一種液體酸性果膠酶的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及酸性果膠酶的制備方法，具體涉及一種液體酸性果膠酶的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 液體酶制劑是一種使用方便，綠色環(huán)保，生物降解性良好的原料。專一的催化特性 及溫和的反應(yīng)條件，在工業(yè)界得到越來越多的使用和重視。在使用方面，液體酶制劑具有以 下優(yōu)點(diǎn)：1)液體酶制劑以分子或微粒狀態(tài)分散在底物中，分散度大，吸收快，能較迅速地發(fā) 生酶解反應(yīng)，酶活性高；2)易于分劑量，容易復(fù)配和二次加工，使用方便；3)有利于提高酶 制劑的利用率，4)直接使用，無須溶解和活化；5)純度高、雜質(zhì)含量低；6)生產(chǎn)過程短、成本 低；7)生產(chǎn)加工和使用過程中不會造成粉塵污染，有利于保護(hù)環(huán)境；但是，液體酶制劑體積 較大，攜帶、運(yùn)輸、貯存都不方便，酶活性容易受到高溫、冷凍、光照、酸堿性、氧化、濕度等貯 存環(huán)境的影響而顯著降低，并且因?yàn)橐后w酶制劑的水分活度較高，很容易受到微生物的污 染而失活。因此，液體酶制劑的應(yīng)用受到限制，最主要的原因就是其穩(wěn)定性較差，包括生物 穩(wěn)定性和物理、化學(xué)穩(wěn)定性。
[0003] 果膠酶（pectinases)是一大類可分解植物細(xì)胞壁組分果膠質(zhì)的酶系總稱，從分 解方式上可以將果膠酶分為果膠水解酶和果膠裂解酶，前者主要包括原果膠酶（PPase)、果 膠酯酶（PE)、低聚半乳糖醛酸水解酶、聚甲基半乳糖醛酸酶（PMG)、聚半乳糖醛酸酶（PG); 后者主要包括聚半乳糖醛酸裂解酶（PGL)和聚甲基半乳糖醛酸裂解酶（PMGL)。
[0004] 目前對于果膠酶的研宄已有大量的文獻(xiàn)報(bào)道，其中研宄時(shí)間較長的酸性果膠酶主 要用于果膠組分的提取和果酒果汁的澄清，堿性果膠酶在制漿漂白，棉織物處理工藝中的 應(yīng)用取得了一定進(jìn)展，特別是在麻類纖維的脫膠上的應(yīng)用研宄日趨增多。無論是酸性果膠 酶還是堿性果膠酶，其研宄工作主要停留在菌種篩選及對酶學(xué)性質(zhì)的研宄，最終目的是為 果膠酶提供一個(gè)良好的、寬廣的應(yīng)用空間，但在果膠酶儲存穩(wěn)定性方面研宄的較少。
[0005] 目前，市場上的酸性果膠酶制劑主要有液體制劑、粉劑和顆粒制劑三種劑型。其 中，液體酸性果膠酶在常溫下保存酶活損失快，保質(zhì)期短，難于商品化，極大地限制了液體 酸性果膠酶的工業(yè)產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用，應(yīng)用效率較低，成本升高?，F(xiàn)有技術(shù)中，為了保證酸性果膠 酶制劑的微生物指標(biāo)在貨架期達(dá)到食品級標(biāo)準(zhǔn)，液體酸性果膠酶制劑主要通過添加防腐劑 (山梨酸鉀、苯甲酸鈉等）和冷鏈運(yùn)輸保藏來滿足要求。很多果汁生產(chǎn)企業(yè)對食品添加劑的 限量要求越來越嚴(yán)格，尤其是出口果汁加工企業(yè)，一些常用的防腐劑品種，如苯甲酸鈉，甚 至被規(guī)定不得檢出?，F(xiàn)有產(chǎn)品中若不添加防腐劑，即使在冷鏈運(yùn)輸條件下，也會發(fā)生細(xì)菌污 染等問題。
[0006] 中國專利CN101684462B公開了一種酸性果膠酶液體制劑的生產(chǎn)方法，以蘋果渣 為誘導(dǎo)物，以黑曲霉為菌種，經(jīng)過發(fā)酵、浸提、固液分離、去渣澄清、乙醇沉淀、固液分離、復(fù) 溶工序制得液體酸性果膠酶酶制劑，解決了現(xiàn)有技術(shù)液體酸性果膠酶在常溫下保存酶活損 失快、保質(zhì)期短的問題。上述公開專利在制備過程用到氧化鋁和山梨酸鉀等化學(xué)物質(zhì)，存在 較大的食品安全隱患，且制備工藝復(fù)雜，同時(shí)沒考慮液體酸性果膠酶非生物穩(wěn)定性的問題。 中國專利CN101857857A公開了一種食品級酸性果膠酶制劑的制備方法，其內(nèi)容包括：將 發(fā)酵后獲得的酸性果膠酶液，降溫至10-20°C，然后進(jìn)行板框壓濾、微濾、超濾，調(diào)節(jié)pH值 后，經(jīng)終端過濾進(jìn)行無菌灌裝。應(yīng)用本發(fā)明的方法制備的酸性果膠酶制劑，在不加防腐劑的 情況下，仍然能夠保證酸性果膠酶制劑中細(xì)菌的生長緩慢。本發(fā)明通過控制整個(gè)制過程的 溫度和降低制劑中的營養(yǎng)源殘量，應(yīng)用可控的無菌包裝技術(shù)，可以在不加防腐劑的情況下 很好的保證酶制劑產(chǎn)品質(zhì)量及衛(wèi)生指標(biāo)。上述公開的專利采用10-20°C低溫和4. 0-5. 5的 pH值不能很好的抑制過程污染的雜菌在儲存期間的生長和繁殖，并且浪費(fèi)冷源和原料，同 時(shí)也沒考慮液體酸性果膠酶非生物穩(wěn)定性的問題。
[0007] 因此，制備一種穩(wěn)定性強(qiáng)的液體酸性果膠酶以拓展其應(yīng)用領(lǐng)域和效率很重要，是 酸性果膠酶研宄的最重要、最具有現(xiàn)實(shí)意義的方向。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明所解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有液體酸性果膠酶的缺陷，無須添加化學(xué)防腐 劑，無須低溫處理，在常溫下對發(fā)酵粗酶液和調(diào)配濃縮液采用高壓脈沖電場處理，并在調(diào)配 過程添加果膠分解物、中草藥提取物、改性膳食纖維等天然植物原料，然后除菌過濾、無菌 灌裝即得一種穩(wěn)定的保質(zhì)期較長的液體酸性果膠酶。
[0009] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0010] 一種液體酸性果膠酶的制備方法，包括如下步驟：
[0011] 1)將發(fā)酵后獲得的酸性果膠酶發(fā)酵液添加1〇〇目-300目硅藻土，用500-800目濾 布預(yù)涂硅藻土，采用板框過濾機(jī)進(jìn)行過濾，操作壓力為0. 14-0. 24Mpa，得發(fā)酵粗酶液；
[0012] 所述硅藻土的添加量為每100mL發(fā)酵液添加0. 5-1. 5g ;
[0013] 2)將步驟1)發(fā)酵粗酶液于室溫下在電場強(qiáng)度20-30kV/cm，脈沖時(shí)間200-300ys， 脈沖頻率200-300HZ條件下進(jìn)行高壓脈沖電場處理；
[0014] 3)步驟2)經(jīng)高壓脈沖電場處理的發(fā)酵粗酶液依次通過微濾膜微濾、超濾膜超濾， 然后循環(huán)超濾得到濃縮酶液；
[0015] 所述微濾膜孔徑為0? 4-0. 8 y m ;
[0016] 所述微濾進(jìn)口壓力為0? 1-0. 12MPa，壓差0? 07-0. 09MPa，酶液溫度25-30°C;
[0017] 所述超濾膜孔徑為0. 005-0. 015ym;
[0018] 所述超濾進(jìn)口壓力為0? 15-0. 20MPa，壓差0? 08-0.lOMPa，酶液溫度25-35°C;
[0019] 4)向步驟3)濃縮酶液中加入其質(zhì)量0. 5-10%的穩(wěn)定劑，充分?jǐn)嚢?，均勻混合，?乳酸調(diào)節(jié)pH值2. 8-5. 2,然后于室溫下在電場強(qiáng)度25-40kV/cm，脈沖時(shí)間400-600ys，脈 沖頻率200-300HZ條件下進(jìn)行高壓脈沖電場處理，靜置20-40min;
[0020] 所述穩(wěn)定劑的制備方法如下：按重量份數(shù)計(jì)，準(zhǔn)確稱取果膠分解物20-40份，中草 藥提取物15-25份，改性膳食纖維10-15份，海藻糖10-15份，天然抗氧化劑5-10份，多元 醇2-5份，金屬氯化物1-3份，牛血清白蛋白0. 1-0. 3份；首先取改性膳食纖維，加入其質(zhì) 量5-12倍的去離子水，室溫浸泡4-6h，邊升溫邊攪拌，40-60°C保溫20-30min，攪拌，充分 溶解，繼續(xù)保溫，邊攪拌邊依次加入果膠分解物、中草藥提取物、海藻糖、多元醇、金屬氯化 物，然后降溫至25-35°C，邊攪拌邊依次加入牛血清白蛋白、天然抗氧化劑均勻混合即得穩(wěn) 定劑；
[0021] 所述果膠分解物具有顯著的抑菌特性，尤其對大腸桿菌抑制作用最強(qiáng)，同時(shí)還具 有較強(qiáng)的抗氧化性，濃度達(dá)到0. 01 %時(shí)即可作用，對超氧自由基、羥自由基和DPPH自由基 都表現(xiàn)出很強(qiáng)的消除作用，當(dāng)濃度達(dá)到1.0%時(shí)，消除效果達(dá)到100% ;
[0022] 所述果膠分解物添加到液體果膠酶中可起到酶解產(chǎn)物的拮抗作用，暫時(shí)阻止和抑 制果膠酶生物活性，穩(wěn)定果膠酶酶蛋白的分子結(jié)構(gòu)，有效防止酶活損失，提高液體果膠酶的 非生物穩(wěn)定性；
[0023] 進(jìn)一步地，所述果膠分解物是以檸檬、橙、柚、柑桔、葡萄等果皮或山楂、甜菜、蘋 果等廢渣經(jīng)超聲清洗、高壓脈沖提取、熱水浸提、醇沉獲得果膠，然后經(jīng)果膠酶酶解而制得 的；
[0024] 優(yōu)選地，所述果膠分解物的制備方法為：將新鮮的山楂果渣、柑桔皮、蘋果渣分別 放入裝有1.2%碳酸氫鈉溶液的超聲波清洗機(jī)中于2001、401(抱清洗5-101^11，瀝干，切分成 相等規(guī)格，長、寬為5-10mm，厚度3-5mm的片或丁，按質(zhì)量比4-7:2-4:1-3均勻混合，然后 于-25 --21°C冷凍10_30min;立即進(jìn)行粉碎，粒徑為0. 1-lmm;加入粉碎物質(zhì)量3-5倍的 去離子水混合均勾，用梓檬酸調(diào)節(jié)pH值為2-3,于室溫下在電場強(qiáng)度35-45kV/cm，脈沖時(shí)間 400-600ys，脈沖頻率200-300HZ條件下進(jìn)行高壓脈沖電場處理，接著常壓煮沸30-50min， 布袋過濾，濾澄用其質(zhì)量1-3倍的濾液常壓煮沸40-60min,布袋過濾，合并濾液，娃藻土過 濾，使濾液澄清，在75°C下減壓濃縮至固形物含量為6-10%，迅速冷卻至室溫，加入濃縮液 1. 5倍體積的pH值為2-3的95 %乙醇，靜置20-30min，使果膠沉淀出來，4000r/min離心 5-10min，回收沉淀，用2倍體積的無水乙醇洗脫，離心，回收沉淀，如此操作2次，得到的沉 淀于40-60°C真空干燥2-3h，獲得果膠，加入果膠質(zhì)量4-5倍的40-50°C水，攪拌，均勻混 合，保溫，用乳酸調(diào)節(jié)pH值為4. 5-5. 5,加入0. 3-0. 8U/mL的果膠酶酶解2-4h，酶解液過濾， 濾液于沸水中滅酶l〇_15min，冷卻至室溫，超濾濃縮、冷凍干燥即得果膠分解物。
[0025] 進(jìn)一步地，所述中草藥提取物的制備方法為：按重量份數(shù)計(jì)，準(zhǔn)確稱取艾葉50-55 份，大蒜50-55份，黃芪45-55份，魚腥草45-55份，黃芩30-45份，黃柏30-40份，柴胡30-40 份，甘草25-35份，苦參15-25份，虎杖6-8份，大黃2-5份，白芥子2-5份，首烏1-3份；分別 將上述中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加混合物5倍重量的 水，控制溫度80°C保持3h，然后降溫至50°C，加入混合物料總重量8%的復(fù)配酶進(jìn)行酶解， 用乳酸調(diào)節(jié)pH值為6. 2,酶解3h，最后添加混合物料1. 8倍重量乙醇和丙醇的混合物，乙醇 和丙醇混合的質(zhì)量比為1:2,控制溫度至70°C保持4h，過濾，得第一濾液；添加濾渣2倍重 量的水，控制溫度90°C保持2h，然后降溫至3