)建體通過包括將多核苷酸序列插入PBAD24多核苷酸序列中 的步驟的方法產(chǎn)生，和另一類型的表達構(gòu)建體通過包括將多核苷酸序列插入PPR033多核 苷酸序列中的步驟的方法產(chǎn)生；且宿主細胞進一步包含以下的兩種或更多種：(a)araBAD 基因的刪除；(b)araE和araFGH基因的基因功能的改變；（C)laCY(A177C)基因；（d)prpB和 prpD基因的降低的基因功能；（e) sbm/scpA-ygfD/argK-ygfGH/scpBC基因的基因功能的降 低，沒有改變ygfl基因的表達；（f)g〇r和trxB基因的基因功能的降低；（g)AscG基因的基 因功能的降低；(h)編碼缺乏信號肽的DsbC形式的多核苷酸；和（i)編碼Ervlp、ChuA或 伴侶蛋白的多核苷酸；且在某些實例中，宿主細胞進一步包含含有編碼基因產(chǎn)物的多核苷 酸序列的至少一個表達構(gòu)建體，所述多核苷酸序列由誘導型啟動子轉(zhuǎn)錄，且在一些情況中， 基因產(chǎn)物選自：(a)免疫球蛋白重鏈；(b)免疫球蛋白輕鏈；和（c)錳過氧化物酶；和（d) (a)-(c)中任一的片段；或者是英夫利昔單抗重鏈或輕鏈或者其片段，或者分別在SEQ ID NO: 30 或 SEQ ID NO: 31 的至少 50%或 80% 的長度上具有與 SEQ ID NO: 30 或 SEQ ID NO: 31 的至少80%或90%的氨基酸序列同一性，或者具有SEQ ID N0:30或SEQ ID N0:31的氨基 酸序列；或者分別在SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15或SEQ ID NO: 23的至少50%或80%的 長度上具有與SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15或SEQ ID NO: 23的至少80%或90%的氨基酸 序列同一性，或者具有SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15或SEQ ID NO: 23的氨基酸序列；或者 是選自利用阿拉伯糖和利用木糖的酶如木糖異構(gòu)酶的多肽；或者是選自木質(zhì)素降解過氧化 物酶如錳過氧化物酶或多能過氧化物酶的多肽。
[0020] 本發(fā)明還提供了生產(chǎn)產(chǎn)品的方法，如通過生長如上所述的本發(fā)明的宿主細胞的培 養(yǎng)物；并添加至少一個誘導型啟動子的誘導劑到所述培養(yǎng)物中；本發(fā)明還提供通過這一方 法產(chǎn)生的基因產(chǎn)物或多聚產(chǎn)物，且在一些實施方式中，基因產(chǎn)物或多聚產(chǎn)物是抗體，或在更 特別的情況中，是非糖基化抗體、嵌合抗體或人抗體。
[0021] 本發(fā)明的系統(tǒng)和方法還提供包含宿主細胞的試劑盒，該宿主細胞包含兩個或更多 個類型的表達構(gòu)建體，其中各類型的所述表達構(gòu)建體包含誘導型啟動子；和提供包含通過 生長本發(fā)明的宿主細胞并添加至少一種誘導劑到培養(yǎng)物中而產(chǎn)生的基因產(chǎn)物或多聚產(chǎn)物 的試劑盒，其中在一些實施方式中多聚產(chǎn)物是抗體，或在更特別的情況中，是非糖基化抗 體、嵌合抗體或人抗體。
[0022] 附圖簡要說明
[0023] 圖1是可誘導共表達系統(tǒng)的示意性圖解，其包括宿主細胞（1)，該宿主細胞包含兩 種不同的可誘導表達載體（3)和（4)，其在施用誘導劑（5)時表達不同的基因產(chǎn)物，因而形 成多聚產(chǎn)物（6)。
[0024] 圖2是可誘導共表達系統(tǒng)的特定用途的示意性圖解，其中大腸桿菌宿主細胞基因 組（2)編碼二硫鍵異構(gòu)酶DsbC的胞質(zhì)形式（其缺乏信號肽）；表達載體pBAD24 (3)提供免 疫球蛋白重鏈的L-阿拉伯糖誘導的表達，和表達載體pPR033 (4)提供免疫球蛋白輕鏈的丙 酸鹽誘導的表達；在誘導（5)時形成多聚的抗體產(chǎn)物（6)。
[0025] 圖3顯示細菌細胞中免疫球蛋白重鏈和輕鏈共表達的結(jié)果。含有pBAD24-HC和 PPR033-LC可誘導表達載體兩者的SHuffle? Express和BL21細胞通過在L-阿拉伯糖和 丙酸鹽中生長而誘導。來自誘導的細胞和未誘導的對照的可溶性蛋白質(zhì)提取物在4-12% Bis-Tris凝膠上通過SDS凝膠電泳在還原性條件下分離。道1 :誘導的SHuffle? Express。 道2:未誘導的SHuffle? l_:xpress。道3:誘導的BL21。道4:未誘導的BL21。箭頭指示 51kDa處的蛋白質(zhì)條帶（IgGl重鏈）和26kDa處的另一蛋白質(zhì)條帶（IgGl輕鏈）；這些條帶 存在于誘導的細胞中而不存在于未誘導的細胞中。
[0026] 圖4顯示細菌細胞中免疫球蛋白重鏈和輕鏈共表達的結(jié)果。如對于圖3描述的，對 于來自含有PBAD24-HC和pPR033-LC可誘導表達載體兩者的誘導的和未誘導的SHuffle? Express和BL21細胞的相同可溶性蛋白質(zhì)提取物在10-20% Tris-甘氨酸凝膠上在原始 (非還原）條件下通過凝膠電泳分離。道1:誘導的SHuffle? Express。道2:未誘導的 SHuffle?Express。道3:誘導的BL21。道4:未誘導的BL21。箭頭指示154kDa處的 蛋白質(zhì)條帶（包含重鏈和輕鏈的IgGl抗體）；這一條帶存在于誘導的誘導的SHuffle? Express細胞中，而在誘導的BL21細胞中和在未誘導的細胞中顯著減少或不存在。
[0027] 圖5顯示細菌細胞中錳過氧化物酶（MnP)和蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶（PDI)在亞鐵 血紅素存在下的共表達結(jié)果。含pPR〇33-MnP-ChuA和pBAD24-PDI可誘導表達載體兩者的 SHuffle? Express細胞通過在L-阿拉伯糖和丙酸鹽中生長進行誘導。來自未誘導和誘 導的細胞的可溶性蛋白質(zhì)提取物在10% Bis-甘氨酸凝膠上在還原性條件下通過凝膠電泳 分咼。
[0028] 標志物：Bio-Rad Precision Plus Protein? Standard(預染色的）
[0029] 道I