用于產(chǎn)生具有物種間、靶標(biāo)內(nèi)交叉反應(yīng)性之抗體分子的方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】用于產(chǎn)生具有物種間、靶標(biāo)內(nèi)交叉反應(yīng)性之抗體分子的方 法
[0001] 發(fā)明背景
[0002] 1.技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明一般性涉及采用抗體鏈改組來(lái)產(chǎn)生具有物種間、靶標(biāo)內(nèi)交叉反應(yīng)性之抗體 的方法。
[0004] 2.相關(guān)領(lǐng)域描述
[0005]用于設(shè)計(jì)和產(chǎn)生抗體，特別是單克隆抗體的技術(shù)在本領(lǐng)域中已有描述。可以將單 克隆抗體設(shè)計(jì)成選擇性地與特定抗原結(jié)合。這樣的抗體可用于利用抗體的結(jié)合親和力和選 擇性的診斷和/或治療方法中。
[0006] Dreier等的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)2011/0300140公開(kāi)了用于產(chǎn)生駱駝科動(dòng)物 (camelid)來(lái)源的常規(guī)抗體的方法，所述方法包括用抗原來(lái)免疫駱駝科動(dòng)物物種，例如大羊 馬它（llama)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，特別是完全遠(yuǎn)交（outbred)的駱蛇科動(dòng)物物種產(chǎn)生穩(wěn)?。╮obust) 的免疫應(yīng)答，產(chǎn)生靶標(biāo)特異性抗體的多樣性文庫(kù)，所述靶標(biāo)特異性抗體的特征在于對(duì)靶抗 原的高親和力。
[0007] 此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)常規(guī)駱駝科動(dòng)物抗體擁有這樣的可變結(jié)構(gòu)域，所述可變結(jié)構(gòu)域與 人種系抗體的相應(yīng)可變結(jié)構(gòu)域具有出乎意料的高序列同源性。而且，駱駝科動(dòng)物抗體與人 抗體具有出乎意料的高結(jié)構(gòu)相似性。因此，駱駝科動(dòng)物抗體需要很少的突變即可將可變結(jié) 構(gòu)域的人特征升高至這樣的水平，其中免疫原性的水平為可接受的低。這些很少的突變對(duì) 抗體針對(duì)靶標(biāo)的親和力具有很小的作用或沒(méi)有作用。
[0008] Dreier等的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)2011/0165621公開(kāi)了用于人源化駱駝科動(dòng)物來(lái)源 的抗體的方案。
[0009] 已經(jīng)開(kāi)發(fā)出若干技術(shù)來(lái)模擬存在于活動(dòng)物之免疫應(yīng)答中的親和力成熟。一旦將 這樣的技術(shù)稱(chēng)為"鏈改組"，早就認(rèn)識(shí)到鏈改組作為用于從抗體之重鏈或輕鏈的文庫(kù)中產(chǎn)生 新抗體的手段，所述抗體在例如初次免疫應(yīng)答中獲得。可使用篩選方法來(lái)針對(duì)親和力和選 擇性對(duì)鏈改組方案中獲得的抗體進(jìn)行選擇。以這樣的方式，可產(chǎn)生具有與親本抗體相比更 高親和力和/或祀標(biāo)選擇性的抗體。參見(jiàn)，例如，Kang等，"Antibody redesign by chain shuffling from random combinatorial immunoglobulin libraries"Proc. Natl.Acad. Sci. USA 88(1991)，11120-11123。還可以將鏈改組用于通過(guò)表位印跡（imprinting)的抗 體人源化。
[0010] 為了在人類(lèi)中的診斷和/或治療用途，正開(kāi)發(fā)大量抗體。因此，可針對(duì)這些抗體與 人抗原結(jié)合的能力來(lái)產(chǎn)生和篩選這樣的抗體。對(duì)于這樣的抗體在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中的測(cè)試，高 度期望這樣的抗體還與在非人動(dòng)物物種（特別是在實(shí)驗(yàn)室實(shí)踐中常用的動(dòng)物物種，例如嚙 齒類(lèi)動(dòng)物，特別是小鼠）中存在的相應(yīng)抗原結(jié)合。
[0011] 因此，需要用于產(chǎn)生具有物種間、靶標(biāo)內(nèi)交叉反應(yīng)性之抗體分子的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明通過(guò)提供用于產(chǎn)生具有物種間、靶標(biāo)內(nèi)交叉反應(yīng)性之抗體分子的方法而解 決了該需求，所述方法包括以下步驟：
[0013] a.產(chǎn)生對(duì)來(lái)自第一物種的靶抗原具有特異性的第一免疫文庫(kù)；
[0014] b.在鏈改組方案中組合來(lái)自所述第一免疫文庫(kù)的可變區(qū)以產(chǎn)生第二免疫文庫(kù)；
[0015] c.在所述第二免疫文庫(kù)中鑒定與所述靶標(biāo)抗原和來(lái)自第二物種的相應(yīng)抗原反應(yīng) 的抗體分子；
[0016] 其中所述第二物種不同于所述第一物種。
[0017] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，第一物種是人，并且第一免疫文庫(kù)是針對(duì)人抗原建立 的。在該優(yōu)選的實(shí)施方案中，第二物種是非人動(dòng)物，優(yōu)選為常用的實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物，例如小鼠。
[0018] 本發(fā)明的另一個(gè)方面是具有物種間、靶標(biāo)內(nèi)交叉反應(yīng)性的抗體分子。
[0019] 發(fā)明詳述
[0020] 以下是本發(fā)明的詳細(xì)描述。
[0021] 定義
[0022] 術(shù)語(yǔ)"抗體"、"抗原"、"靶抗原"、"特異性"、"親和力"、"駱駝科動(dòng)物物種"、"VL結(jié)構(gòu) 域"、" VH結(jié)構(gòu)域"、"可變結(jié)構(gòu)域"、" L1"、" L2 "、" L3 "、"ΗΓ'、"H2 "、"H3 "、"框架區(qū)"、"恒定結(jié) 構(gòu)域"和"高變環(huán)"以及本文中使用的其他特定術(shù)語(yǔ)如在Dreier等的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào) 2011/0300140中所定義，所述專(zhuān)利的公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用并入本文。術(shù)語(yǔ)"抗體分子"是指與 靶抗原免疫反應(yīng)和/或表現(xiàn)出與靶抗原特異性結(jié)合的包含VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域的任何多 肽。實(shí)例包括抗體、免疫球蛋白和抗體片段。
[0023] 本文使用的術(shù)語(yǔ)"免疫文庫(kù)"是指抗體分子的集合?？赏ㄟ^(guò)合適的載體（例如噬菌 體、質(zhì)粒或菌粒載體）來(lái)展示抗體分子。在J. Brichta等，Vet. Med.-Czech，50, 2005 (6): 231-252中綜述了用于建立免疫文庫(kù)的技術(shù)，其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用并入本文。
[0024] 本文使用的術(shù)語(yǔ)"鏈改組"是指這樣的技術(shù)，其用于通過(guò)提供來(lái)自文庫(kù)的抗體片 段來(lái)增加抗體文庫(kù)的多樣性；在展示工具（例如噬菌體展示）中表達(dá)所述片段；以及將所 表達(dá)的片段重組到抗體分子中?？舍槍?duì)與靶抗原X的結(jié)合，針對(duì)相對(duì)缺乏的與競(jìng)爭(zhēng)抗原 (rival antigen)Y的不期望結(jié)合，或者兩者來(lái)篩選所得的抗體分子。鏈改組是用于產(chǎn)生對(duì) 靶標(biāo)具有更高親和力或者更高結(jié)合特異性或者兩者之抗體的通常使用的技術(shù)。還可將鏈改 組用作獲得自非人物種（例如小鼠）之抗體的人源化方案。在Kang等，"Antibody redesign by chain shuffling from random combinatorial immunoglobulin libraries"Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88(1991) ,11120-11123中討論了鏈改組技術(shù)，其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用并 入本文。
[0025] 可用任何類(lèi)型的抗體片段來(lái)進(jìn)行鏈改組，所述抗體片段例如高變環(huán)、互補(bǔ)決定區(qū) (CDR)、輕鏈可變結(jié)構(gòu)域、重鏈可變結(jié)構(gòu)域等。例如，可用一條重鏈來(lái)改組輕鏈文庫(kù)，或者可 用一條輕鏈來(lái)改組重鏈文庫(kù)。
[0026] 術(shù)語(yǔ)"交叉反應(yīng)性（cross-reactivity) "通常用來(lái)描述抗體分子與抗原之間的非 特異性結(jié)合。例如，設(shè)計(jì)為與抗原X結(jié)合的抗體X還可表現(xiàn)出與抗原Y結(jié)合。則認(rèn)為抗體X 與抗原Y交叉反應(yīng)。如果抗原X和抗原Y是來(lái)自相同物種的抗原，那么這種類(lèi)型的交叉反 應(yīng)性可稱(chēng)為"靶標(biāo)間、物種內(nèi)"交叉反應(yīng)性。術(shù)語(yǔ)"靶標(biāo)間"是指與不同靶標(biāo)的交叉反應(yīng)性。 術(shù)語(yǔ)"物種內(nèi)"是指靶標(biāo)或抗原來(lái)自相同物種。這種類(lèi)型的交叉反應(yīng)性通常是不期望的，因 為非預(yù)期的與抗原Y結(jié)合有損于并且可干擾與抗原X的期望結(jié)合。此外，非預(yù)期的與抗原 Y結(jié)合可干擾抗原Y的正常功能，因此引起不期望的副作用。
[0027] 當(dāng)設(shè)計(jì)為與第一物種的抗原X(例如人X或hX)結(jié)合的抗體還與第二物種的抗原 Y(例如鼠Y或mY)結(jié)合時(shí)存在交叉反應(yīng)性的另一種形式。可將其適當(dāng)?shù)胤Q(chēng)為"靶標(biāo)間、物 種間交叉反應(yīng)性"。這種類(lèi)型的交叉反應(yīng)性可具有令人感興趣的科學(xué)意義，并且可用于例如 表位作圖但是在其他方面沒(méi)有很大價(jià)值。
[0028] 當(dāng)設(shè)計(jì)為與第一物種的抗原X (例如人X，或hX)結(jié)合的抗體還與第二物種的相應(yīng) 抗原X (例如鼠X，或mX)結(jié)合時(shí)存在交叉反應(yīng)性的又一種形式。可將其適當(dāng)?shù)貥?biāo)注為"物 種間、靶標(biāo)內(nèi)交叉反應(yīng)性"。這種類(lèi)型的交叉反應(yīng)性有很大的實(shí)踐價(jià)值，因?yàn)槠湓试S使用第 二物種（在該實(shí)例中為小鼠）在為人治療和/或診斷用途所開(kāi)發(fā)之抗體的研宄中作為動(dòng)物 模型。
[0029] 實(shí)際上，基于在靶標(biāo)親和力和特異性方面所期望的特性來(lái)篩選和選擇抗體。所選 擇的候選者是否具有期望的物種間、靶標(biāo)內(nèi)交叉反應(yīng)性本質(zhì)上要看運(yùn)氣（the luck of the draw)。迄今為止，認(rèn)為不存在將這種類(lèi)型的交叉反應(yīng)性改造到抗體分子中的方法。
[0030] 現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可使用鏈改組來(lái)產(chǎn)生具有特異性期望之物種間、靶標(biāo)內(nèi)交叉反應(yīng)性 的抗體分子。因此，在其最一般的范圍內(nèi)，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生具有物種間、靶標(biāo)內(nèi)交叉反 應(yīng)性之抗體分子的方法，所述方法包括以下步驟：
[0031] a.建立對(duì)來(lái)自第一物種的靶抗原具有特異性的第一免疫文庫(kù)；
[0032] b.在鏈改組方案中組合來(lái)自所述第一免疫文庫(kù)的可變區(qū)以產(chǎn)生第二免疫文庫(kù)；
[0033] c.在所述第二免疫文庫(kù)中鑒定與所述靶抗原和來(lái)自第二物種的相應(yīng)抗原反應(yīng)的 抗體分子；
[0034] 其中所述第二物種不同于所述第一物種。
[0035] 可通過(guò)任何合適的方法來(lái)確認(rèn)來(lái)自第二文庫(kù)的抗體是否與靶抗原和來(lái)自第二物 種的相應(yīng)抗原反應(yīng)，所述任何合適的方法包括直接方法（例如結(jié)合測(cè)定），或者用于測(cè)試結(jié) 合相關(guān)功能性的間接方法。
[0036] 應(yīng)理解的是，第一物種通常是產(chǎn)生抗體分子的物種。在許多情況下，該物種將是 人，但是原則上所述第一物種可以是將會(huì)受益于抗體分子有效性的任何物種，例如飼養(yǎng)和 伴侶動(dòng)物等。為了本文件的目的，第一物種將假定為人，但是讀者應(yīng)記住這無(wú)意于進(jìn)行限 制。
[0037] 可以以任何合適的方式從第一物種中獲得第一免疫文庫(kù)。例如，免疫文庫(kù)可以是 獲得自一名或更多名健康志愿者的原初文庫(kù)（nalfve library);或者其可以獲得自以天然 方式用靶抗原感染的供體。如果第一物種是人，則通常倫理上不可能從用靶抗原有意感染 的供體建立第一免疫文庫(kù)。
[0038] 在一個(gè)替代實(shí)施方案中，第一免疫文庫(kù)獲得自用靶抗原所免疫之第三物種的動(dòng) 物。第三物種可與第一物種相同或不同。如果第一物種是人，那么第三物種通常不同于第 一物種。例如，第三物種可以是駱駝科（Camelidae)的成員或駱駝科動(dòng)物。在一個(gè)優(yōu)選的 實(shí)施方案中，第三物種是大羊駝。
[0039] 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，駱駝科動(dòng)物特別適于產(chǎn)生第一免疫文庫(kù)，原因很多。人靶抗原通常在駱 駝科動(dòng)物中引起強(qiáng)大的免疫應(yīng)答。此外，完全遠(yuǎn)交的駱駝科動(dòng)物可容易地用于免疫；使用 完全遠(yuǎn)交的動(dòng)物有助于建立高度多樣性的免疫文庫(kù)。如之前所報(bào)道，獲得自駱駝科動(dòng)物物 種的抗體的可變結(jié)構(gòu)域與相應(yīng)人可變結(jié)構(gòu)域具有高度的序列同源性，以及高度的結(jié)構(gòu)同源 性。因此，這樣的抗體需要很少的突變或者不需要突變來(lái)降低其免疫原性，使得很少存在損 失對(duì)人靶標(biāo)的高度親和力的風(fēng)險(xiǎn)。
[0040] 特別地，獲得自駱駝科動(dòng)物的免疫文庫(kù)的高多樣性顯著地提高了通過(guò)本發(fā)明的方 法成功建立交叉反應(yīng)性的概率。
[0041] 以本領(lǐng)域已知的任何方法來(lái)產(chǎn)生和選擇第一免疫文庫(kù)的抗體。例如，從供體動(dòng)物 收獲成熟B細(xì)胞；收集并表達(dá)RNA ;針對(duì)與靶抗原的親和力來(lái)篩選抗體片段；對(duì)所選擇的抗 體進(jìn)行測(cè)序和擴(kuò)增。另一些方法包括使用雜交瘤技術(shù)和克?。籅細(xì)胞分選和轉(zhuǎn)染等。
[0042] 第一免疫文庫(kù)可具有任何合適的形式。例如，第一免疫文庫(kù)可以為來(lái)自第一免疫 文庫(kù)的抗體之可變區(qū)的一個(gè)或更多個(gè)噬菌體展示文庫(kù)的形式。例如，這些可變區(qū)可以是輕 鏈和重鏈。
[0043] 可使用任何鏈改組方案來(lái)產(chǎn)生第二免疫文庫(kù)。應(yīng)理解的是，盡管所述方法的