專利名稱:穩(wěn)定的α-淀粉酶溶液的生產(chǎn)方法及由此生產(chǎn)的液體α-淀粉酶的制作方法
本發(fā)明涉及制造含有從地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)而來的α-淀粉酶以及一種淀粉，最好是麥芽糖糊精的一種實際上穩(wěn)定的溶液狀的酶產(chǎn)物。
酶是生物催化劑，它們調(diào)節(jié)著許多本來就出現(xiàn)在生命有機體里的生化反應。酶用于像制革，去污劑，食品及醫(yī)藥工業(yè)之類的許多領域。在生產(chǎn)酶的傳經(jīng)方法里，酶的沉淀物是溶在水里的。然而，高效的在水里的酶溶液(具有高的酶活性的濃縮溶液)會在貯存中不穩(wěn)定;酶從溶液沉淀出來以及/或是對熱敏感的。美國專利3，242，056號揭示了使用多羥基化合物溶液來協(xié)助防止溶菌酶的不耐熱性。美國專利4，497，897號揭示了從含有丙烯甘醇，鈣離子及羧酸鹽的嘉氏伯枯草桿菌蛋白酶(Subtilisin Carlsberg)而得到的一種穩(wěn)定的液相蛋白酶。美國專利4，519，934號揭示了從散布在丙烯甘醇里的地衣芽孢桿菌而得到的一種穩(wěn)定的液體α-淀粉酶。
一種含有從地衣芽孢桿菌而得到的α-淀粉酶的液體酶產(chǎn)物呈水溶液是合乎需要的，因為它能直接用于工業(yè)上，就像液體去污劑要先把干的酶沉淀物再溶在水里并無不便之處以及/或排除了有關溶劑(即丙烯甘醇)的混溶性。同時避免了干產(chǎn)物發(fā)出的酶灰。因此，研究人員一直在尋找把酶保持在水溶液里的方法，特別是保持在高效(高度濃縮的)溶液的方法。盡管前面段落所說的已有技術指出用了各種溶劑(例如丙烯甘醇)，但從來未曾獲得一種水相的具有高酶活性的保留在溶液里的酶產(chǎn)物。
例如，α-淀粉酶能夠在一個適宜的營養(yǎng)培養(yǎng)基里培養(yǎng)像枯草牙孢桿菌(Bacillus subtilis)或地衣芽孢桿菌之類的各種不同的微生物而獲得?？莶菅挎邨U菌產(chǎn)生的α-淀粉酶在物理上是穩(wěn)定的，即是說，甚至在活性是3百萬MWU/ml(改良Wohlgemuth單位/毫升)或更高時，這種酶仍不會在水溶液里明顯地沉淀出來。然而，這些α-淀粉酶溶液對熱是敏感的，加入麥芽糖糊精以增加耐熱性。Klesov等人在國立莫斯科大學化學系“生物化學”雜志上，(Vol.44(6)p.1084-92(1979))發(fā)表的“可溶的及固相的葡糖淀粉酶的底物耐熱性作用”一文里類似地揭示了從黑曲霉(Aspergillus niger)而得到的葡糖淀粉酶以麥牙糖糊精所起的耐熱性作用。另一方面，從地衣芽孢桿菌獲得的α-淀粉酶是耐熱的(參看Volesky等人在微生物的酶生產(chǎn)純化及分離“微生物酶”Vol.2.lssue 2，p.120，1985))的實例)，但它在高濃度的水溶液里在物理上不是特別穩(wěn)定的。
本發(fā)明提供了一個如下的方法。在與用地衣芽孢桿菌的發(fā)酵提供一種從發(fā)酵而來的含酶的和含有固相廢產(chǎn)物的發(fā)酵肉湯而生產(chǎn)耐熱的α-淀粉酶相結(jié)合方面，本改進包括a)在發(fā)酵肉湯里加入一種淀粉，當加到足量時，它就會防止酶與酶結(jié)塊，從而增大了α-淀粉酶在水溶液里的溶解度。
不管怎樣，沒有任何文獻提出或揭示本發(fā)明的用淀粉來制備具有高酶活性的水相產(chǎn)物，其中酶是從地衣芽孢桿菌而得到的耐熱α-淀粉酶，因為研究了加淀粉對高達大約1，000，000MWU/ml活性的α-淀粉酶水溶液耐熱性作用的影響。
相應地，本發(fā)明的目的是提供一個實際上穩(wěn)定的α-淀粉酶溶液的配方，其中α-淀粉酶是從地衣芽孢桿菌而得到的。所謂“實際上穩(wěn)定的溶液”是指酶留在溶液里是有利的，因為當溶液夠濃時，即有高的酶濃度時，其中的活性起碼是350，000MWU/ml時利于阻止酶從溶液里沉淀出來。借助調(diào)節(jié)淀粉的量，就能獲得具有活性在1，000，000MWU/ml或更高的各種濃度的溶液，這些溶液實際上是穩(wěn)定的溶液。
本液體配方可含有除從地衣牙孢桿菌而得到的耐熱的α-淀粉酶以外的他種地方酶以及/或蛋白酶。產(chǎn)生淀粉酶以及/或蛋白酶的各種微生物包括，但不局限于枯草芽孢桿菌地衣芽孢桿菌，嗜熱脂肪芽孢桿菌(B.stearothermophilus)，以及解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)。本配方還企圖最好在去污劑上使用，而這樣可含有從兩性的、陰離的、陽離子的、非離子的、兩性離子的或中極性非離子的表面活性劑或它們的混合物的基團而來的大約0%至大約80%的去污劑表面活性劑。這樣的去污劑是人所熟知的，而且對本液體酶配方有用的一些去污劑的實例就是在美國專利4，318，818號(Letton等人)及美國專利4，111，855號(Barnat等人)所說的實例，它們所揭示的在這里都作為參考資料。
下表說明與一般生產(chǎn)方法相比的一個最佳實施例。這表只想起到說明問題的目的，而不看成是用來指導如何實施本發(fā)明的。
表A發(fā)酵(菌體分離)B培養(yǎng)濾液(PM-2微孔薄膜)C超濾濃縮(D)(ⅰ)或(D)(ⅰ)用沉淀法 用真空蒸發(fā)法獲得濾餅 獲得濃縮溶液(E″)(ⅰ)或(E″)(ⅱ) (E)(ⅰ) (E)(ⅱ)從水中的濾 連續(xù)蒸發(fā) 從含淀粉水中 以加淀粉固化餅抽提酶 的濾餅抽提酶(調(diào)pH至8，置 pH6.510℃中18-24小時)(過濾)(F′)酶濾餅產(chǎn)物 (F)液體終產(chǎn)物(G)從含淀粉水中的濾餅抽提出酶上表說明了生產(chǎn)實際上穩(wěn)定的高效能的水相α-淀粉酶制品的一個簡要方法。這個方法包括(A)進行發(fā)酵，(B)通過過濾從含有酶的發(fā)酵肉湯里分離出菌體，(C)超濾而得到酶的濃縮液，(D)或是(ⅰ)沉淀出含酶的濾餅或(ⅱ)進一步用真空蒸發(fā)濃縮或用附加的超濾濃縮，然后(E)或(ⅰ)通過在溶液里重行漿化濾餅或用循環(huán)溶液通過濾餅，從中抽提出含淀粉溶液，或?qū)⒌矸奂拥匠樘嵋豪?，?ⅱ)直接加淀粉到濃縮液里以獲得(F)一種含有終產(chǎn)物的淀粉水溶液。在常規(guī)過程里(E′)步由(ⅰ)在水中漿化濾餅從中抽提出酶，或由(ⅱ)連續(xù)蒸發(fā)而代替。然后，一個含酶的濾餅重行沉淀，而且濾出多余的母液而剩下干的酶產(chǎn)物(F′)。另外，本發(fā)明能夠在(E′)及(F′)步之后通過從這個濾餅抽提出酶進入含有淀粉的水溶液而完成(G)。
在酶產(chǎn)生以后，固體物(發(fā)酵而得到的菌體)可通過像過濾以及/或離心等標準技術，從全發(fā)酵肉湯里除去而提供出一種含酶的溶液。緊接著是含酶的無細胞溶液最好通過像超濾以及/或蒸發(fā)之類的任何濃縮方法濃縮成大約1到10倍之間。將一種淀粉或含有淀粉的一種水溶液加到這種溶液或濃縮液里，使淀粉對含酶溶液或濃縮液的量大約在0.1%～50%W/V(重量/體積)之間如在3%～15%W/V就更好。
在一個理想的實施例里，加入淀粉之前可將一些沉淀劑加到無細胞的含酶溶液(或濃縮液)里，以引起含有這種酶的濾餅沉淀出來。大家熟知的沉淀劑是像甲醇，乙醇，異丙醇，1-丙醇，正丁醇，叔丁醇以及它們的混合物之類的低分子量有機溶劑，或者是像硫酸鈉，硫酸銨，以及它們的混合物之類的鹽類。濾餅一詞在此認為應含有“漿”一詞在內(nèi)以包括濾餅濕到可稱為漿的那些例子。如果有多余的母液，它能夠通過用通常的過濾，抽濾，重力沉降或離心之類的若干種方法中的任一種從這種漿或濾餅里去除之。然后，可以配制在水中含有大約0.1%～50%W/V(大約3%～15%就更就好)淀粉的一種水溶液，并用它來溶解或從濾餅中抽提出酶。這種從濾餅抽得酶的抽提法也可用水進行，然后加淀粉到抽提液，使其量達到大約0.1%～50%W/V。
在另一個實施例里，固體廢產(chǎn)物(即從發(fā)酵而得到的菌體)在產(chǎn)生酶之后并不從發(fā)酵肉湯里分出。相反地，直接加淀粉或淀粉水溶液到全發(fā)酵肉湯里，這有助于把酶保留在溶液里，以便在除去固體廢產(chǎn)物時隨之而失的酶少些。淀粉必須加到其量在全發(fā)酵肉湯里占大約0.1%～50%(重量/體積)。
任何淀粉都可用于本發(fā)明，這意味著亦包括像乙?；矸刍蚋蚀妓狨サ矸壑惖难苌矸?。這種淀粉也許是作為酶的底物。酶通常在高溫，即像60℃里表現(xiàn)出它們的最大活性。除非加熱否則它不會明顯地作用于底物上。更特別地，地衣芽孢桿菌的α-淀粉酶，它在溫度升到40℃左右時實質(zhì)上才開始水解淀粉底物，溫度達到60℃左右時，實際上發(fā)生水解。因此，在平常的室溫貯存條件，淀粉底物不會明顯地降解。在本發(fā)明里，較好的淀粉底物是玉米糖漿及麥芽糖糊精。特別好的是麥芽糖糊精。麥芽糖糊精的貨源是MALTRIN
，例如它是一種水解的玉米產(chǎn)物(谷類實體)，它是由衣阿華州的Muscatine的谷物處理公司按不同的右旋糖當量供應的。MALTRIN是一種乏味的，白色食用的，具有十分理想的發(fā)泡性能的碳水化合物。它的甜度低，完全可溶于水且可防結(jié)塊。
例如，MALTRIN-100一個典型的分析結(jié)果是典型的理化數(shù)據(jù)右旋糖當量 9.0～12.0含水，%最高是 6.0pH，20%溶液 4.0～4.7形狀 白色粉末典型的碳水化合物測定結(jié)果(按干重計)單糖 1% 三碳糖 6% 戊糖及超過五個碳的糖84%雙糖 4% 四碳糖 5%人們發(fā)現(xiàn)麥芽糖糊精的濃度在大約3%～15%W/V時是最有利于把酶保留在溶液里的。
而且已驚奇地發(fā)現(xiàn)麥芽糖糊精的右旋糖當量(DE)和保持酶加溶作用之間有一負相關關系。即是說，麥牙糖糊精右旋糖當量越低，就有更多的酶趨向于留在溶液里。最好這種(DE)是大約35或更少一些，少于大約25就更好。這一發(fā)現(xiàn)在后面實施例Ⅳ里闡述。
具有其它右旋糖當量的其它淀粉亦可以有利地利用。其確切的機理仍未了解，但從理論上說，由于形穩(wěn)定的酶/底物這一復合體，任何淀粉都可使用。
在這個較好的實施例里，加入淀粉之前或后，將含酶溶液的pH調(diào)至酶的等電點水平或高于這個水平。這個pH應處于大約在等電點以上4.0pH單位和下至等電點的范圍里。pH最好是在等電點以上不超過大約3.0單位。α-淀粉酶的等電點變動于4.8和5.5之間，在這一酸性pH里，酶將保留在溶液里。然而保持這么低的pH值，對于貯存α-淀粉酶溶液是不可取的，因為這種酸性會使酶變性。在最好的實施例里，其中的酶是TAKA-THERM
(由印第安納州，Elkhart礦冶公司實驗室供應)。它是一種耐熱的從地衣芽孢桿菌一個突變品系的發(fā)酵而得到的α-淀粉酶，pH應在大約5.5和9.0之間，最好是在大約6.0和8.2之間。人們已發(fā)現(xiàn)在具有TAKA-THERM的較理想的實施例里用的最適宜pH大約在6.5和8.0之間。調(diào)pH的較理想的試劑是酶化學這個領域里熟知的，其例是像氫氧化鈉和氫氧化鉀之類的堿以及像鹽酸和醋酸之類的酸。
在各實施例中α-淀粉酶活性的量度是以液化α-淀粉酶分析手冊(Manual of Liquefying Alpha-Amylase Assay)介紹的一種改良Wohlgemuth，在生物化學29∶1(1908)指示的方法進行的，它是以淀粉-碘復合物蘭度減弱確定可溶性淀粉的水解度測量的。在一次典型的操作里，5毫升pH為5.4緩沖的2%可溶性淀粉及4毫升水與1毫升適當稀釋的酶一起在保持40℃的水浴中培養(yǎng)。按時間間隔(從加入酶起5～30分鐘)倒出各等分試樣(1毫升)并注入一有5毫升稀碘液的試管里靠倒量而相混和。隨后在比色計里比色以監(jiān)視這反應達到終點。酶的活性是計算成每毫升含改良Wohlgemuth單位(MWU/ml)。
一改良Wohlgemuth單位(MWU)是指在分析條件下30分鐘內(nèi)糊精化1毫升可溶性淀粉成為規(guī)定蘭色數(shù)值。為了計算，假設其密度是水的密度，因而每毫升的活性就被假定是相當于每克的活性。其計算是MWU/ml＝MWU/g＝ (100×3)/(TXW) 3000/(TXW)式中100＝每次培養(yǎng)混合物時的淀粉，毫克30＝規(guī)定糊精化時間，分T＝到達終點所需時間，分W＝在1毫升酶稀釋等分樣品里加于培養(yǎng)混合物里的酶重量克。
使用麥芽糖糊精作淀粉底物的α-淀粉酶在高濃度時其穩(wěn)定理論示意表達如下。已經(jīng)意外地發(fā)現(xiàn)低溶液中游離酶濃度的因素亦在酶活性高時妨礙酶的凝結(jié)。從稀酶溶液里除去水份有利于讓酶與酶相作用來代替酶與水相作用。因此增加酶與酶相作用便會引起這些酶通過非共價引力相締合最后導致酶沉淀。
n(E)→(E)n→凝聚→沉淀↓ ↓水 水已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在酶的抽提液里或當酶濃縮時加入淀粉(S)就防止了酶在高濃度時不溶解，正如以下方程式所表達一樣。
n(E)+m(S)→(ES)x+S(n-m)+En-x如n＞m時平衡時，溶液里通常包含有X克分子的酶/淀粉復合物(ES)，”淀粉(Sn-m)及游離酶(En-x)這一實驗數(shù)據(jù)表明，在無任何淀粉時，當游離酶(En-x)的濃度超過350，000MWU/ml以酶在溶液里的重量為準的活性時，酶就出現(xiàn)沉淀。
在后面各實施例里闡述的那些實施例都使用TAKA-THERM，一種從地衣芽孢桿菌而得到的耐熱α-淀粉酶，而并不在此限止本發(fā)明。
適于培養(yǎng)地衣芽孢桿菌一個品系以生產(chǎn)耐熱α-淀粉酶的發(fā)酵培養(yǎng)基可按下表配剩以供1000立升發(fā)酵罐用。
CaCl22H2O(薄片) 0.2～1.0公斤KH2PO4+K2HPO415～24公斤(NH4)2SO42～7公斤合適的碳源 100～200公斤棉籽粉 25～140公斤大豆基(大豆粉) 30～50公斤Mazu DF6000＊ 8～13升水 加至總量 1000 升＊由Mazu公司供應的一種有機去泡劑，其主要成份是聚丙二醇和聚硅氧烷。
將地衣芽孢桿菌菌株的活細胞接種到這個培養(yǎng)基里，并讓它在維持于近似中性pH的40～50℃下發(fā)酵70～90小時，這樣發(fā)酵后，用適當?shù)男跄齽┬跄囵B(yǎng)基以助除去菌體。菌體也可用像離心或過濾的方法來除掉，而液體通過一濾鼓澄清，從而提供一無細胞的溶液(初級培養(yǎng)液或上清液)。這種濾鼓一般是預先用像Superaid的助濾劑涂過以澄清(即凈化)這種初級培養(yǎng)濾液或上清液。
在一個較理想的實施例里，這種初級培養(yǎng)液也可用像PM-10微孔濾膜(斷流分子量10000)以及/或真空之類的超濾來濃縮。因而，酶可通過加入20%W/V硫酸鈉，28%W/V硫酸銨或80%(V/V)乙醇而較好地且定量地從濃縮的培養(yǎng)濾液里沉淀(pH6～8)成含酶濾餅的形式。接著用水從濾餅中抽提酶，并將麥芽糖糊精加到抽提液里。
實施例Ⅰ如前所述，將通過涂有Superaid的濾鼓凈化了的α-淀粉酶初級培養(yǎng)濾液，用Romicon20-HF-4過濾器裝上斷流分子量10，000的微孔濾膜在10℃下超濾濃縮7倍，并把它分為若干等分樣品。每一等分樣品的pH用20%W/V的氫氧化鉀水溶液調(diào)至7.6。然后，按不同的百分比W/V把Maltrin-20加到幾個樣品里充分地攪拌使它們均勻混和。留下一些樣品(0%W/V Maltrin-20)作對照。緊接著，每個樣品都進一步在35℃下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(Brinkman-Buchi Rotovapor
)真空濃縮成對特定的樣品具有理想的淀粉酶活性和滿意的Maltrin濃度。所有的樣品都加入0.5%W/V的山梨酸鉀酯來防止微生物污染。接著在25℃下貯存1個月。到指定日期后，把這些樣品離心。其酶量(是起始量、留在上清液里的量或是沉淀了的量)能像前述那樣通過測定MWU/ml活性而確定。例如，測出在上清液中的酶量，并用酶的起始量減之就得到損失在沉淀里的酶量。這個量可用公式100×(沉淀酶量/起始酶量)換等成沉淀酶的百分比。它們的結(jié)果歸納在下列表Ⅰ里。
表Ⅰ在25℃下貯存1個月期間Maltrin-20對α-淀粉酶沉淀程度的影響樣品號 起始量MWU/ml Maltrin-20濃度(%W/V) 沉淀酶%1 1，043，478 0.00＊ 93.52 1，043，478 2.11 28.53 960，000 3.70 37.84 1，043，478 6.34 25.65 1，180，378 7.40 -6 779，721 0.00＊ 88.87 789，474 2.6 79.48 845，522 5.4 16.49 895，522 9.0 17.610 845，070 11.4 25.411 845，070 13.6 22.012 716，418 0.00＊ 85.213 872，727 2.38 21.014 979，592 4.54 68.815 786，885 6.25 16.716 786，885 8.33 17.817 872，727 11.36 25.018 640，000 0.00＊ 80.919 551，724 2.2 71.120 578，313 4.2 39.821 578，313 5.73 54.022 516，129 8.00 14.423 558，140 10.00 15.1
表Ⅰ(續(xù))樣品號 起始量MWU/ml Maltrin-20濃度(%W/V) 沉淀酶%24 470.588 0.00＊ 54.825 452，830 2.1 68.226 452，830 4.2 45.227 470，588 6.3 14.228 452，830 8.4 14.329 489，796 11.25 15.430 369，231 0.00＊ 56.031 421，053 2.74 14.032 406，780 4.25 12.733 380，952 6.57 14.534 380，952 8.76 13.035 393，443 10.96 11.9＊樣品1，6，12，18，24及30是對照。
列于表Ⅰ的結(jié)果表明，在濃的培養(yǎng)濾液里Maltrin阻止了酶沉淀。然而就如同在后面實施例Ⅲ所說的較好的實施例一樣這些酶在高效的溶液里是不能維持的。
實施例Ⅱ除濃縮、調(diào)節(jié)pH，以及加Maltrin的順序不同外，其它步驟都跟實施例Ⅰ一樣。通過超濾以及隨后蒸發(fā)變成大約700，000MWU/ml這一濃度而把所有的培養(yǎng)濾液濃縮7倍。然后把濃縮液pH調(diào)至7.6和把它分成4份，每份加入不同濃度的Maltrin-20。這些樣品在25℃下徐徐攪拌40小時，然后離心。損失在沉淀物中酶的百分數(shù)是用實施例Ⅰ相同的方法計算的。其結(jié)果歸納在下列表Ⅱ中。
表ⅡMaltrin-20在700，00MWU/ml的作用Maltrin-20 沉淀酶(%W/V) %0.00 842.0 744.0 488.0 6.2從上表可見不同量的Maltrin-20，高者達8.0%W/V，證明由于沉淀造成酶的損失急劇下降。然而與下列實施例Ⅲ中較好的實施例一樣，這種活性在高效能溶液里不會保持。
實施例Ⅲ按前面說法用PM-10微孔薄膜濾濃縮了4倍，接著又用(20%W/V)Na2SO4沉淀得到的一種α-淀粉酶溶液供本實施例使用。
由于用硫酸鈉作沉淀劑，因而將溫度加至室溫以上，即近30℃，以減輕硫酸鈉結(jié)塊。將助濾劑FW-6(1%W/V)加入并用真空過濾器收集含酶濾餅。從過濾器里將含酶濾餅移出，并在少量水中重行漿化以便將酶從中溶出。過濾這些漿以得出濃縮的酶溶液，然后用水調(diào)高起始酶濃度到用測量活性測定是1，000，000MWU/ml處，并進一步將它分為7個等分樣品，將Maltrin-250(粉狀)分別為1%，2%，3%，4%，5%及10%的量加到6個等份樣品里。將一個等樣品百作對照(0%Maltrin-250)。加入后，充分攪拌樣品使其均勻地混和，而且用氫氧化鉀把pH調(diào)至8.0，因為加進了Maltrin，起始活性就減弱，即會有Maltrin-250相應量的各個適當?shù)目諜谝鄿蕚溆脕砼懦魏斡捎贛altrin對分析起作用而造成的誤差。所存的樣品都在10℃中貯存24小時。到指定時間后，就過濾各樣品。正如前面所說的，酶量是由測定活性來確定的。因此，將在濾液里測定的酶量，從已改準的起始酶量中減去而得出損失在沉淀里的酶。用100×(沉淀酶/改準的起始酶)而把它換算成沉淀酶百分比。其結(jié)果歸納在下列表Ⅲ中。
表Ⅲ在pH8.0，10℃中貯存了24小時高起始酶濃度為1，000，000MWU/ml時Maltrin-250對α-淀粉酶的水相穩(wěn)定性的影響樣品號 Maltrin-250的濃度(%W/V) 沉淀酶%1對照 0 802 1 453 2 184 3 05 4 06 5 07 10 0這種水相酶溶液比在前面實施例Ⅰ所說的濃縮培養(yǎng)濾液純得多，因為硫酸鈉沉淀除去了雜物。因此，在溶液里基本上不必用多于3%W/V的Maltrin來保持所有的酶的活性。正如所能見到的那樣，當Maltrin-250的濃度是3%W/V或更多時就無酶沉淀，因此以其活性計，100%的淀粉酶留在濾液里。
實施例Ⅳ在此例中除加入Maltrin的量保持不變而其右旋糖當量變化外，其余的都是重復實施例Ⅲ的。因此，研究了麥芽糖糊精的聚合度(DP)在高活性時對α-淀粉酶穩(wěn)定性的影響。用右旋糖當量不同的麥芽糖糊精1%W/V加到8個含有起始活性為1，000，000MWU/ml的濃的α-淀粉酶等分樣品。每個樣品的pH都用氫氧化鉀調(diào)至8.0，而且其活性用加入Maltrin來調(diào)準。這些樣品在10℃下貯存24小時，到指定時間后，這些貯存過的樣品就過濾。其濾液用來分析α-淀粉酶活性并用在實施例Ⅲ里相同的方法計算沉淀酶的百分數(shù)。其結(jié)果歸納在下表里。
表Ⅳ在起始酶濃度高達1，000，000MWU/ml，貯在10℃24小時下右旋糖當量(DE)對α-淀粉酶的穩(wěn)定性的影響樣品號 淀粉底物 測得的DE 沉淀酶%1 Maltrin-040 5.2 40.02 Maltrin-100 11.4 41.53 Maltrin-150 16.1 41.54 Maltrin-200 22.5 45.55 Maltrin-250 23.6 45.56 Maltrin-365 35.7 51.07 Maltose 68.0 82.08 Glucose 100.0 85.09 對照 無 - 80.6在表Ⅳ的結(jié)果表明隨著麥芽糖糊精的右旋糖當量(DE)下降，酶的穩(wěn)定性就增加。在與對照相比時加入麥牙糖或葡萄糖也不會有任何減少沉淀酶的作用，相反地起到微弱增加的作用。
比較實施例A(無Maltrin)本實施例使用了像在實施例Ⅱ所說的以超濾及硫酸鈉沉法(20%W/V)而獲得的濃的α-淀粉酶溶液。
濃的酶溶液的pH是用氫氧化鉀調(diào)至pH8.0，然后將這溶液進一步分為三個樣品。隨后用水調(diào)每個樣品的酶的起始濃度至分別是1，000，000MWU/ml，700，000MWU/ml及350，000MWU/ml活性。然后三個樣品中的每一個再分為四份，并貯存在5℃，10℃，24℃及37℃里18小時。到指定時間后，這些樣品用Whatman3號濾紙過濾，在濾液里的酶量是通過測量而算出沉淀酶的百分數(shù)。這些結(jié)果極導在下表A中。
表A在pH8.0及各種溫度下貯存18小時，溫度及起始酶濃度對沉淀酶的作用起始酶活性MUW/ml 培養(yǎng)溫度℃ pH8.0 18小時后沉淀酶%1.1，000，000 5 81.310 80.025 80.737 75.02.700，000 5 44.310 45.625 41.437 23.83.350，000 5 4.810 7.325 7.337 0.0上表的結(jié)果清楚地證明了在沒有Maltrin時起始酶與酶沉淀的程度之間的關系。在pH8.0下貯存含有1，000，000MWU/ml高起始活性的酶水溶液18小時導致75-81.3%的酶沉淀，而350，00MUW/ml低起始活性的只導致7.3%或更少的酶損失在沉淀里。換言之，當酶溶液的效能增加時，即該溶液具有較高濃度的α-淀粉酶時，那么就使酶趨向沉淀而不是留在溶液里。
比較實施例B(無Maltrin)在此例中除活性保持不變而pH變化外，其余的都重復實施例A正如在實施例A一樣，已用水調(diào)成1，000，000MUW/ml高起始活性的濃縮溶液的一個等分樣品被分成六個等分樣品。各個都用氫氧化鉀調(diào)至分別為pH5.5，6.5，7.5，8.5，9.5及10.5，并在5℃下貯存18小時。貯存后，這樣樣品用Whatman3號濾紙過濾，并測定留在濾液里的酶，然后用像實施例A相同的方法計算沉淀酶的百分數(shù)。其結(jié)果歸納在下表B里。
表B在高起始活性，貯存在5℃，18小時后pH對α-淀粉酶沉淀的影響樣品號 pH 沉淀的α-淀粉酶%1 5.5 02 6.5 9.03 7.5 65.04 8.5 80.05 9.5 76.56 10.5 52.0從溶液里沉淀出酶的程度隨pH從6.5至8.5的增加而增加，而在pH8.5時達到最大值。pH在8.5以上，就發(fā)現(xiàn)損失在沉淀里的酶減少。這也許是在高堿性pH時沉淀了的酶重溶之故。已有趣地注意到，在高起始濃度時，酶的最大溶解度出現(xiàn)在pH5.5處，它是接近這種酶的等電點。然而，如前所述，在長期貯存中，這樣的酸性pH會使酶變性。
比較的實施例C(無Maltrin)在pH8.0時溫度對α-淀粉酶沉淀率的影響一個含有起始活性1，000，000MWU/ml的濃縮酶水溶液的等分樣品，除各自的pH都用氫氧化鈉調(diào)至8.0以外，其余的都像在實施例B那樣分裝在兩個不同的瓶里(每個樣品150ml)。然后，兩個樣品分別地貯存在10℃或37℃處。從每個瓶里按不同的時間間隔即2.5小時，4小時，7小時，10小時，12小時及20小時每次倒出10ml等分樣品。倒出后，每個等分樣品立即用Whatman3號濾紙過濾并分析濾液的α-淀粉酶。然后用像在實施例A相同的方法計算沉淀酶的百分數(shù)，其結(jié)果歸納在下表C中。
表CpH8.0時溫度α-淀粉酶沉淀率的影響時間(小時) 沉淀酶%10℃ 37℃2.5 - -4 - -7 36 -10 61 1912 75 4020 80 65表C的結(jié)果表明低溫利于酶沉淀而37℃利于酶溶解。
在總結(jié)關于表A，B，及C時，其結(jié)果清楚地證明在溶液里起始酶與在不同pH值及溫度下酶損失在沉淀上的程度的相互關系。從酶溶液里除去水，即使之濃縮成高活性的溶液，會引起增加蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用，這就趨向有利于酶的凝結(jié)而導致沉淀。實施例Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ及Ⅳ的比較清楚地說明向高活性的濃縮溶液加入Maltrin，阻礙了蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用，而有利于酶的溶解。
權利要求
1.一種與用地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)發(fā)酵來提供一種含有從發(fā)酵而得的酶及固體廢產(chǎn)物的發(fā)酵肉湯而生產(chǎn)耐熱的α-淀粉酶相結(jié)合方法，本發(fā)明的改進包括向發(fā)酵肉湯里加入淀粉，當加的量足夠時，就會阻礙酶與酶結(jié)塊，從而增進了在水溶液里α-淀粉酶的溶解度。
2.按權利要求
1所述的方法，其中發(fā)酵肉湯在加入淀粉之前先行處理去除固體廢產(chǎn)物而提供一種無細胞的含酶溶液，淀粉加到這種溶液里由此而提供一種實際上穩(wěn)定的水溶液，α-淀粉酶產(chǎn)物。
3.按權利要求
2所述的方法，其中(a)是通過把淀粉混和到含酶溶液里，使淀粉含量占溶液體積之比的量從大約0.1%至50%而完成的，其中淀粉是直接把加入或先把淀粉溶在水中再將得到的淀粉水溶液加入。
4.按權利要求
3所述的方法，其中含酶溶液被濃縮大約1至10倍，而且是在濃縮當中或濃縮之后加入淀粉的。
5.按權利要求
4所述的方法，其中在加入淀粉之前或之后，把pH調(diào)至從近似該酶的等電點直至近似該等電點以上4.0pH單位范圍以內(nèi)的一點上。
6.按權利要求
5所述的方法，其中水相產(chǎn)物的活性的≥350，000MWU/ml。
7.按權利要求
1所述的方法，其中淀粉是α-淀粉酶的底物。
8.按權利要求
7所述的方法，其中淀粉底物是玉米糖漿或麥牙糖糊精。
9.按權利要求
8所述的方法，其中淀粉底物是具有大約低于35的右旋糖當量的麥芽糖糊精。
10.按權利要求
2所述的方法，其中在除去固體廢產(chǎn)物以提供無細胞含酶溶液之后以及在加淀粉之前，這種含酶溶液要加入一種選自一批由鹽和低分子量的有機溶劑組成的沉淀劑，以引起含有該酶的濾餅沉淀，隨后該酶又從含酶濾餅抽提出來進到(ⅰ)水里，接著加淀粉到這個抽提液里使淀粉重量達到占水的體積大約0.1%-50%，或者抽提而進到(ⅱ)含量淀粉重量占水的體積大約0.1%-50%的淀粉水里。
11.按權利要求
10所述的方法，其中從濾餅抽提酶主要包括循環(huán)水或淀粉水溶液通過濾餅或者在水里或淀粉溶液里重行漿化濾餅。
12.按權利要求
10所述的方法，其中在加入淀粉之前或之后，將抽提液pH調(diào)至從近似該酶的等電點直至近似該等電點以上4.0pH單位范圍以內(nèi)的一點上。
13.按權利要求
10所述的方法，其中鹽類沉淀劑是選自一批包括硫酸鈉，硫酸銨及其混合物，而有機溶劑沉淀劑是選自一批包括甲醇，乙醇1-丙醇，異丙醇，正丁醇，叔丁醇及其混合物。
14.按權利要求
10所述的方法，其中在加入沉溶劑之前，將含酶溶液濃縮大約1-10倍之間。
15.按權利要求
14所述的方法，其中水相產(chǎn)物的活性是≥350，000MWU/ml。
16.按權利要求
10所述的方法，其中淀粉是一種α-淀粉酶的底物。
17.按權利要求
16所述的方法，其中淀粉底物是玉米糖漿或麥芽糖糊精。
18.按權利要求
17所述的方法，其中淀粉底物是具有低于大約35的右旋糖當量的麥芽糖糊精。
19.按權利要求
2所述的方法來來制造一種實際上穩(wěn)定的水溶液狀的α-淀粉酶產(chǎn)物。
20.按權利要求
14所述的方法來制造一種實際上穩(wěn)定的水溶液狀的α-淀粉酶產(chǎn)物。
21.一種實際上水相穩(wěn)定的溶液狀的α-淀粉酶的配方，包括從地衣芽孢桿菌得到的耐熱α-淀粉酶，以及大約0.1-50%W/V的淀粉。
22.按權利要求
21所述的配方，進一步包括除從地衣芽孢桿菌而得的耐熱α-淀粉酶以外的淀粉酶，蛋白酶，或其混合物。
23.按權利要求
21所述的配方，進一步包含大約0%-80%從一組兩性的，陰離子的，陽離子的，非離子的，兩性離子的，或中極性非離子的表面活性劑，或它們的混合物而來的去污劑表面活性劑。
24.按權利要求
22所述的配方，進一步包括大約0%-80%的，從一組兩性的，陰離子的，陽離子的，非離子的，兩性離子的，或中極性非離子的表面活性劑，或它們的混合物而得到的去污劑表面活性劑。
專利摘要
本發(fā)明設想了一個從地衣芽孢桿菌得到穩(wěn)定 的α-淀粉酶溶液的新的制備方法，而且用這方法 制造出高效能的液體酶產(chǎn)物。從發(fā)酵而得的含酶溶 液一般被濃縮并把淀粉加到這種濃縮液里。另一方 面，將象鹽之類的沉淀劑加到溶液中并沉淀出含有 這種酶的濾餅。然后將這個濾餅與含有淀粉的水溶 液相接觸而抽提出濾餅中的酶來提供一種穩(wěn)定的液 體酶產(chǎn)物。
文檔編號C12N9/96GK86107635SQ86107635
公開日1987年5月13日 申請日期1986年11月3日
發(fā)明者杰克·威廉·布魯爾, 金忠烈, 柯蒂斯·杰里·蒙哥馬利, 賈雅拉馬·卡丹戈德·謝蒂 申請人:邁爾斯實驗室公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan