高度多樣的組合抗體文庫(kù)的制作方法
【專利說(shuō)明】高度多樣的組合抗體文庫(kù)
[0001] 發(fā)明背景
[0002] 1.發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明一般涉及獲得自駱駝科動(dòng)物物種的抗體文庫(kù)，并且更特別地涉及包含對(duì)應(yīng) 于在野生型人抗體中使用的那些鏈家族之鏈家族的駱駝科動(dòng)物抗體文庫(kù)。
[0004] 2.相關(guān)領(lǐng)域描述
[0005] 隨著展示方法（例如核糖體展示、噬菌體展示和細(xì)胞表面展示）的出現(xiàn)，抗體文 庫(kù)已經(jīng)成為用于抗體研宄和開發(fā)的越來(lái)越重要的資源?？贵w文庫(kù)在設(shè)計(jì)和構(gòu)建方式上不 同。最重要的文庫(kù)是為鑒定和分離治療性抗體而開發(fā)的那些。Ponsel等，"High Affinity， Developability and Functional Size ：The Holy Grail of Combinatorial Antibody Library Generation，" Molecules 2011，16, 3675-3700 提供了概述。
[0006] 自然界利用體細(xì)胞高突（somatic hypermutation，SHM)來(lái)產(chǎn)生高親和力抗體。已 經(jīng)開發(fā)出許多親和力成熟技術(shù)來(lái)模擬SHM。成熟技術(shù)的目標(biāo)一般是在所選擇的中度親和 力候選者中引入一定程度的多樣性，隨后在逐漸提高的選擇壓力下進(jìn)行重復(fù)選擇。期望提 供這樣的文庫(kù)，所述文庫(kù)提供具有高早熟親和力的抗體。根據(jù)Perelson等，可直接從組合 抗體文庫(kù)獲得的親和力（即，不存在親和力成熟）一般與文庫(kù)大小相關(guān)（Perelson，A.S.; Oster,G. F. Theoretical studies of clonal selection ：Minimal antibody repertoire size and reliability of self-non-self discrimination. J. Th eor. Biol. 1979,81, 645-670)〇
[0007] 親和力/文庫(kù)大小相關(guān)性可容易地從概率的角度來(lái)理解：文庫(kù)越大，從其可用的 結(jié)構(gòu)單元（building block)生成高親和力抗體的概率越大。然而，大小本身并不是答案， 文庫(kù)的質(zhì)量至少同樣重要。如由 Ponsel 等，"Functional library size·· .matters more than absolute library size. "（Ponsel 等，同上，3676 頁(yè)）所述。
[0008] 自然界依賴于抗體結(jié)構(gòu)單元（特別是重鏈（Vh)和輕鏈（'))的隨機(jī)組合。人抗體 的生成例如利用7個(gè)V h家族和16個(gè)V JC族（10個(gè)λ家族和6個(gè)κ家族），其非常有助 于人抗體的多樣性。期望抗體文庫(kù)將包含大量的抗體家族以便接近自然界中的多樣性。
[0009] 由來(lái)自健康人供體的抗體構(gòu)建的原初抗體文庫(kù)（nalfve antibody library)原則 上包含完整的人抗體鏈。與免疫文庫(kù)相比，原初文庫(kù)不太適于開發(fā)高親和力治療性抗體。此 夕卜，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)原初文庫(kù)之鏈多樣性的重要部分在標(biāo)準(zhǔn)篩選和富集方案的選擇壓力下喪失。 [0010]由獲得自被感染人類的抗體構(gòu)建的免疫文庫(kù)具有產(chǎn)生高親和力治療性抗體的潛 力。預(yù)期這樣的文庫(kù)可包含完整的人抗體鏈。然而，被感染的人供體的免疫系統(tǒng)常常嚴(yán)重 受損，導(dǎo)致低質(zhì)量的免疫文庫(kù)。事實(shí)上，目標(biāo)治療性抗體幾乎當(dāng)然地處理特征在于減弱患者 免疫系統(tǒng)的疾病。
[0011] 在許多情況下，不可能通過(guò)免疫健康人供體來(lái)獲得抗原特異性抗體。用危及生命 的或有毒的抗原來(lái)免疫在倫理上不可能。其他抗原不觸發(fā)人類的穩(wěn)?。╮obust)免疫應(yīng)答， 或者根本沒(méi)有免疫應(yīng)答。
[0012] 可通過(guò)免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（例如小鼠或大鼠）來(lái)獲得抗原特異性抗體。然而，這樣的 動(dòng)物往往是嚴(yán)重近交的，這降低了免疫應(yīng)答的多樣性。此外，鼠抗體與人種系僅共有有限數(shù) 量的抗體鏈家族。
[0013] Dreier等，2011年12月8日的美國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào)2011/0300140公開了用于通 過(guò)免疫駱駝科動(dòng)物物種（大羊駝（Lama glama))來(lái)產(chǎn)生高親和力抗體的方法。該文獻(xiàn)報(bào)道 了在家族λ 3、λ5和λ8中νλ鏈的分離。未報(bào)道V κ鏈。
[0014] Dreier等，2011年7月7日的美國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào)2011/0165621公開了用于人源 化通過(guò)免疫駱駝科動(dòng)物物種所獲得之抗體的方法。該文獻(xiàn)提出了以下家族之鏈的人源化方 案：重鏈：VH1、VH3 和 VH4 ;νλ 鏈：νλ 1、νλ2、νλ3、νλ5 和 νλ8 ;以及 Vk 鏈 Vk 1、Vk 2 和 Vk 4。
[0015] Schofield 等"Application of Phage Display to High Throughput Antibody Generation and Characterization，"Genome Biol. (2007)報(bào)道了包含超過(guò) 1010種人抗體 的高質(zhì)量噬菌體展示文庫(kù)。該出版物提供了多種抗體鏈的使用頻率的概述。VkI和Υλ6 是使用最頻繁的輕鏈。
[0016] 因此，需要來(lái)自非人動(dòng)物的抗體文庫(kù)，其中呈現(xiàn)大量人抗體鏈家族。
[0017] 特別需要來(lái)自非人動(dòng)物的抗體文庫(kù)，其中呈現(xiàn)人抗體鏈V λ 6。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0018] 本發(fā)明涉及來(lái)源于駱駝科動(dòng)物物種的抗體文庫(kù)，所述文庫(kù)包含屬于以下人抗體鏈 家族中至少之一的抗體鏈：VH6、V κ 3和V λ 6。優(yōu)選包含屬于人V λ 6家族之抗體鏈的抗體 文庫(kù)。
【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1是存在于Schofield等，同上的文庫(kù)中之人鏈家族的使用頻率的圖 不° 來(lái)源：http ://openi. nlm. nih. gov/detailedresult. php ? img = 2258204_ gb-2007-8-ll-r254-3&query = the&fields = all&favor = none&it = none&sub = non e&uniq = O&sp = none&req = 4&simCollection = 2583049-pone. 0003793. g005&npos = 35&prt = 3〇
[0020] 圖2是與人抗體中的重鏈家族的使用（每對(duì)的右手條）相比，本發(fā)明的駱駝科動(dòng) 物抗體文庫(kù)中的人重鏈家族使用（每對(duì)的左手條）的圖示。
[0021] 圖3是與人抗體中的K鏈家族的使用（每對(duì)的右手條）相比，本發(fā)明的駱駝科動(dòng) 物抗體文庫(kù)中的人κ鏈家族使用（每對(duì)的左手條）的圖示。
[0022] 圖4是與人抗體中的λ鏈家族的使用（每對(duì)的右手條）相比，本發(fā)明的駱駝科動(dòng) 物抗體文庫(kù)中的人VHl鏈家族使用（每對(duì)的左手條）的圖示。
[0023] 圖5是與人抗體中的λ鏈家族的使用（每對(duì)的右手條）相比，本發(fā)明的駱駝科動(dòng) 物抗體文庫(kù)中的人VH3鏈家族使用（每對(duì)的左手條）的圖示。
[0024] 圖6是與人抗體中的λ鏈家族的使用（每對(duì)的右手條）相比，本發(fā)明的駱駝科動(dòng) 物抗體文庫(kù)中的人VkI鏈家族使用（每對(duì)的左手條）的圖示。
[0025] 圖7是與人抗體中的λ鏈家族的使用（每對(duì)的右手條）相比，本發(fā)明的駱駝科動(dòng) 物抗體文庫(kù)中的人νλ?鏈家族使用（每對(duì)的左手條）的圖示。
[0026] 圖8示出了 V λ種系6。
[0027] 圖9是參照人VH家族和種系基因?qū)?yīng)物之每個(gè)VH家族（VH1、VH3、VH4、VH5和 VH7)的駱駝科動(dòng)物VH種系基因的比對(duì)。同一性％表示VH種系的每個(gè)駱駝（野駱駝（Camel ferus))和大羊蛇（羊蛇（Lama pacos)或駱馬（lama vicugna))框架（FR1+FR2+FR3)與參 照FR氨基酸序列（ref，此處為人VH種系對(duì)應(yīng)物）所共有的相同氨基酸（點(diǎn)）的百分比。
[0028] 圖10是參照人V λ家族和種系基因?qū)?yīng)物之每個(gè)V λ家族（V λ 1、V λ 2、V λ 3、 νλ4、νλ5、νλ6、νλ7、νλ8、νλ9和νλ 10)的駱駝科動(dòng)物νλ種系基因的比對(duì)。同一性％ 表示￥1種系的每個(gè)駱駝（野駱駝）和大羊駝（羊駝或駱馬）框架$1?1+?1?2+?1?3)與參照 FR氨基酸序列（ref，此處為人V λ種系對(duì)應(yīng)物）所共有的相同氨基酸（點(diǎn)）的百分比。
[0029] 圖11是駱駝科動(dòng)物Vk家族與相應(yīng)的人種系的比對(duì)。同一性％表示V κ種系的 每個(gè)駱駝（野駱駝）和大羊駝（羊駝或駱馬）框架（FR1+FR2+FR3)與參照FR氨基酸序列 (ref，此處為人Vk種系對(duì)應(yīng)物）所共有的相同氨基酸（點(diǎn)）的百分比。
[0030] 圖12示出駱駝科動(dòng)物（羊駝和野駱駝）VH基因和相應(yīng)的引物。
[0031] 圖13示出駱駝科動(dòng)物（羊駝、野駱駝和大羊駝）V λ基因和相應(yīng)的引物。
[0032] 圖14示出駱駝科動(dòng)物（羊駝、野駱駝和大羊駝）V κ基因和相應(yīng)的引物。
[0033] 圖15示出VHl引物1與VHlFRl的前23bp之比對(duì)的一個(gè)實(shí)例。該比對(duì)的實(shí)例說(shuō)明 了特異于V家族擴(kuò)增的引物是如何設(shè)計(jì)的。通過(guò)將屬于相同家族（此處的一個(gè)實(shí)例為VHl 家族）之V種系基因的所有框架I(FRl)進(jìn)行比對(duì)來(lái)產(chǎn)生V家族特異性引物。從羊駝WGS 和HTG、野駱駝WGS和任何可用的序列數(shù)據(jù)庫(kù)或者未公開或公開的文獻(xiàn)中收集和注釋的所 有已發(fā)現(xiàn)的V種系序列提取所有的FRl家族V特異性。WGS表示全基因組鳥槍測(cè)序項(xiàng)目并 且HTG或HTGS表示高通量基因組序列。點(diǎn)表示與參照序列（此處在該實(shí)例中由VHl-引物 1表示）相比相同的核苷酸。此處VHl-引物1是允許在13位用G或C退火的簡(jiǎn)并引物； 對(duì)于引物合成，S表示G/C。
[0034] 發(fā)明詳述
[0035] 以下是本發(fā)明的詳細(xì)描述。
[0036] 定義
[0037] "抗體"（Ab)和"免疫球蛋白"（Ig)是糖蛋白，其表現(xiàn)出與（靶）抗原的特異性結(jié) 合。已知駱駝科動(dòng)物物種具有兩種不同類型的抗體；經(jīng)典的或"常規(guī)"的抗體還有重鏈抗體。
[0038] 本文使用的術(shù)語(yǔ)"駱駝科動(dòng)物抗體"是指任何同種型的常規(guī)駱駝科動(dòng)物抗體，包括 IgA、IgG、IgD、IgE或IgM。自然的或天然存在的"常規(guī)"駱駝科動(dòng)物抗體通常是異四聚體糖 蛋白，由兩條相同的輕（L)鏈和兩條相同的重（H)鏈構(gòu)成。
[0039] 術(shù)語(yǔ)"抗體鏈"與術(shù)語(yǔ)"抗體結(jié)構(gòu)域"交換使用，并且是指抗體的重鏈或輕鏈。
[0040] 術(shù)語(yǔ)"抗體文庫(kù)"是指用于篩選和/或組合成完整抗體所展示的抗體和/或抗體 片段的集合?？贵w和/或抗體片段可在核糖體上、在噬菌體上或在細(xì)胞表面（特別是在酵 母細(xì)胞表面）上展示。
[0041] 如果人抗體鏈與該家族的其他成員具有至少80%的序列同源性，則認(rèn)為人抗體鏈 屬于特異性"抗體鏈家族"?；谠摱x，已經(jīng)鑒定出23個(gè)人抗體鏈家族：7個(gè)重鏈（V h)家 族；6個(gè)V κ輕鏈家族；以及10個(gè)V λ輕鏈家族。因此，如果人抗體鏈與V λ 6家族的其他 成員具有至少80%的序列同源性，則認(rèn)為人抗體鏈屬于人家族V λ 6。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通常，抗體 鏈與其他家族的成員具有小于70%的序列同源性。
[0042] 如果駱駝科動(dòng)物抗體鏈與該家族的人種系序列具有至少80%的序列同源性，則認(rèn) 為駱駝科動(dòng)物抗體鏈屬于特異性人抗體鏈家族。優(yōu)選地，序列同源性至少為85 %，更優(yōu)選為 90 %，仍更優(yōu)選為至少95 %。
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