專利名稱:新的螨變應原的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有變應原活性的重組螨變應原，具體涉及導致狗特應性的螨變應原。本發(fā)明進一步涉及編碼變應原的基因、使得基因能夠表達的表達載體、通過用表達載體轉(zhuǎn)化獲得的轉(zhuǎn)化體、制備重組螨變應原的方法、螨變態(tài)反應性疾病的治療劑，和螨變態(tài)反應性疾病的診斷劑。
背景技術(shù)：
已知屋塵螨是諸如特應性皮炎和支氣管哮喘的變態(tài)反應性疾病的主要原因。常規(guī)地，使用變態(tài)反應的致病物質(zhì)作為治療劑的脫敏治療被認為是最重要的基本治療方法。具體地，對諸如花粉病、屋塵螨變態(tài)反應和真菌性變態(tài)反應的疾病廣泛進行了脫敏治療，這些疾病是難以避免的諸如吸入的變應原的抗原誘導的。但是，由于致敏抗原的作用，脫敏治療涉及過敏的危險，因此，需要施用安全的治療性抗原。正在研究所述安全的致敏抗原。
至于螨變態(tài)反應性疾病，報道了兩種類型的螨，即屋塵螨(Dermatophagoides pteronyssinus)和粉塵螨(Dermatophagoides farinae)是屋塵中的變應原來源(參見非專利文件1和2)。從這些螨分離了主要的螨變應原。已知這些螨變應原是分子量為24kD-28kD的糖蛋白(pI 4.6-7.2)和/或包含在螨排泄物中的分子量為14.5kD-20kD的蛋白(pI 5-7.2)和/或螨體(參見非專利文件3-7)。
至于螨變應原基因，克隆了屋塵螨的主要變應原Der p 1(分子量25,371)和Der p 2(分子量14,131)以及粉塵螨的主要變應原Der f 1(分子量25,191)和Der f 2(分子量14,021)，也確定了它們的核苷酸序列(參見非專利文件8-15)。也制備了基于這些變應原的重組變應原，進行了涉及這些變應原的研究。此外，也報道了Der f 3，即一種分子量為大約30,000的變應原的核苷酸序列(參見非專利文件16)。此外，作為螨變應原，也報道了ma10、ma3、ma15、ma29、ma44、ma50、ma113、ma114和ma115(參見專利文件1)。此外，也報道了表現(xiàn)與抗-Der f 2血清的強交叉反應性的ma124(參見專利文件2)。
此外，報道了98-kDa Der f 15、109-kDa Der f 15(參見非專利文件17)和60-kDa Der f 18(參見非專利文件18)在狗中是與IgE強反應的變應原。
作為診斷螨變態(tài)反應性疾病的方法，常規(guī)將皮內(nèi)反應測試作為主流方法，該方法基于患者的病史，并且使用屋塵螨提取物和/或螨體提取物。該方法與涉及血清IgE抗體滴度(相對值)測量的RAST(放射變應原吸附測試)方法、吸入誘導測試和鼻粘膜刺激測試等組合。但是，直接診斷螨變態(tài)反應性疾病仍然非常困難。
常規(guī)進行了支氣管哮喘的脫敏治療方法，該方法采用屋塵提取物和屋塵螨作為特異性變應原。但是，還沒有成功分析屋塵的組成。此外，屋塵含有很多類型的可以誘導過敏的雜質(zhì)。因此，在這些情況下，屋塵的劑量是非常有限的。因此，常規(guī)脫敏治療的效果是非常低水平的。因此，需要用于脫敏治療的更有效和更安全的抗原。公知的是有效用于脫敏治療的變應原存在于螨的高分子量粗排泄物的級份中。由這些級份，不能獲得足夠用于脫敏治療的量的螨變應原。因此，采用涉及從通過飼養(yǎng)螨獲得的產(chǎn)物提取和純化螨變應原的方法，獲得用于治療的抗原的穩(wěn)定供應是困難的。此外，如上文的描述，常規(guī)報道了用基因重組技術(shù)制備多種重組螨變應原。但是，不能說這些變應原對于實際治療總是有效的。需要提供具有更有效的、新的和更高的螨變應原活性的重組螨變應原。
專利文件1 日本專利公開(Kokai)No.7-112999 A(1995)專利文件2 日本專利公開(Kokai)No.7-278190 A(1995)非專利文件1 Allerg.Asthma，10，329-334(1964)非專利文件2 J.Allergy，42，14-28(1968)非專利文件3 J.Immunol.，125，587-592(1980)非專利文件4 J.Allergy Clin.Immunol.，76，753-761(1985)非專利文件5 Immunol.，46，679-687(1982)非專利文件6 Int.Arch.Allergy Appl.Immunol.，81，214-223(1986)非專利文件7 J.Allergy Clin.Immunol.，75，686-692(1985)非專利文件8 Int.Arch.Allergy Appl.Immunol.，85，127-129(1988)
非專利文件9 J.Exp.Med.，167，175-182(1988)非專利文件10 J.Exp.Med.，170，1457-1462(1989)非專利文件11 Int.Arch.Allergy Appl.Immunol.，91，118-123(1990)非專利文件12 Int.Arch.Allergy Appl.Immunol.，91，124-129(1990)非專利文件13 Jpn.J.Allergol.，39，557-561(1990)非專利文件14 Clinical and Experimental Allergy，21，25-32(1991)非專利文件15 Clinical and Experimental Allergy，21，33-37(1991)非專利文件16 FEBS Lett.，377，62-66(1995)非專利文件17 Vet.Immunol.Immunopathol，78，231-247(2001)非專利文件18 J.Allergy Clin.Immunol，112，79-86(2003)
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供不含誘導過敏的雜質(zhì)的安全和有效的重組螨變應原，作為螨變態(tài)反應性疾病的治療劑或診斷劑。更具體地，本發(fā)明的目的是提供來源于螨體的基因，并且提供使得基因能夠表達的表達載體。本發(fā)明的另一目的是提供具有變應原活性的新的螨變應原，其是通過表達來源于螨體的基因而獲得的。本發(fā)明的進一步的目的是提供含有重組螨變應原作為活性成分的螨變態(tài)反應性疾病的新治療劑，并且提供含有重組螨變應原的螨變態(tài)反應性疾病的新診斷劑。
作為廣泛研究以實現(xiàn)上述目的結(jié)果，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了新的螨變應原，并且發(fā)現(xiàn)該變應原在脫敏治療中發(fā)揮極佳的作用。因此，發(fā)明人完成了本發(fā)明。
具體地，本發(fā)明的描述如下[1]以下重組螨變應原(a)或(b)(a)包含SEQ ID NO2或35所示氨基酸序列的重組螨變應原；或(b)包含通過對SEQ ID NO2或35所示氨基酸序列缺失、取代或添加一個或幾個氨基酸而得到的氨基酸序列，并且具有螨變應原活性的重組螨變應原。
編碼以下螨變應原(a)或(b)的基因(a)包含SEQ ID NO2或35所示氨基酸序列的螨變應原；或(b)包含通過對SEQ ID NO2或35所示氨基酸序列缺失、取代或添加一個或幾個氨基酸而得到的氨基酸序列，并且具有螨變應原活性的螨變應原。
包含以下DNA(c)或(d)的基因(c)包含SEQ ID NO1或34所示核苷酸序列的DNA；或(d)在嚴格條件下與包含特定序列的DNA雜交，并且編碼具有螨變應原活性的蛋白的DNA，所述特定序列與包含SEQ ID NO1或34所示核苷酸序列的DNA的序列互補。
根據(jù)[1]的螨變應原的片段肽。
根據(jù)[4]的片段肽，其包含含有SEQ ID NO3-SEQ ID NO19所示氨基酸序列中的至少一個序列的氨基酸序列。
螨變應原的片段基因，其編碼[4]或[5]的片段肽。
重組載體，其包含[2]或[3]的基因或[6]的片段基因。
融合蛋白，其由[1]的螨變應原和另一種蛋白組成。
用[7]的表達載體轉(zhuǎn)化的細菌、酵母、昆蟲或動物細胞。
生產(chǎn)重組螨變應原的方法，該方法包括在可以表達基因的條件下培養(yǎng)[9]的細菌、酵母、昆蟲或動物細胞，導致細胞產(chǎn)生重組螨變應原，然后收獲重組螨變應原。
生產(chǎn)重組螨變應原的方法，該方法包括在可以表達基因的條件下培養(yǎng)[9]的細菌、酵母、昆蟲或動物細胞，導致細胞產(chǎn)生融合重組螨變應原，收獲融合重組螨變應原，然后除去與變應原融合的另一種蛋白。
螨變態(tài)反應性疾病的治療劑，其含有[1]的重組螨變應原、[4]的片段肽或[8]的融合蛋白作為活性成分。
螨變態(tài)反應性疾病的診斷劑，其含有[1]的重組螨變應原、[4]的片段肽或[8]的融合蛋白作為活性成分。
抗[1]的螨變應原的抗體。
根據(jù)[14]的抗螨變應原的抗體，其是單克隆抗體。
雜交瘤，其產(chǎn)生[15]的單克隆抗體。
屋塵中的螨變應原的免疫測定方法，其使用[14]-[16]的任意一項的抗體。
根據(jù)[17]的屋塵中的螨變應原的免疫測定方法，其是ELISA法。
說明書包括了本申請的優(yōu)先權(quán)文件日本專利申請No.2004-116089的說明書和/或附圖中公開的部分或所有內(nèi)容。
圖1是表示重組狗FcεRIα鏈的電泳結(jié)果的照片。
圖2是表示重組狗FcεRIα鏈與IgE的結(jié)合的照片。
圖3顯示檢測粉塵螨特異性IgE的結(jié)果。
圖4是顯示用重組狗FcεRIα鏈進行Western印跡分析的結(jié)果的照片。
圖5是顯示從粉塵螨提取的抗原的2-D(二維)電泳圖樣的照片。
圖6顯示的照片顯示了粉塵螨變應原蛋白的2-D(二維)電泳和Western印跡分析的結(jié)果。
圖7-1顯示了Zen1基因的部分核苷酸序列和氨基酸序列。
圖7-2顯示了Zen1基因的部分核苷酸序列和氨基酸序列(續(xù)圖7-1)。
圖8-1顯示了Zen1基因的全長cDNA核苷酸序列和氨基酸序列。
圖8-2顯示了Zen1基因的全長cDNA核苷酸序列和氨基酸序列(續(xù)圖8-1)。
圖8-3顯示了Zen1基因的全長cDNA核苷酸序列和氨基酸序列(續(xù)圖8-2)。
圖8-4顯示了Zen1基因的全長cDNA核苷酸序列和氨基酸序列(續(xù)圖8-3)。
圖9是顯示用大腸桿菌制備然后純化的重組Zen1的SDS-PAGE結(jié)果的照片。
圖10是顯示通過抗Zen1多克隆抗體的Western印跡分析的反應結(jié)果的照片。泳道1顯示重組Zen1的結(jié)果，用的2顯示螨體的結(jié)果。
圖11是顯示ELISA分析的重組Zen1與IgE的反應性結(jié)果的照片。
實施本發(fā)明的最佳方式下面詳細描述本發(fā)明。
(1)分離螨變應原Zen1蛋白和確定其部分序列用獲自臨床診斷為具有螨變態(tài)反應的動物的螨變應原特異性IgE確定螨變態(tài)反應。具體地，用含有例如螨變應原特異性IgE、螨提取物、識別病原體特異性IgE的IgE受體的血清，通過Western印跡鑒定螨變應原。可以通過公知的方法鑒定變應原。
由此鑒定的本發(fā)明的新的螨變應原是一種Zen1蛋白，分子量為150kDa-200kDa。
可以通過進行電泳，然后從螨變應原斑點提取螨變應原而分離鑒定的螨變應原。此時，需要進行2-D(二維)電泳，以便與其它蛋白完全分離。
用由此提取的螨變應原，可以通過公知的方法確定部分序列。公知的確定部分序列的方法的實例包括基于MS/MS和肽作圖的從頭測序。
(2)通過RT-PCR制備cDNA克隆可以通過從螨提取mRNA，用mRNA作模板合成螨變應原cDNA，構(gòu)建cDNA文庫，然后篩選靶，獲得編碼本發(fā)明的螨變應原的DNA。
所述mRNA的供應源是螨體，螨優(yōu)選是粉塵螨、屋塵螨等，它們是屋塵螨。但是，其實例不限于此。通過常用技術(shù)可以制備所述mRNA。由此獲得的mRNA作為模板，基于上文(1)中獲得的序列信息設(shè)計引物，然后合成編碼螨變應原的cDNA片段。將由此獲得的片段亞克隆到合適的載體如pGEM(由Promega生產(chǎn))。然后通過諸如循環(huán)測序方法的標準方法確定核苷酸序列。
SEQ ID NOS3-19示出了本發(fā)明的螨變應原的部分氨基酸序列。其中，通過從頭測序確定了SEQ ID NOS3-7中所示的序列。N末端氨基酸序列示于SEQ ID NO19。通過肽作圖確定了SEQ ID NOS8-18中所示的序列。
本發(fā)明包括螨變應原，它包含的氨基酸序列包含至少一個SEQ IDNOS3-19所示的氨基酸序列，這些序列代表作為螨變應原的Zen1蛋白的片段。
編碼作為本發(fā)明的螨變應原的Zen1蛋白的Zen1基因的DNA的部分核苷酸序列示于SEQ ID NO1，其全長核苷酸序列示于SEQ ID NO34。作為本發(fā)明的螨變應原的Zen1蛋白的部分氨基酸序列示于SEQ IDNO2，其全長氨基酸序列示于SEQ ID NO35。
只要包含所述氨基酸序列的蛋白具有螨變應原活性，在氨基酸序列中可以發(fā)生至少一個，優(yōu)選一個或幾個氨基酸的缺失、取代或添加。
例如，可以缺失SEQ ID NO2或SEQ ID NO35所示氨基酸序列的至少一個，優(yōu)選一個或幾個(如1-10，進一步優(yōu)選1-5個)氨基酸?？梢栽赟EQ ID NO2所示氨基酸序列中添加至少一個，優(yōu)選一個或幾個(如1-10，進一步優(yōu)選1-5個)氨基酸。或者，可以用其它氨基酸取代SEQ ID NO2所示氨基酸序列中的至少一個，優(yōu)選一個或幾個(如1-10，進一步優(yōu)選1-5個)氨基酸。
通過對SEQ ID NO2或SEQ ID NO35所示氨基酸序列缺失、取代或添加一個或幾個氨基酸而得到的所述氨基酸序列包括與SEQ IDNO2或SEQ ID NO35的氨基酸序列具有至少85％或更多，優(yōu)選90％或更多，進一步優(yōu)選95％或更多，特別優(yōu)選97％或更多同源性的序列，所述同源性例如是用BLAST(Basic Local Alignment Search Tool at theNational Center for Biological Information)，采用最初設(shè)置的缺省參數(shù)計算的。
具有通過對SEQ ID NO2或SEQ ID NO35所示氨基酸序列缺失、取代或添加一個或幾個氨基酸而得到的所述氨基酸序列的蛋白與具有SEQ ID NO2或SEQ ID NO35的氨基酸序列的蛋白基本相同。
此外，本發(fā)明的基因的實例也包括能夠在以下條件下與包含特定序列的DNA雜交，并且編碼具有螨變應原活性的蛋白的DNA，所述特定序列與具有上述SEQ ID NO1或SEQ ID NO34所示DNA序列的基因的序列互補。具體地，所述條件使得能夠用固定了DNA的濾器在68℃下0.7M-1.0M NaCl存在下雜交，并且在68℃下用0.1-2×SSC溶液(1×SSC包含150mM NaCl和15mM檸檬酸鈉)洗滌，從而進行鑒定?；蛘?，本發(fā)明的基因是當通過Southern印跡方法轉(zhuǎn)移并固定在硝酸纖維素膜上，然后42℃下在雜交緩沖液(50％甲酰胺，4×SSC，50mM HEPES(pH 7.0)，10×Denhardt’s溶液，和100μg/ml鮭魚精子DNA)中反應過夜時能形成雜交體的DNA。
此外，本發(fā)明還包括相應于上述DNA的RNA，或能夠在嚴格條件下與該RNA雜交，并且編碼具有螨變應原活性的蛋白的RNA。
可以通過將本發(fā)明的基因連接(插入)到合適的載體中而獲得本發(fā)明的重組載體。用于插入本發(fā)明的基因的載體不是特別限定的，只要它們能夠在諸如細菌、酵母或動物細胞的宿主中復制。所述載體的實例包括質(zhì)粒DNA和噬菌體DNA。用于構(gòu)建表達載體的載體DNA是廣泛普及并且容易獲得的。所述載體DNA的實例包括pUC19和pTV118 N(由Takara Shuzo生產(chǎn))、pUEX2(由Amersham生產(chǎn))、pGEX-4T，和pKK233-2(由Pharmacia生產(chǎn))，以及pMAM-neo(由Clontech生產(chǎn))。
構(gòu)建本發(fā)明的所述表達載體的方法并不受到特別的限制，并且可以根據(jù)標準方法進行。例如，可以將EcoR I消化的螨變應原cDNA片段插入質(zhì)粒pUC19多克隆位點中的EcoR I位點。此外，可以將該片段連接于質(zhì)粒載體pGEX-4T的EcoR I位點，使得能夠獲得表達載體。
用本發(fā)明的所述表達載體轉(zhuǎn)化的細菌、酵母或動物細胞不受特別的限制，只要它們能夠表達本發(fā)明的基因。所述細菌的實例包括大腸桿菌和枯草芽孢桿菌。所述酵母的實例包括啤酒糖酵母等。所述動物細胞的實例包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、Sf21和Sf9細胞，它們是Mamestra brassicae卵巢細胞、猴COS細胞和小鼠成纖維細胞。
本發(fā)明的重組螨變應原的實例包括直接表達的螨變應原和表達為與其它蛋白的融合蛋白的那些。下文中，所述融合蛋白稱作融合重組螨變應原。形成所述融合蛋白的其它蛋白的實例包括，但不特別限定于β-半乳糖苷酶、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、蛋白A和麥芽糖結(jié)合蛋白。
本發(fā)明的重組螨變應原也可是僅僅由對變應原活性關(guān)鍵的區(qū)域組成的肽片段或包含對變應原活性關(guān)鍵的區(qū)域的肽片段。此外，除了通過表達單獨的螨變應原蛋白獲得的產(chǎn)物，可以通過除去其它蛋白，從表達為融合蛋白的產(chǎn)物獲得所述重組螨變應原。
具體地，通過表達來源于螨體的基因獲得本發(fā)明的重組螨變應原，它是具有螨變應原活性的蛋白。此處，“具有螨變應原活性”是指能夠在哺乳動物中誘導變態(tài)反應。
可以通過以下方法生產(chǎn)本發(fā)明的螨變應原。在完成上述轉(zhuǎn)化株的培養(yǎng)后，收獲微生物體，懸浮于含有多種蛋白酶抑制劑的緩沖液中，然后通過超聲處理進行破碎。用含有諸如苯基甲磺酰氟、一碘乙酸、抑胃酶肽A或乙二胺四乙酸的蛋白酶抑制劑和諸如十二烷基硫酸鈉(SDS)、triton X-100或Nonidet P40的表面活性劑的緩沖液提取細胞碎屑中的定位于膜的蛋白。通過采用固定的谷胱甘肽的親和層析、采用固定的抗螨抗體的親和層析等，純化從提取物或培養(yǎng)物濃度物獲得的由螨變應原和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶組成的融合蛋白。此外，固定了谷胱甘肽的載體是由Pharmacia生產(chǎn)的載體。此外，固定了抗螨抗體的載體是通過將兔抗螨抗體與活化的Tresyl載體(如，Tresyl GM凝膠(由Kurita Water Industries生產(chǎn))，Tresyl Toyopearl(由Tosoh生產(chǎn))和Tresyl sepharose(由Pharmacia生產(chǎn)))共價結(jié)合而制備的載體。此外，可以獲得由螨變應原和His標志(如6×His)組成的融合蛋白，然后用固定了金屬的親和珠等進行純化。
用蛋白酶消化純化的融合重組螨變應原，然后通過單個或組合的公知純化方法進行分級分離，同時用ELISA和螨變態(tài)反應性疾病患者的白細胞組胺釋放測定(Allergy 37，725(1988))進行監(jiān)測，所述純化方法包括凝膠過濾層析、超濾、離子交換層析、親和層析、疏水層析、層析聚焦、等電聚集法和凝膠電源法。
本發(fā)明還包括含有螨變應原作為活性成分的螨變態(tài)反應性疾病治療劑。所述治療劑用作多種類型的螨變態(tài)反應性疾病的治療劑。此處，“螨變態(tài)反應性疾病”包括所有由螨特異性抗原導致的變態(tài)反應性疾病，如特應性支氣管哮喘、變態(tài)反應性鼻炎、變態(tài)反應性結(jié)膜炎和特應性皮炎。
可以通過例如以下方法制備本發(fā)明的螨變態(tài)反應性疾病的治療劑干燥通過上述方法純化的重組螨變應原或其片段肽，收獲粉末形式的所述變應原或片段肽，然后制備螨變態(tài)反應性疾病的治療性脫敏劑。但是，該方法不特別限于此。當將本發(fā)明的螨變態(tài)反應性疾病的治療劑用作治療性脫敏劑時，可以直接使用該試劑，或如果必要，用作通過標準方法提供的與通常使用的佐劑和多種添加劑的聯(lián)合藥物，所述佐劑和多種添加劑如穩(wěn)定劑、附形劑、增溶劑、乳化劑、緩沖劑、潤滑劑、防腐劑和著色劑。例如，將粉末形式的純化的重組螨變應原溶解于補加了苯酚的生理鹽水中，然后用作抗原的儲液，用于脫敏治療。
可以通過常規(guī)施用途徑，如經(jīng)皮、口服、皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi)和腹膜內(nèi)施用方法施用本發(fā)明的螨變態(tài)反應性疾病的治療劑。此外，本發(fā)明的治療劑也可以用于經(jīng)皮或經(jīng)粘膜藥物，如錠劑、舌下含片、滴眼液、鼻內(nèi)噴霧劑、泥敷劑、乳膏和洗劑。此外，施用本發(fā)明的螨變態(tài)反應性疾病的治療劑的劑量和施用次數(shù)可以根據(jù)施用途徑、癥狀等進行合適的選擇，使得對于成人，劑量在每次施用大約20μg或更少的范圍內(nèi)。每周一次或幾次進行施用。
此外，本發(fā)明的螨變態(tài)反應性治療劑不僅用作抗螨變態(tài)反應性疾病的治療劑，也可以用作抗該疾病的預防劑。此外，本發(fā)明的螨變態(tài)反應性疾病治療劑可以安全用于人體，而不產(chǎn)生過敏誘導作用。
本發(fā)明的螨變態(tài)反應性診斷劑用作診斷抗螨變態(tài)反應性疾病的皮內(nèi)反應的試劑或診斷螨變態(tài)反應的滴定劑。當將診斷劑用作診斷皮內(nèi)反應的診斷劑時，通過制備通過根據(jù)標準方法的上述方法純化的重組螨變應原或其片段肽而獲得該試劑。例如，將重組螨變應原干燥并制成粉末，將粉末溶解并稀釋于含有苯酚的生理鹽水，然后使用。采用診斷劑作為診斷皮內(nèi)反應的試劑的方法是根據(jù)標準方法使用的。
此外，當將診斷劑用作診斷螨變態(tài)反應的滴定劑時，類似地通過標準方法制備該試劑。例如，將重組螨變應原或其片段肽合適地溶解并稀釋于Hank’s緩沖液，將得到的溶液用作組胺釋放滴定試劑。該方法通常是通過以下程序進行的。具體地，將螨變態(tài)反應性疾病患者的血液或通過離心從患者血液獲得的血細胞級份懸浮于緩沖液中。用重組螨變應原作為滴定劑，對固定量的血細胞懸浮液進行滴定。用HPLC測量通過變應原刺激從嗜堿性細胞釋放的組胺量[Allergy 37，725(1988)]。
在組胺釋放滴定中，基于最大釋放量的50％(滴定曲線的反曲點)確定組胺的釋放量。具體地，該滴定的特征在于(1)根據(jù)血細胞懸浮液的滴度直接測量患者的變應原敏感性；和(2)在將血漿與重組螨變應原預反應后，通過用反應溶液對血細胞進行滴定獲得的值(血液滴定曲線值)通常高于通過用重組螨變應原對血細胞懸浮液進行滴定獲得的值(血細胞懸浮液滴定曲線值)。這是由于血漿中能夠中和變應原的IgG抗體(封閉抗體)的存在。因此，可以根據(jù)血液滴定曲線從血細胞懸浮液滴定曲線偏移的程度獲得封閉抗體滴度。變應原敏感性和該封閉抗體滴度使得能夠?qū)崿F(xiàn)準確的螨變態(tài)反應診斷。該組胺釋放滴定測試也可以用于監(jiān)測脫敏治療的效果。
本發(fā)明也包括抗本發(fā)明的螨變應原的抗體或其片段肽。所述抗體可以通過公知方法作為多克隆抗體或單克隆抗體獲得。所述抗體可以用于測量屋塵中螨變應原的存在、不存在等。所述測量可以用公知的免疫學方法如ELISA進行。在所述測量后，從屋塵中提取蛋白，然后測量。
此外，表達了本發(fā)明的重組螨變應原蛋白。通過用如此表達的重組蛋白進行測試，如特異性IgE反應測試或用螨變態(tài)反應患者狗進行的皮內(nèi)反應測試，可以證實本發(fā)明的螨變應原蛋白的變應原蛋白功能。
將在下面的實施例中進一步描述本發(fā)明。這些實施例不意欲限制本發(fā)明的范圍。
此外，除非特別指出相反的意思，用于每個實施例的試劑是從Nacalai Tesque，Wako Pure Chemical Industries，Sigma，Difco等購買的商業(yè)化試劑。此外，用于基因工程的試劑，如限制酶，是從Takara Shuzo，Toyobo，Invitrogen等購買的，然后根據(jù)制造商的說明書進行使用。
建立IgE檢測系統(tǒng)通過PCR擴增狗高親和力IgE受體α鏈(FcεRIα)cDNA的細胞外區(qū)，排除其信號肽位點，并且加入了限制酶EcoR I和Xho I位點。用T4-DNA連接酶將所得物連接到大腸桿菌表達質(zhì)粒載體pGEX4T-1(由Amersham Biosciences生產(chǎn))的EcoR I和Xho I位點。用由此獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10菌株(由Invitrogen生產(chǎn))。在含有氨芐青霉素(100μg/mL)的LB培養(yǎng)基中將轉(zhuǎn)化的菌株37℃下培養(yǎng)過夜。隨后，在新的LB培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)小量菌株，直到600nm處的OD值達到1.0。隨后，添加IPTG(異丙基-1-硫-β-D-半乳糖苷)，達到1mM的終濃度。3小時后，收獲細胞，然后用PBS(pH 7.4)清洗一次。通過在PBS(pH 7.4)中超聲處理而裂解再次收獲的細胞，通過離心除去不溶的級份，然后收集含有與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)融合的狗FcεRIα的可溶級份。隨后，用谷胱甘肽瓊脂糖凝膠4B柱(由Amersham Biosciences生產(chǎn))從可溶級份獲得與GST融合的狗FcεRIα。從10升培養(yǎng)溶液獲得1.0mg融合蛋白(GST-FcεRIα)。證實了獲得的純化GST-FcεRIα在SDS-PAGE后顯示出單個45kDa的條帶(圖1)。將重組的狗IgE(由BETHYL生產(chǎn))和純化的狗IgG固定在免疫板(由Nalge NuncInternational生產(chǎn))上，采用從1.0μg，0.1μg，0.05μg，0.025μg，0.0125μg，以及然后0.00625μg的2倍系列稀釋，以便證實純化的GST-FcεRIα的反應性。證實了純化的GST-FcεRIα與IgE反應，但不與IgG反應(圖2)。將從粉塵螨提取的4.0μg抗原(由GREER生產(chǎn))固定在免疫板(由Nalge Nunc International生產(chǎn))上。使粉塵螨陽性狗血清(通過用生理鹽水稀釋50倍的粉塵螨抗原溶液(由GREER生產(chǎn))進行皮內(nèi)反應證實為粉塵螨陽性的狗血清)與抗原反應。然后加入生物素標記的GST-FcεRIα。此外，基于添加過氧化物酶偶聯(lián)的鏈親和素(由Jackson Immuno Research生產(chǎn))和底物導致的顯色反應，證實了GST-FcεRIα鏈識別螨變應原特異性IgE(圖2)。此外，將從粉塵螨提取的4.0μg抗原(由GREER生產(chǎn))固定在免疫板(由Nalge NuncInternational生產(chǎn))上。使通過用提取自粉塵螨的抗原免疫而獲得的狗血清與抗原反應。證實GST-FcεRIα不與56℃下熱處理1小時的粉塵螨陽性狗血清反應，也不與純化的狗IgG反應，但與重組的狗IgE(由BETHYL生產(chǎn))反應。認為GST-FcεRIα識別變應原特異性IgE(圖3)。在圖3中，“-”表示血清沒有在56℃下處理1小時，“+”表示血清在56℃下處理1小時，“cont.”表示未免疫的血清。
通過Western印跡分析螨的主要變應原用8只狗的血清和血漿樣品進行Western印跡分析。這8只狗發(fā)生了特應性皮炎，并且診斷患有螨變態(tài)反應，該診斷是基于用從粉塵螨變應原(由GREER生產(chǎn))提取的抗原溶液進行的皮內(nèi)反應和采用實施例1中產(chǎn)生的重組狗FcεRIα鏈進行的ELISA法。將β-巰基乙醇加入從粉塵螨提取的抗原的100.0μg溶液，達到50.0μL/mL的終濃度。加入200μL由此制備的Laemmli樣品緩沖液(由BIO-RAD生產(chǎn))，然后100℃下熱處理5分鐘。將所得物加樣到凝膠濃度為5％-20％的聚丙烯酰胺凝膠(PAGEL；由ATTO生產(chǎn))上，然后進行電泳。完成電泳后，將所得物轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Hybond-P；由Amersham Biosciences生產(chǎn))。使膜在封閉溶液(補加了5％脫脂奶的PBST(通過將Tween20添加到PBS中達到0.1％的終濃度而制備))中4℃下靜置過夜。在PBST中將膜清洗10分鐘，在封閉溶液中將每份狗血清或血漿樣品稀釋10倍。將每個稀釋的溶液樣品加入到膜，然后在室溫下反應3小時。用PBST清洗3次(每次10分鐘)。用封閉溶液稀釋生物素標記的狗FcεRIα，然后將稀釋的溶液加入膜，隨后在室溫下反應2小時。用PBST清洗3次(每次10分鐘)，將用PBST稀釋10,000倍的鏈親和素-HRP偶聯(lián)物(由Amersham Biosciences生產(chǎn))加入膜，然后室溫下反應1小時。用PBST清洗5次(每次10分鐘)后，將ECL Plus Western印跡檢測系統(tǒng)(由Amersham Biosciences生產(chǎn))的反應溶液加入到膜上，然后在室溫下反應5分鐘。然后，用X射線膜(Hyperfilm ECL；由Amersham Biosciences生產(chǎn))檢測信號。結(jié)果，在相應于分子量150kDa的條帶和相應于分子量250kDa的條帶之間檢測到了表現(xiàn)強反應的蛋白(圖4)。在圖4中，用箭頭表示的條帶相應于表現(xiàn)出強反應，并且分子量為150kDa-250kDa的蛋白。在圖4中，從1-8的數(shù)字分別表示8只狗，“ct.”表示陰性血清。
通過2-D(二維)電泳分析螨變應原蛋白通過2-D(二維)電泳分離與IgE強反應的分子量為150kDa-250kDa的變應原蛋白。用Protean IEF細胞(由BIO-RAD生產(chǎn))進行2-D(二維)電泳。將1.0mg從粉塵螨提取的抗原(由GREER生產(chǎn))溶解于1.0mL的膨脹緩沖液(2-D起始試劑盒；由BIO-RAD生產(chǎn))。在活性條件下(50V，20℃和12小時)用17cm長的IPG Ready strip凝膠(pH 4-7；由BIO-RAD生產(chǎn))和聚焦盤使300μL由此獲得的溶液膨脹。膨脹后，在以下條件下進行聚焦。首先，在步驟1(250V，20分鐘，20℃)進行除去過量鹽的程序。在步驟2，電壓從250V升高到10,000V，共6小時。在步驟3，用10,000V的電壓和總共60,000VH的電壓時進行聚集。在2-D(二維)電泳前，用SDS-PAGE平衡緩沖液I(6M尿素，0.375MTris pH 8.8，2％SDS，20％甘油，和2％(w/v)DTT；由BIO-RAD生產(chǎn))將IPG ready strip凝膠輕柔振蕩10分鐘。隨后，用SDS-PAGE平衡緩沖液II(6M尿素，0.375M Tris pH 8.8，2％SDS，20％甘油，和2.5％(w/v)碘乙酰胺；由BIO-RAD生產(chǎn))進一步將凝膠輕柔振蕩10分鐘，從而進行平衡。用1％(v/w)低熔點瓊脂糖(由BIO-RAD生產(chǎn))將平衡的IPGready strip凝膠緊密附著于PII ready凝膠(8-16％；由BIO-RAD生產(chǎn))。用40mA的恒定電流(起始電壓是135V，最終電壓是400V)電泳大約3小時。電泳后，用Bio-Safe(由BIO-RAD生產(chǎn))對凝膠染色，由此可以對蛋白斑點進行圖樣分析(圖5)。
通過Western印跡分析而鑒定變應原斑點
2-D(二維)電泳后，將蛋白斑點轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Hybond-P；由Amersham Biosciences生產(chǎn))。使膜在封閉溶液(補加了5％脫脂奶的PBST(通過將Tween20添加到PBS中達到0.1％的終濃度而制備))中4℃下靜置過夜。在PBST中將膜清洗10分鐘，在封閉溶液中將狗血清或血漿樣品稀釋10倍。將由此稀釋的溶液加入到膜，然后在室溫下反應3小時。用PBST清洗3次(每次10分鐘)，用封閉溶液稀釋生物素標記的狗FcεRIα。將稀釋的生物素標記的狗FcεRIα加入膜，隨后在室溫下反應2小時。用PBST清洗3次(每次10分鐘)，將用PBST稀釋10,000倍的鏈親和素-HRP偶聯(lián)物(由Amersham Biosciences生產(chǎn))加入膜。室溫下反應1小時。用PBST清洗5次(每次10分鐘)后，將ECL Plus Western印跡檢測系統(tǒng)(由Amersham Biosciences生產(chǎn))的反應溶液加入到膜上，然后在室溫下反應5分鐘。用X射線膜(Hyperfilm ECL；由Amersham Biosciences生產(chǎn))檢測信號。結(jié)果，在pH約4.5，在相應于分子量150kDa的條帶和相應于分子量250kDa的條帶之間檢測到了表現(xiàn)強反應的斑點。由此，獲得了相應于本發(fā)明的變應原蛋白(Zen1)的斑點(圖6)。在圖6中左上圖6-1顯示了粉塵螨的2-D(二維)電泳圖樣(pH 4-7)；右上圖6-2顯示了用發(fā)生特應性皮炎的狗患者的粉塵螨陽性血清進行的Western印跡分析(pH 4-7)的結(jié)果；左下圖6-3顯示了粉塵螨的2-D(二維)電泳圖樣(pH 3.9-5.1)；右下圖6-4顯示了與2-D(二維)電泳圖樣相比，用發(fā)生特應性皮炎的狗患者的粉塵螨陽性血清進行的Western印跡分析(pH 3.9-5.1)獲得的反應斑點(斑點在圖的上部表現(xiàn)為黑色的圓形斑點，并且用箭頭表示)。用箭頭表示的斑點觀察到了強反應。
Zen1蛋白的蛋白組分析從凝膠上切下通過2-D(二維)電泳分離的Zen1蛋白斑點，然后進行MS/MS分析?？梢垣@得大量MS/MS數(shù)據(jù)，但是沒有證實任何命中。對5種認為是新蛋白的肽進行了從頭測序法，由此確定了氨基酸序列(SEQ ID NOS3-7)(表1)。對這些氨基酸序列進行了BLAST檢索，但沒有獲得明確的命中。
表1
通過從頭測序法確定的Zen1的部分氨基酸序列[實施例6]Zen1蛋白的肽作圖分析從凝膠上切下通過2-D(二維)電泳分離的Zen1蛋白斑點。制備肽圖譜，然后進行8個峰的氨基酸測序。結(jié)果，確定了11個氨基酸片段的序列(SEQ ID NOS8-18)(表2)。進行了BLAST檢索，但沒有獲得明確的命中。
表2
通過Zen1的肽作圖獲得的相應于峰的氨基酸序列[實施例7]分析Zen1蛋白的N-末端氨基酸序列從凝膠上切下通過2-D(二維)電泳分離的Zen1蛋白斑點。采用HP G1005A蛋白測序系統(tǒng)，通過標準方法確定Zen1蛋白的N-末端氨基酸序列(SEQ ID NO19)(表3)。對序列進行了BLAST檢索，但沒有獲得明確的命中。
表3
Zen1 N-末端氨基酸序列[實施例8]提取螨總RNA和分離螨poly(A)mRNA根據(jù)標準方法通過培養(yǎng)和生長粉塵螨而獲得的未處理的螨體置于大約2.0L飽和鹽溶液中。充分攪拌溶液，然后靜置30分鐘。用粗濾器撇出上清液中的螨體，用生理鹽水清洗，然后干燥。將1.0g螨體進行總RNA提取，用FastTrack 2.0試劑盒(由Invitrogen生產(chǎn))，根據(jù)試劑盒的手冊分離螨poly(A)mRNA。
合成螨cDNA用100ng實施例8中分離的螨poly(A)mRNA作為模板，并且采用cDNA合成試劑盒(ReverTraAce-α-；由Toyobo生產(chǎn))，根據(jù)試劑盒的手冊進行逆轉(zhuǎn)錄反應。
通過PCR擴增Zen1基因根據(jù)Zen1蛋白的N-末端氨基酸序列，將引物N-1(5’-GAYGAYGTNTTRAARCARACNGARGAR-3’(SEQ ID NO20)Y＝C或T，N＝A或C或G或T，并且R＝A或G)和N-2(5’-GAY GAYGTN CTN AAR CAR ACN GAR GAR-3’(SEQ ID NO21)Y＝C或T，N＝A或C或G或T，并且R＝A或G)設(shè)計為有義引物。此外，根據(jù)作為反向引物的通過從頭測序方法獲得的氨基酸序列(表4)，設(shè)計12個引物(SEQ ID NOS22-33)。采用作為模板的1.0μg實施例9中合成的螨cDNA、Ex taq聚合酶(由TaKaRa Bio生產(chǎn))和根據(jù)手冊制備的每個樣品，在94℃下進行熱變性處理2分鐘，并且進行35個循環(huán)的反應，每個循環(huán)由94℃下1分鐘，65℃下2分鐘，和72℃下3分鐘組成。在72℃下進行9分鐘的進一步反應后，在4℃儲存樣品。當用反向引物415-4(5’-RTTNAGNAGRTCYTTNGCRTCYTT-3’(SEQ ID NO25)N＝A或C或G或T，R＝A或G，并且Y＝C或T)進行PCR時，獲得了大約1,000bp的DNA片段。當用491-2(5’-RTT RTC NGC NAG RTCYTT RTT-3’(SEQ ID NO29)N＝A或C或G或T，R＝A或G，并且Y＝C或T)進行PCR時，獲得了大約880bp的DNA片段。
表4
合成用于擴增Zen1基因的混合引物序列。當用N-1和415-4進行PCR時，獲得了大約1000bp的片段。當用N-1和491-2進行PCR時，獲得了大約880bp的片段。
N＝A或C或G或T，R＝A或G，Y＝C或T[實施例11]克隆Zen1基因從瓊脂糖凝膠(SUPREC-01，由TaKaRa生產(chǎn))收集用實施例10中的引物N-1和415-4擴增的DNA片段。用T4 DNA連接酶將DNA片段連接到pGEM-T Easy載體(由Promega生產(chǎn))的克隆位點，從而轉(zhuǎn)化宿主大腸桿菌TOP10(由Invitrogen生產(chǎn))。具體地，混合大腸桿菌感受態(tài)細胞和質(zhì)粒，然后在冰上對混合物進行溫度處理大約30分鐘，42℃下30秒，然后在冰上2分鐘。然后將所得物懸浮于SOC培養(yǎng)基(2％Trypton，0.5％酵母提取物，0.05％ NaCl，10mM MgCl2，10mMMgSO4，和20mM葡萄糖)，然后37℃下溫育1小時。隨后，在補加了50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基(1％酵母提取物，0.5％ trypton和1％ NaCl)上37℃下將轉(zhuǎn)化的大腸桿菌培養(yǎng)過夜，從而獲得大腸桿菌菌落。選擇認為含有插入的片段的白色克隆。在補加了50μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)克隆過夜。用GFX(商標)Micro PlasmidPrep試劑盒(由Amersham Bioscience生產(chǎn))純化質(zhì)粒DNA。用染料引物循環(huán)測序試劑盒(由Amersham生產(chǎn))進行測序反應，然后用熒光DNA測序儀(由Shimadzu Corporation生產(chǎn))進行核苷酸序列分析。此外，當發(fā)現(xiàn)3個克隆的核苷酸序列在其核苷酸序列分析時完全匹配時，進行最終的確定(圖7-1和圖7-2)。
分析Zen1基因用Genetyx-win ver.6軟件(由Software Development生產(chǎn))分析實施例11中克隆的Zen1基因。堿基的數(shù)目是1020bp，氨基酸殘基的數(shù)目是340(圖7-1，圖7-2，和SEQ ID NOS1和2)。對基因的核苷酸序列和氨基酸序列進行了BLAST檢索，但是沒有獲得明確的命中。Zen1基因被認為是新基因。
分離全長Zen1 cDNA通過RACE(cDNA末端的快速擴增)法分離全長cDNA。采用SV總RNA分離試劑盒(由Promega生產(chǎn))，從實施例8中使用的螨體提取總RNA。用GeneRacer(商標)試劑盒，根據(jù)試劑盒的手冊制備RACE的模板。此外，基于實施例12中獲得的Zen1部分序列，合成了第一輪PCR和嵌套式PCR的引物，用于擴增5’和3’末端(表5)。5’和3’末端的擴增反應按如下進行。在1.0μL根據(jù)上文制備的RACE模板中加入包含在GeneRacer(商標)試劑盒中的5’和3’引物各3.0μL，1.0μLdNTP混合物溶液(各10mM)，包含在Advantage cDNA聚合酶混合物(由CLONTECH生產(chǎn))中的5.0μl 10×cDNA PCR反應緩沖液，1.0μLAdvantage cDNA聚合酶混合物，和按上文所述合成并且調(diào)節(jié)在10μM的第一輪PCR的基因特異性引物各1.0μL。然后用無菌蒸餾水將得到的溶液的體積調(diào)節(jié)到50.0μL。用Touchdown PCR法進行基因擴增。制備的樣品溶液在94℃下熱變性1分鐘，進行5輪反應，每輪由94℃下30秒和72℃下4分鐘組成，進行5輪反應，每輪由94℃下30秒和70℃下4分鐘組成，進行25輪最終反應，每輪由94℃下30秒和68℃下4分鐘組成，然后在4℃下儲存。完成第一輪PCR后，向5’和3’末端擴增反應溶液各1.0mL中加入包含在GeneRaeer(商標)試劑盒中的嵌套式PCR的5’引物和3’引物各1.0μL，1.0μL dNTP混合物溶液(各10mM)，包含在Advantage cDNA聚合酶混合物(由CLONTECH生產(chǎn))中的5.0μl 10×cDNA PCR反應緩沖液，1.0μL Advantage cDNA聚合酶混合物，和按上文所述合成并且調(diào)節(jié)在10μM的第一輪PCR的基因特異性引物各1.0μL。然后用無菌蒸餾水將得到的溶液的體積調(diào)節(jié)到50.0μL。用上述Touchdown PCR法進行基因擴增。采用1.0％瓊脂糖凝膠，通過電泳證實由此獲得的擴增的5’和3’末端的片段。切下這些片段，然后收集(SUPREC-01，由TaKaRa生產(chǎn))。用T4 DNA連接酶將片段連接到pGEM-T Easy載體(由Promega生產(chǎn))的克隆位點，從而轉(zhuǎn)化宿主大腸桿菌TOP10(由Invitrogen生產(chǎn))。具體地，混合大腸桿菌感受態(tài)細胞和質(zhì)粒，然后在冰上對混合物進行溫度處理大約30分鐘，42℃下30秒，然后在冰上2分鐘。然后將所得物懸浮于SOC培養(yǎng)基(2％ Trypton，0.5％酵母提取物，0.05％ NaCl，10mM MgCl2，10mM MgSO4，和20mM葡萄糖)，然后37℃下溫育1小時。隨后，在補加了50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基(1％酵母提取物，0.5％trypton和1％ NaCl)上37℃下將轉(zhuǎn)化的大腸桿菌培養(yǎng)過夜，從而獲得大腸桿菌菌落。選擇認為含有插入的片段的白色克隆。在補加了50μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)克隆過夜。用GFX(Trademark)Micro Plasmid Prep試劑盒(由Amersham Bioscience生產(chǎn))純化質(zhì)粒DNA。用染料引物循環(huán)測序試劑盒(由Amersham生產(chǎn))進行測序反應，然后用熒光DNA測序儀(由Shimadzu Corporation生產(chǎn))進行核苷酸序列分析。此外，當發(fā)現(xiàn)3個克隆的核苷酸序列在其分析時完全匹配時，進行最終的確定。結(jié)果，可以確定Zen1的5’末端和3’末端的核苷酸序列(圖8-1-圖8-4，和SEQ ID NOS34和35)。
表5
(從上到下，SEQ ID NOS36、37、38和39)用于RACE法的引物及其序列[實施例14]純化重組Zen1通過PCR擴增實施例13獲得的、添加了限制酶BamHI和XhoI位點的Zen1 cDNA。用T4-DNA連接酶將擴增產(chǎn)物連接到大腸桿菌表達質(zhì)粒載體pGEX4T-1(由Amersham Biosciences生產(chǎn))的EcoR I和Xho I位點。用由此獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10菌株(由Invitrogen生產(chǎn))。在含有100μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中將轉(zhuǎn)化的菌株37℃下培養(yǎng)過夜。隨后，在新的LB培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)小量菌株，直到600nm處的OD值達到1.0。添加IPTG(異丙基-1-硫-β-D-半乳糖苷)，達到1mM的終濃度。3小時后，收獲細胞，然后用PBS(pH7.4)清洗一次。通過在PBS(pH 7.4)中超聲處理而裂解再次收獲的細胞，通過離心除去不溶的級份，然后收集含有與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)融合的Zen1的可溶級份。隨后，用谷胱甘肽瓊脂糖凝膠4B柱(由Amersham Biosciences生產(chǎn))從可溶級份獲得與GST融合的Zen1。將含量為融合蛋白的1/100的凝血酶(由Amersham Biosciences生產(chǎn))加入含有純化的融合產(chǎn)物(即，融合于GST的Zen1)的溶液，然后在22℃下反應20小時。由此，GST從Zen1分離。隨后，用Benzamidin瓊脂糖凝膠(由Amersham Biosciences生產(chǎn))除去凝血酶，然后純化重組的Zen1。由此獲得的純化的Zen1表現(xiàn)出相應于分子量為大約60kDa的單個條帶，這是通過SDS-PAGE證實的(圖9)。
制備抗Zen1多克隆抗體和分析抗體與螨蛋白的反應性以1周的間隔用實施例14純化的重組Zen1免疫6只小鼠(BALB/c，雌性，4周齡)5次。隨后，從小鼠采集血液，分離血清，然后通過ELISA分析IgG抗體的反應。按如下進行ELISA。將1.0μg重組Zen1和4.0μg從粉塵螨提取的抗原(由GREER生產(chǎn))分別固定在免疫板(由NalgeNunc International生產(chǎn))上，然后在37℃下用封閉溶液(通過將Tween20加入補加了10％ FBS的PBS中達到0.05％的終濃度而制備)封閉1小時。用封閉溶液將每個小鼠血清樣品稀釋1000倍，然后在室溫下反應1小時。清洗每個免疫板后，使其與用封閉溶液稀釋2000倍的HRP標記的山羊抗小鼠IgG單克隆抗體(由ZYMED生產(chǎn))反應。清洗每個免疫板后，將100μL酶底物溶液(ABTS溶液)加入每個孔，然后在37℃下反應10分鐘。通過向每個孔中加入100μL 0.32％的氟化鈉溶液而終止酶反應。用免疫讀數(shù)器(BioRad)測量414nm處每個孔的吸光度。用ELISA證實IgG與相關(guān)受試物的反應后，確定受試物是抗Zen1的多克隆抗體。
通過Western印跡分析小鼠IgG與多克隆抗體(重組Zen1)的反應性和關(guān)于螨體的該反應性。將β-巰基乙醇加入100.0μL調(diào)節(jié)到50μg/mL的重組Zen1蛋白溶液和100.0μL從粉塵螨提取的抗原的溶液，達到50.0μL/mL的終濃度，由此制備200μL Laemmli樣品緩沖液(由BIO-RAD生產(chǎn))。100℃下熱處理5分鐘，然后將所得物加樣到凝膠濃度為5％-20％的聚丙烯酰胺凝膠(PAGEL；由ATTO生產(chǎn))上。由此進行電泳。完成電泳后，將所得物轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Hybond-P；由Amersham Biosciences生產(chǎn))。使膜在封閉溶液(補加了5％脫脂奶的PBST(通過將Tween20添加到PBS中達到0.1％的終濃度而制備))中4℃下靜置過夜。在PBST中將膜清洗10分鐘。用PBST將HRP標記的山羊抗小鼠IgG單克隆抗體(由ZYMED生產(chǎn))稀釋2000倍，然后將稀釋的溶液加入膜，隨后在室溫下反應2小時。用PBST清洗5次(每次10分鐘)后，將ECL Plus Western印跡檢測系統(tǒng)(由AmershamBiosciences生產(chǎn))的反應溶液加入到膜上，然后在室溫下反應5分鐘。用X射線膜(Hyperfilm ECL；由Amersham Biosciences生產(chǎn))檢測信號。結(jié)果，檢測到了表示與分子量為大約60kDa的重組Zen1反應的信號和表示與分子量為150kDa-250kDa的天然型Zen1反應的信號(圖10)。因此，證實了實施例13分離的全長Zen1 cDNA編碼分子量為150kDa-250kDa的螨體的所述變應原蛋白。
分析重組Zen1的IgE反應性通過ELISA評估實施例14中純化的重組Zen1的變應原性。將1.0μg重組Zen1固定在免疫板(由Nalge Nunc International K.K.生產(chǎn))上，然后在37℃下用封閉溶液(通過將Tween20加入補加了10％ FBS的PBS中達到0.05％的終濃度而制備)封閉1小時。使檢測的粉塵螨陽性的9只狗的血清(通過用生理鹽水稀釋50倍的粉塵螨抗原溶液(由GREER生產(chǎn))進行皮內(nèi)反應證實為粉塵螨陽性的狗血清)與陰性對照狗血清反應。加入生物素標記的GST-FcεRIα，然后，通過添加過氧化物酶偶聯(lián)的鏈親和素(由Jackson Immuno Research生產(chǎn))和酶底物溶液(ABTS溶液)導致顯色反應。通過向每個孔中加入100μL 0.32％的氟化鈉溶液而終止酶反應。用免疫讀數(shù)器(BioRad)測量414nm處每個孔的吸光度。具體地，用重組的狗FcεRIα，通過ELISA系統(tǒng)分析血清IgE(9只通過該程序的皮內(nèi)反應證實的測試為螨陽性的狗的血清，或陰性狗(對照)的血清)與重組Zen1的反應。結(jié)果，證實了高于陰性狗的值(用虛線表示)的值。因此，證實了重組Zen1是與IgE反應的變應原蛋白(圖11)。
工業(yè)實用性本發(fā)明使得能夠提供作為螨變態(tài)反應性疾病的治療劑或預防劑的安全和有效的重組螨變應原，其不含誘導過敏的雜質(zhì)。
在此全文引入在此引用的所有公開文獻作為參考。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解，本發(fā)明的多種修飾和改變在所附權(quán)利要求
公開的技術(shù)思想和發(fā)明范圍內(nèi)是可實現(xiàn)的。本發(fā)明意欲包括所述修飾和改變。
序列表<110>NIPPON ZENYAKU KOGYO LTD.
<120>新的螨變應原<130>PH-2409-PCT<150>JP2004-116089<151>2004-04-09<160>39<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1022<212>DNA<213>粉塵螨<220>
<221>CDS<222>(1)..(1020)<400>1gac gat gta tta aag cag act gag gag cct att aaa agt gcc cag gat 48Asp Asp Val Leu Lys Gln Thr Glu Glu Pro Ile Lys Ser Ala Gln Asp1 5 10 15gta ttg gaa aag ttg ccc gat tca gat ttg aaa gat gaa atc gca gaa 96Val Leu Glu Lys Leu Pro Asp Set Asp Leu Lys Asp Glu Ile Ala Glu20 25 30aaa ctg gca acc atg aag cat tac aaa cat aag tta gaa aat gca aaa 144Lys Leu Ala Thr Met Lys His Tyr Lys His Lys Leu Glu Asn Ala Lys35 40 45aat cca atc aaa atc gcc cat ttt gaa ttg gaa ttg ttg aca atg ttc 192Asn Pro Ile Lys Ile Ala His Phe Glu Leu Glu Leu Leu Thr Met Phe50 55 60aaa aag ttc caa tca tta ttg aac gaa gct aat gaa att atc aaa tcc 240Lys Lys Phe Gln Ser Leu Leu Asn Glu Ala Asn Glu Ile Ile Lys Ser65 70 75 80ttg aca acc aca aca acg gaa ccg aca acc cca act cct gaa cca aca 288Leu Thr Thr Thr Thr Thr Glu Pro Thr Thr Pro Thr Pro Glu Pro Thr85 90 95
aca aca act cct gaa ccg act acc aaa acc ccc gaa ccg act acc aaa 336Thr Thr Thr Pro Glu Pro Thr Thr Lys Thr Pro Glu Pro Thr Thr Lys100 105 110aca ccg gaa cca aca aca cca act cct gaa ccg act acc aaa acc ccc 384Thr Pro Glu Pro Thr Thr Pro Thr Pro Glu Pro Thr Thr Lys Thr Pro115 120 125gaa ccg act acc aaa aca ccg gaa cca aca aca cca act cca gaa ccg 432Glu Pro Thr Thr Lys Thr Pro Glu Pro Thr Thr Pro Thr Pro Glu Pro130 135 140act acc aaa aca ccg gaa cca aca aca cca act cct gaa ccg act acc 480Thr Thr Lys Thr Pro Glu Pro Thr Thr Pro Thr Pro Glu Pro Thr Thr145 150 155 160aaa acc ccc gaa ccg act acc aaa aca cct gaa cca tcc acc cca act 528Lys Thr Pro Glu Pro Thr Thr Lys Thr Pro Glu Pro Ser Thr Pro Thr165 170 175ccg gac cgc tac caa aac ccc cga ccg cta cca aaa cac cgg acc atc 576Pro Asp Arg Tyr Gln Asn Pro Arg Pro Leu Pro Lys His Arg Thr Ile180 185 190cac ccc aac tcc gga ccg act acc aaa aca cct gaa cca tcc act cca 624His Pro Asn Set Gly Pro Thr Thr Lys Thr Pro Glu Pro Ser Thr Pro195 200 205act ccg gaa ccg act acc aaa acc ccc gaa ccg act acc aaa aca ccg 672Thr Pro Glu Pro Thr Thr Lys Thr Pro Glu Pro Thr Thr Lys Thr Pro210 215 220gaa cca tca acc cca act ccg gaa ccg act acc aaa aca ccg gaa cca 720Glu Pro Ser Thr Pro Thr Pro Glu Pro Thr Thr Lys Thr Pro Glu Pro225 230 235 240tca acc cca act ccg gaa ccg act acc aaa aca ccg gaa cca tca acg 768Ser Thr Pro Thr Pro Glu Pro Thr Thr Lys Thr Pro Glu Pro Ser Thr245 250 255act aag aaa cct aat cgg gat gat gtt ttg aaa caa gct gaa gag ctt 816Thr Lys Lys Pro Asn Arg Asp Asp Val Leu Lys Gln Ala Glu Glu Leu260 265 270att aaa aga gcc gag gat gta ttt gaa aag ttg ccc gat tca gat ttg 864Ile Lys Arg Ala Glu Asp Val Phe Glu Lys Leu Pro Asp Ser Asp Leu275 280 285
aaa aat gaa atc gca gaa aaa ctg gca acc atg aag aat tac aaa cat 912Lys Asn Glu Ile Ala Glu Lys Leu Ala Thr Met Lys Asn Tyr Lys His290 295 300gag tta gaa aat gca aaa aat cca atc aaa atc gcc cat ctt gaa tcg 960Glu Leu Glu Asn Ala Lys Asn Pro Ile Lys Ile Ala His Leu Glu Ser305 310 315 320gaa ttg ttg aca atg ttc aaa atg ttc caa tca ttg tta aat gaa gcc 1008Glu Leu Leu Thr Met Phe Lys Met Phe Gln Ser Leu Leu Ash Glu Ala325 330 335aac gaa ctc ctg aa 1022Asn Glu Leu Leu340<210>2<211>340<212>PRT<213>粉塵螨<400>2Asp Asp Val Leu Lys Gln Thr Glu Glu Pro Ile Lys Ser Ala Gln Asp1 5 10 15Val Leu Glu Lys Leu Pro Asp Ser Asp Leu Lys Asp Glu Ile Ala Glu20 25 30Lys Leu Ala Thr Met Lys His Tyr Lys His Lys Leu Glu Asn Ala Lys35 40 45Asa Pro Ile Lys Ile Ala His Phe Glu Leu Glu Leu Leu Thr Met Phe50 55 60Lys Lys Phe Gln Ser Leu Leu Asn Glu Ala Asn Glu Ile Ile Lys Ser65 70 75 80Leu Thr Thr Thr Thr Thr Glu Pro Thr Thr Pro Thr Pro Glu Pro Thr85 90 95Thr Thr Thr Pro Glu Pro Thr Thr Lys Thr Pro Glu Pro Thr Thr Lys100 105 110Thr Pro Glu Pro Thr Thr Pro Thr Pro Glu Pro Thr Thr Lys Thr Pro115 120 125
Glu Pro Thr Thr Lys Thr Pro Glu Pro Thr Thr Pro Thr Pro Glu Pro130 135 140Thr Thr Lys Thr Pro Glu Pro Thr Thr Pro Thr Pro Glu Pro Thr Thr145 150 155 160Lys Thr Pro Glu Pro Thr Thr Lys Thr Pro Glu Pro Ser Thr Pro Thr165 170 175Pro Asp Arg Tyr Gln Asn Pro Arg Pro Leu Pro Lys His Arg Thr Ile180 185 190His Pro Asn Ser Gly Pro Thr Thr Lys Thr Pro Glu Pro Ser Thr Pro195 200 205Thr Pro Glu Pro Thr Thr Lys Thr Pro Glu Pro Thr Thr Lys Thr Pro210 215 220Glu Pro Ser Thr Pro Thr Pro Glu Pro Thr Thr Lys Thr Pro Glu Pro225 230 235 240Ser Thr Pro Thr Pro Glu Pro Thr Thr Lys Thr Pro Glu Pro Ser Thr245 250 255Thr Lys Lys Pro Asn Arg Asp Asp Val Leu Lys Gln Ala Glu Glu Leu260 265 270Ile Lys Arg Ala Glu Asp Val Phe Glu Lys Leu Pro Asp Ser Asp Leu275 280 285Lys Asn Glu Ile Ala Glu Lys Leu Ala Thr Met Lys Asn Tyr Lys His290 295 300Glu Leu Glu Asn Ala Lys Asn Pro Ile Lys Ile Ala His Leu Glu Ser305 310 315 320Glu Leu Leu Thr Met Phe Lys Met Phe Gln Ser Leu Leu Asn Glu Ala325 330 335Asn Glu Leu Leu340<210>3<211>13<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>人工序列說明合成肽<400>3Met Lys Ser Leu Leu Asn Glu Ala Asn Glu Leu Leu Lys1 5 10<210>4<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明合成肽<400>4Ser Ala Gln Asp Val Leu Glu Lys1 5<210>5<211>14<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明合成肽<400>5Phe Met Gln Ser Leu Leu Asn Glu Ala Asp Glu Leu Leu Arg1 5 10<210>6<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明合成肽<400>6Leu Pro Asp Ser Asp Leu Lys Asp Glu Leu Ala Lys1 5 10
<210>7<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明合成肽<400>7Leu Pro Asp Ser Asp Leu Lys Asn Glu Leu Ala Glu Lys1 5 10<210>8<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明合成肽<400>8Met Tyr Asn Phe His Leu Glu Ala Tyr1 5<210>9<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明合成肽<400>9Ile Ala His Phe Leu Glu Leu Glu1 5<210>10<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明合成肽<400>10
Ile Ala His Phe Glu Leu Glu1 5<210>11<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明合成肽<400>11Lys Phe Gln Ser Leu Leu Asn Glu Ala Asn1 5 10<210>12<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明合成肽<400>12Ile Ala His Leu Glu Ser Glu Thr1 5<210>13<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明合成肽<400>13Lys Phe Gln Ser Leu Leu Asn Glu Ala1 5<210>14<211>7<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>人工序列說明合成肽<400>14Asp Ala Gln Leu Glu Xaa Glu1 5<210>15<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明合成肽<400>15Ser Ala Gln Asp Val Ser Leu1 5<210>16<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明合成肽<400>16Arg Asn Glu Met Asn Glu1 5<210>17<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明合成肽<400>17Met Phe Gln Ser Leu Leu Asn Lys Ala Asp Phe Asp1 5 10<210>18
<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明合成肽<400>18Asp Leu Ala Arg Asp Val Xaa Leu1 5<210>19<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明合成肽<400>19Asp Asn Arg Asp Asp Val Leu Lys Gln Thr Glu Glu1 5 10<210>20<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物<220>
<221>修飾的堿基<222>9和21<223>n代表a，c，g或t<400>20gaygaygtnt traarcarac ngargar 27<210>21<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物<220>
<221>修飾的堿基<222>9，12和21<223>n代表a，c，g或t<400>21gaygaygtnc tnaarcarac ngargar 27<210>22<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物<220>
<221>修飾的堿基<222>16<223>n代表a，c，g或t<400>22rttraaraar tcyttngcrt cyttraa 27<210>23<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物<220>
<221>修飾的堿基<222>4和16<223>n代表a，c，g或t<400>23rttnagraar tcyttngcrt cytt 24<210>24<211>24<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物<220>
<221>修飾的堿基<222>7和16<223>n代表a，c，g或t<400>24rttraanagr tcyttngcrt cytt 24<210>25<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物<220>
<221>修飾的堿基<222>4，7和16<223>n代表a，c，g或t<400>25rttnagnagr tcyttngcrt cytt 24<210>26<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物<220>
<221>修飾的堿基<222>10和19<223>n代表a，c，g或t<400>26rttrtcraan acytcrtgng c 21
<210>27<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物<220>
<221>修飾的堿基<222>7，10和19<223>n代表a，c，g或t<400>27rttrtcnagn acytcrtgng c 21<210>28<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物<220>
<221>修飾的堿基<222>7<223>n代表a，c，g或t<400>28rttrtcngcr aartcyttrt t 21<210>29<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物<220>
<221>修飾的堿基<222>7和10<223>n代表a，c，g或t<400>29
rttrtcngcn agrtcyttrt t 21<210>30<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物<220>
<221>修飾的堿基<222>4<223>n代表a，c，g或t<400>30rttngcraar tcytcrttra aytc 24<210>31<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物<220>
<221>修飾的堿基<222>4和7<223>n代表a，c，g或t<400>31rttngcnagr tcytcrttra aytc 24<210>32<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物<220>
<221>修飾的堿基<222>4和19
<223>n代表a，c，g或t<400>32rttngcraar tcytcrttna gytc 24<210>33<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物<220>
<221>修飾的堿基<222>4，7和19<223>n代表a，c，g或t<400>33rttngcnagr tcytcrttna gytc 24<210>34<211>1518<212>DNA<213>粉塵螨<220>
<221>CDS<222>(1)..(1515)<400> 34atg aaa tta acc gct aca tta ctg ttg att cta aca ttg agt tgg gca 48Met Lys Leu Thr Ala Thr Leu Leu Leu Ile Leu Thr Leu Ser Trp Ala1 5 10 15ggt att ttc gtt gat gca aat cca cga ttc aaa cgt gat aat cgg gat 96Gly Ile Phe Val Asp Ala Asn Pro Arg Phe Lys Arg Asp Asn Arg Asp20 25 30gat gtt ttg aaa caa act gaa gag ctt att aaa agt gcc cag gat gta 144Asp Val Leu Lys Gln Thr Glu Glu Leu Ile Lys Ser Ala Gln Asp Val35 40 45ttg gaa aag ttg ccc gat tca gat ttg aaa gat gaa atc gca gaa aaa 192Leu Glu Lys Leu Pro Asp Ser Asp Leu Lys Asp Glu Ile Ala Glu Lys50 55 60
ctg gca acc atg aag cat tac aaa cat aag tta gaa aat gca aaa aat 240Leu Ala Thr Met Lys His Tyr Lys His Lys Leu Glu Asn Ala Lys Asn65 70 75 80cca atc aaa atc gcc cat ttt gaa ttg gaa ttg ttg aca atg ttc aaa 288Pro Ile Lys Ile Ala His Phe Glu Leu Glu Leu Leu Thr Met Phe Lys85 90 95aag ttc caa tca tta ttg aac gaa gct aat gaa att atc aaa tcc ttg 336Lys Phe Gln Ser Leu Leu Asn Glu Ala Asn Glu Ile Ile Lys Ser Leu100 105 110aca acc aca aca acg gaa ccg aca acc cca act cct gaa cca aca aca 384Thr Thr Thr Thr Thr Glu Pro Thr Thr Pro Thr Pro Glu Pro Thr Thr115 120 125aca act cct gaa ccg act acc aaa acc ccc gaa ccg act acc aaa aca 432Thr Thr Pro Glu Pro Thr Thr Lys Thr Pro Glu Pro Thr Thr Lys Thr130 135 140ccg gaa cca aca aca cca act cct gaa ccg act acc aaa acc ccc gaa 480Pro Glu Pro Thr Thr Pro Thr Pro Glu Pro Thr Thr Lys Thr Pro Glu145 150 155 160ccg act acc aaa aca ccg gaa cca aca aca cca act cca gaa ccg act 528Pro Thr Thr Lys Thr Pro Glu Pro Thr Thr Pro Thr Pro Glu Pro Thr165 170 175acc aaa aca ccg gaa cca aca aca cca act cct gaa ccg act acc aaa 576Thr Lys Thr Pro Glu Pro Thr Thr Pro Thr Pro Glu Pro Thr Thr Lys180 185 190acc ccc gaa ccg act acc aaa aca cct gaa cca tcc acc cca act ccg 624Thr Pro Glu Pro Thr Thr Lys Thr Pro Glu Pro Ser Thr Pro Thr Pro195 200 205gac cgc tac caa aac ccc cga ccg cta cca aaa cac cgg acc atc cac 672Asp Arg Tyr Gln Asn Pro Arg Pro Leu Pro Lys His Arg Thr Ile His210 215 220ccc aac tcc gga ccg act acc aaa aca cct gaa cca tcc act cca act 720Pro Asn Ser Gly Pro Thr Thr Lys Thr Pro Glu Pro Ser Thr Pro Thr225 230 235 240ccg gaa ccg act acc aaa acc ccc gaa ccg act acc aaa aca ccg gaa 768Pro Glu Pro Thr Thr Lys Thr Pro Glu Pro Thr Thr Lys Thr Pro Glu245 250 255
cca tca acc cca act ccg gaa ccg act acc aaa aca ccg gaa cca tca 816Pro Ser Thr Pro Thr Pro Glu Pro Thr Thr Lys Thr Pro Glu Pro Ser260 265 270acc cca act ccg gaa ccg act acc aaa aca ccg gaa cca tca acg act 864Thr Pro Thr Pro Glu Pro Thr Thr Lys Thr Pro Glu Pro Ser Thr Thr275 280 285aag aaa cct aat cgg gat gat gtt ttg aaa caa gct gaa gag ctt att 912Lys Lys Pro Asn Arg Asp Asp Val Leu Lys Gln Ala Glu Glu Leu Ile290 295 300aaa aga gcc gag gat gta ttt gaa aag ttg ccc gat tca gat ttg aaa 960Lys Arg Ala Glu Asp Val Phe Glu Lys Leu Pro Asp Ser Asp Leu Lys305 310 315 320aat gaa atc gca gaa aaa ctg gca acc atg aag aat tac aaa cat gag 1008Asn Glu Ile Ala Glu Lys Leu Ala Thr Met Lys Asn Tyr Lys His Glu325 330 335tta gaa aat gca aaa aat cca atc aaa atc gcc cat ctt gaa tcg gaa 1056Leu Glu Asn Ala Lys Asn Pro Ile Lys Ile Ala His Leu Glu Ser Glu340 345 350ttg ttg aca atg ttc aaa atg ttc caa tca ttg ttg aac gaa gct gat 1104Leu Leu Thr Met Phe Lys Met Phe Gln Ser Leu Leu Asn Glu Ala Asp355 360 365gaa att atc aga tcc ttg aca act acg acg gaa ccg aca aca ttg aat 1152Glu Ile Ile Arg Ser Leu Thr Thr Thr Thr Glu Pro Thr Thr Leu Asn370 375 380agc acc act ccg gaa ccg aca aca ttg aat agc acc act ccg gaa ccg 1200Ser Thr Thr Pro Glu Pro Thr Thr Leu Asn Ser Thr Thr Pro Glu Pro385 390 395 400aca aca ttg aat agc acc act ccg gaa ccg aca aca ttg aat agc acc 1248Thr Thr Leu Asn Ser Thr Thr Pro Glu Pro Thr Thr Leu Asn Ser Thr405 410 415act ccg gaa ccg aca aca ttg aat agc acc act ccg gga ccg aca aca 1296Thr Pro Glu Pro Thr Thr Leu Asn Ser Thr Thr Pro Gly Pro Thr Thr420 425 430ttg aat agc acc act ccg gaa ccg aca aca ttg aat agc acc act ccg 1344Leu Asn Ser Thr Thr Pro Glu Pro Thr Thr Leu Ash Ser Thr Thr Pro435 440 445
gaa ccg aca aca ttg aat agc acc act ccg gaa ccg aca aca tcg aat 1392Glu Pro Thr Thr Leu Asn Ser Thr Thr Pro Glu Pro Thr Thr Ser Asn450 455 460agc acc act tca gaa cca acg aat tca atc aat aga aaa aca agt gaa 1440Ser Thr Thr Ser Glu Pro Thr Asn Ser Ile Asn Arg Lys Thr Ser Glu465 470 475 480ttt cat tct tat ccg att ggt tcc ata aga ttc gaa tca gat tca ata 1488Phe His Ser Tyr Pro Ile Gly Ser Ile Arg Phe Glu Ser Asp Ser Ile485 490 495ttt tct aaa cat ttt att ctt ttg att tga 1518Phe Ser Lys His Phe Ile Leu Leu Ile500 505<210>35<211>505<212>PRT<213>粉塵螨<400> 35Met Lys Leu Thr Ala Thr Leu Leu Leu Ile Leu Thr Leu Ser Trp Ala1 5 10 15Gly Ile Phe Val Asp Ala Asn Pro Arg Phe Lys Arg Asp Asn Arg Asp20 25 30Asp Val Leu Lys Gln Thr Glu Glu Leu Ile Lys Ser Ala Gln Asp Val35 40 45Leu Glu Lys Leu Pro Asp Ser Asp Leu Lys Asp Glu Ile Ala Glu Lys50 55 60Leu Ala Thr Met Lys His Tyr Lys His Lys Leu Glu Asn Ala Lys Asn65 70 75 80Pro Ile Lys Ile Ala His Phe Glu Leu Glu Leu Leu Thr Met Phe Lys85 90 95Lys Phe Gln Ser Leu Leu Asn Glu Ala Asn Glu Ile Ile Lys Ser Leu100 105 110Thr Thr Thr Thr Thr Glu Pro Thr Thr Pro Thr Pro Glu Pro Thr Thr115 120 125
Thr Thr Pro Glu Pro Thr Thr Lys Thr Pro Glu Pro Thr Thr Lys Thr130 135 140Pro Glu Pro Thr Thr Pro Thr Pro Glu Pro Thr Thr Lys Thr Pro Glu145 150 155 160Pro Thr Thr Lys Thr Pro Glu Pro Thr Thr Pro Thr Pro Glu Pro Thr165 170 175Thr Lys Thr Pro Glu Pro Thr Thr Pro Thr Pro Glu Pro Thr Thr Lys180 185 190Thr Pro Glu Pro Thr Thr Lys Thr Pro Glu Pro Ser Thr Pro Thr Pro195 200 205Asp Arg Tyr Gln Ash Pro Arg Pro Leu Pro Lys His Arg Thr Ile His210 215 220Pro Asn Ser Gly Pro Thr Thr Lys Thr Pro Glu Pro Ser Thr Pro Thr225 230 235 240Pro Glu Pro Thr Thr Lys Thr Pro Glu Pro Thr Thr Lys Thr Pro Glu245 250 255Pro Ser Thr Pro Thr Pro Glu Pro Thr Thr Lys Thr Pro Glu Pro Ser260 265 270Thr Pro Thr Pro Glu Pro Thr Thr Lys Thr Pro Glu Pro Ser Thr Thr275 280 285Lys Lys Pro Asn Arg Asp Asp Val Leu Lys Gln Ala Glu Glu Leu Ile290 295 300Lys Arg Ala Glu Asp Val Phe Glu Lys Leu Pro Asp Ser Asp Leu Lys305 310 315 320Asn Glu Ile Ala Glu Lys Leu Ala Thr Met Lys Asn Tyr Lys His Glu325 330 335Leu Glu Asn Ala Lys Asn Pro Ile Lys Ile Ala His Leu Glu Ser Glu340 345 350Leu Leu Thr Met Phe Lys Met Phe Gln Ser Leu Leu Asn Glu Ala Asp355 360 365Glu Ile Ile Arg Ser Leu Thr Thr Thr Thr Glu Pro Thr Thr Leu Asn370 375 380
Ser Thr Thr Pro Glu Pro Thr Thr Leu Asn Ser Thr Thr Pro Glu Pro385 390 395 400Thr Thr Leu Asn Ser Thr Thr Pro Glu Pro Thr Thr Leu Asn Ser Thr405 410 415Thr Pro Glu Pro Thr Thr Leu Asn Ser Thr Thr Pro Gly Pro Thr Thr420 425 430Leu Asn Ser Thr Thr Pro Glu Pro Thr Thr Leu Asn Ser Thr Thr Pro435 440 445Glu Pro Thr Thr Leu Asn Ser Thr Thr Pro Glu Pro Thr Thr Ser Asn450 455 460Ser Thr Thr Ser Glu Pro Thr Asn Ser Ile Asn Arg Lys Thr Ser Glu465 470 475 480Phe His Ser Tyr Pro Ile Gly Ser Ile Arg Phe Glu Ser Asp Ser Ile485 490 495Phe Ser Lys His Phe Ile Leu Leu Ile500 505<210>36<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物<400>36aattacaaac atgagttaga a 21<210>37<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物<400>37gaattgttga caatgttcaa a 21
<210>38<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物<400>38gatttcatct ttcaaatctg a 21<210>39<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物<400>39cttttccaat acatcctggg c 21
權(quán)利要求
1.以下重組螨變應原(a)或(b)(a)包含SEQ ID NO2所示氨基酸序列的重組螨變應原；或(b)包含通過對SEQ ID NO2所示氨基酸序列缺失、取代或添加一個或幾個氨基酸而得到的氨基酸序列，并且具有螨變應原活性的重組螨變應原。
2.以下重組螨變應原(a)或(b)(a)包含SEQ ID NO35所示氨基酸序列的重組螨變應原；或(b)包含通過對SEQ ID NO35所示氨基酸序列缺失、取代或添加一個或幾個氨基酸而得到的氨基酸序列，并且具有螨變應原活性的重組螨變應原。
3.編碼以下螨變應原(a)或(b)的基因(a)包含SEQ ID NO2所示氨基酸序列的螨變應原；或(b)包含通過對SEQ ID NO2所示氨基酸序列缺失、取代或添加一個或幾個氨基酸而得到的氨基酸序列，并且具有螨變應原活性的螨變應原。
4.編碼以下螨變應原(a)或(b)的基因(a)包含SEQ ID NO35所示氨基酸序列的螨變應原；或(b)包含通過對SEQ ID NO35所示氨基酸序列缺失、取代或添加一個或幾個氨基酸而得到的氨基酸序列，并且具有螨變應原活性的螨變應原。
5.包含以下DNA(c)或(d)的基因(c)包含SEQ ID NO1所示核苷酸序列的DNA；或(d)在嚴格條件下與包含特定序列的DNA雜交，并且編碼具有螨變應原活性的蛋白的DNA，所述特定序列與包含SEQ ID NO1所示核苷酸序列的DNA的序列互補。
6.包含以下DNA(c)或(d)的基因(c)包含SEQ ID NO34所示核苷酸序列的DNA；或(d)在嚴格條件下與包含特定序列的DNA雜交，并且編碼具有螨變應原活性的蛋白的DNA，所述特定序列與包含SEQ ID NO34所示核苷酸序列的DNA的序列互補。
7.權(quán)利要求
1或2的螨變應原的片段肽。
8.權(quán)利要求
7的片段肽，其包含含有SEQ ID NO3-SEQ ID NO19所示氨基酸序列中的至少一個序列的氨基酸序列。
9.螨變應原的片段基因，其編碼權(quán)利要求
7或8的片段肽。
10.重組載體，其包含權(quán)利要求
3-6的任意一項的基因或權(quán)利要求
9的片段基因。
11.融合蛋白，其由權(quán)利要求
1或2的螨變應原和另一種蛋白組成。
12.用權(quán)利要求
10的表達載體轉(zhuǎn)化的細茵、酵母、昆蟲或動物細胞。
13.生產(chǎn)重組螨變應原的方法，該方法包括在可以表達基因的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求
12的細菌、酵母、昆蟲或動物細胞，導致細胞產(chǎn)生重組螨變應原，然后收獲重組螨變應原。
14.生產(chǎn)重組螨變應原的方法，該方法包括在可以表達基因的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求
12的細菌、酵母、昆蟲或動物細胞，導致細胞產(chǎn)生融合重組螨變應原，收獲融合重組螨變應原，然后除去與變應原融合的另一種蛋白。
15.螨變態(tài)反應性疾病的治療劑，其含有權(quán)利要求
1或2的重組螨變應原、權(quán)利要求
7的片段肽或權(quán)利要求
11的融合蛋白作為活性成分。
16.螨變態(tài)反應性疾病的診斷劑，其含有權(quán)利要求
1或2的重組螨變應原、權(quán)利要求
7的片段肽或權(quán)利要求
11的融合蛋白作為活性成分。
17.權(quán)利要求
1或2的抗螨變應原的抗體。
18.權(quán)利要求
17的抗螨變應原的抗體，其是單克隆抗體。
19.雜交瘤，其產(chǎn)生權(quán)利要求
18的單克隆抗體。
20.屋塵中的螨變應原的免疫測定方法，其使用權(quán)利要求
17-19的任意一項的抗體。
21.權(quán)利要求
20的屋塵中的螨變應原的免疫測定方法，其是ELISA法。
專利摘要
安全和有效的不含誘導過敏的雜質(zhì)的變應原，其作為螨變態(tài)反應性疾病的治療劑或診斷劑。提供了以下重組蛋白(a)由SEQ ID NO2或35所示氨基酸序列組成的蛋白；或(b)包含通過對SEQ ID NO2或35所示氨基酸序列缺失、取代或添加一個或幾個氨基酸而得到的氨基酸序列的蛋白，其具有螨變應原活性。
文檔編號A61P37/00GK1997741SQ200580018846
公開日2007年7月11日 申請日期2005年4月7日
發(fā)明者津久井利廣, 辻本元, 巖淵成紘 申請人:日本全藥工業(yè)株式會社導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan