品按照2 : 1比例加入電泳上樣緩沖液，渦旋混勻，沸水浴lOmin， 8000rpm離心Imin，取上清。使用移液槍上樣，20 μ L/孔。電泳，濃縮膠電壓為90V，當溴酷 藍進入分離膠時，提高電壓至120V，溴酚藍至膠底部lcm，停止電泳。
[0102] 染色：電泳結束后，取下凝膠，使用刀片切掉濃縮膠，蒸餾水沖洗后，置于凝膠染色 液中，室溫搖床上染色5h。
[0103] 脫色：染色結束后，取凝膠置于脫色液中，搖床上進行脫色，其間更換染色液3-4 次，直至凝膠背景變淡。
[0104] 10、E2基因 IPTG誘導濃度的確定
[0105] 培養(yǎng)含有 pET-32a-E2 的 Bal21 菌，待 0D600 達到 0· 6-1. 0 時，分別加入 0· 5mmol/ L、0. 75mmol/L、lmmol/L、I. 25mmol/L、l. 5mmol/L 和 2mmol/L 的 IPTG 進彳丁誘導。收集各組誘 導4h菌液，進行SDS-PAGE分析。
[0106] 11、重組蛋白可溶性分析
[0107] 在IPTG最佳誘導濃度和誘導時間的條件下，誘導培養(yǎng)含有pET-32a_E2的Bal21 菌（200ml)，4°C離心收集菌液，8000rpm，5min。菌體在冰浴中超聲破碎（120W，IOs/次，間隔 5s，20min)，離心，12000rpm，5min，分別取上清和沉淀進行SDS-PAGE分析。pET_32a空載體 誘導前、后上清和不溶部分，各取Iml作為對照。
[0108] 12、融合蛋白的Western blot分析
[0109] SDS-PAGE電泳分離目的蛋白，操作如上，電泳后，進行Western blot鑒定，操作如 下：
[0110] (1)轉膜前準備：凝膠使用去離子水漂洗后，置于轉移緩沖液中。戴上手套，使用 刀片分別裁剪與凝膠長、寬相同的6張濾紙，1張 PVDF膜。將PVDF膜置于甲醇（100%)中 浸泡，與6張濾紙一起浸于轉移緩沖液平衡。
[0111] (2)轉膜：按照3張濾紙、PVDF膜、凝膠、3張濾紙的順序，將其疊放于半干轉移裝 置的石墨板上，PVDF膜置于正極。使用玻璃棒除去膜與膜，膜與膠之間的氣泡，在濾紙上加 入Iml轉移緩沖液，進行轉移，轉移參數(shù)：2V，100mA，50min左右。轉膜后的凝膠轉移至盛有 考馬斯亮藍染液的托盤中，進行染色，以檢查蛋白質轉移是否完全，同時切去濾膜的左下角 作為標記。
[0112] (3)封閉：帶上手套，將PVDF膜置于可加熱封接的塑料袋中，加入IOml封閉緩沖 液（0. lml/cm2)，排除氣泡，搖床上室溫溫育1小時。
[0113] (4) -抗和靶蛋白的結合：棄去封閉液，加入封閉緩沖液稀釋的抗組氨酸標簽一 抗（1 : 5000)，排除氣泡后密封袋口，平放于搖床，室溫溫育1-2小時。
[0114] (5)洗膜：剪開塑料袋，棄去封閉液和抗體，TBST漂洗PVDF膜3次，每次10分鐘。
[0115] (6)二抗和一抗的結合：經(jīng)TBST最后一次洗滌后，把PVDF膜轉移至塑料袋，按濾 膜面積加入封閉液稀釋的辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠二抗（I : 5000)，37°C平緩搖 動、溫育1小時。
[0116] (7)洗滌：將PVDF膜轉移至TBST溶液，室溫洗滌3次，IOmin/次。
[0117] (8)顯色：暗室中，將魯米唑和雙氧水按照I : 1比例混合，制成發(fā)光液。將PVDF 膜置于發(fā)光液進行顯色，直至條帶清晰后，使用鑷子拿出，置于蒸餾水中漂洗，放到定影液 中，定景多5min〇
[0118] 13、表達蛋白的純化
[0119] 在最佳IPTG誘導濃度和誘導時間下，誘導培養(yǎng)含有pET-32a-E2的Bal21菌 (1000ml)，8000rpm離心5min，收集菌體沉淀。沉淀使用預冷的超聲破碎緩沖液洗滌3次， 12000rpm離心lOmin，收集沉淀，按3ml/g濕菌比例加入預冷的超聲波破碎緩沖液，重懸后， 冰浴中超聲破碎（120W，IOs/次，間隔5s，20min)。4°C離心，12000rpm，lOmin，取沉淀。沉淀 重懸于9倍體積的包涵體洗滌緩沖液I，懸浮后4°C離心，12000rpm，lOmin，取沉淀。沉淀分 別使用包涵體洗滌緩沖液Π 、III洗滌后，4°C離心，12000rpm，lOmin，取沉淀。將洗滌后的 包涵體重懸于包涵體溶解液中（10倍體積），室溫放置，充分裂解。裂解后的包涵體4°C離 心，12000rpm，20min，取上清，0. 22 μ m濾膜過濾后，使用Ni+親和層析柱純化，收集洗脫液， 進行SDS-PAGE分析。純化過程如下：
[0120] (1)將Ni+親和層析柱、注射器、核酸蛋白檢測儀進行連接；
[0121] (2)用5倍柱體積蒸餾水洗親和層析柱，使吸光光度值A達到最低，且保持不變；
[0122] (3)至少5倍柱體積結合緩沖液平衡親和層析柱，流速控制為lml/min，至吸光光 度值A穩(wěn)定；
[0123] (4)處理好的樣品上樣，5ml/次；
[0124] (5)上樣完畢，使用結合緩沖液洗親和層析柱，至吸光光度值A穩(wěn)定；
[0125] (6)使用洗脫緩沖液進行洗脫，收集洗脫液各組分進行SDS-PAGE電泳分析；
[0126] (7)洗脫完畢后，使用蒸餾水洗親和層析柱，置于15%乙醇，4°C保存。
[0127] 14、包涵體蛋白復性
[0128] 透析袋處理：透析袋在大體積2% (W/V)NaHC03中煮沸l(wèi)Omin，蒸餾水洗滌后，置于 lmmol/L EDTA(pH8.0)中煮沸 lOmin，冷卻后，存放于 4°C。
[0129] 洗脫蛋白置于透析袋（截留量為8000-10000)進行透析復性。透析袋置于尿素濃 度逐漸降低的PBS溶液中，尿素濃度依次為6mol/L，5mol/L，4mol/L，3mol/L，2mol/L，Omol/ L，換液間隔時間2h。
[0130] E2基因的擴增
[0131] PCR擴增BVDV-E2基因全長序列，擴增產(chǎn)物經(jīng)0. 8%瓊脂糖凝膠電泳分析后，得到 一條與預計大?。?040bp)相符的電泳條帶。
[0132] 15、pMD18-T_E2 酶切鑒定
[0133] 重組克隆質粒pMD18-T-E2經(jīng)BamH I和Xho I雙酶切分析后，電泳得到兩條片段， 與E2目的基因（KMObp)和pMD18-T載體（2672bp)相符，說明克隆片段連接入pMD18-T載 體。重組表達質粒pET-32a-E2,經(jīng)BamH I和Xho I雙酶切分析鑒定后，使用PCR進行鑒定。 酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳后出現(xiàn)兩條條帶，與E2目的基因（KMObp)和載體片段（5900bp)大小相 符，表明E2目的基因連接至pET-32a載體，表達載體pET-32a-E2構建成功。
[0134] 16、E2融合蛋白最佳誘導時間的確定
[0135] pET-32a-E2在lmmol/L的IPTG誘導下，在43ku附近出現(xiàn)目的條帶。在誘導的不 同時間下，取樣進行SDS-PAGE電泳分析，表明誘導5h，可獲得相對較好的表達。
[0136] 17、E2融合蛋白IPTG誘導濃度的確定
[0137] 在優(yōu)化的誘導時間（5?8h)下，以lmmol/L的IPTG誘導pET-32a-E2進行表達， SDS-PAGE電泳分析可獲得相對較好的表達，結果發(fā)現(xiàn)增加 IPTG的誘導濃度，表達產(chǎn)量并未 顯著增加。
[0138] 18、E2融合蛋白的可溶性分析及鑒定
[0139] 沉淀和上清分別進行SDS-PAGE電泳。結果在43ku附近，pET-32a-E2經(jīng)IPTG誘 導后，沉淀中出現(xiàn)條帶，而上清中無相應目的條帶。說明目的蛋白主要以包涵體形式存在于 沉淀中。
[0140] 19、Western blot 分析
[0141] 使用抗His標簽的一抗進行Western blot鑒定，在43ku附近出現(xiàn)條帶，上清中無 反應條帶，表面融合蛋白表達正確，帶有組氨酸標簽，且具有較好的反應原性。
[0142] 20、E2融合蛋白的純化
[0143] E2融合蛋白使用Ni+色譜柱進行純化，收集洗脫液。結果在43ku附近出現(xiàn)條帶。
[0144] 21、Braford法測定重組蛋白含量
[0145] (1)蛋白標準品（lmg/ml)完全溶解于PBS溶液中（0· 5mg/ml);
[0146] (2)將標準品按0、1、2、4、8、12、16、20 yL分別加入各孔中，加 PBS稀釋液補足到 20 μ L ；
[0147] (3)將樣品進行稀釋，加入到各孔中，加標準品稀釋液到20 μ L ;
[0148] (4)各孔加入200 yL Bradford染色液，輕輕用加樣槍吹打均勻，室溫放置 3_5min ;
[0149] (5)用酶標儀測定0D630的吸光光度值，繪制標準曲線。
[0150] 按照以上步驟加入被測樣品（重組E2蛋白），測定A630nm的吸光光度值，使用 Origins. 0軟件繪制標準曲線，根據(jù)標準曲線計算重組蛋白含量。
[0151] 22、免疫原制備及免疫
[0152] 用無菌的生