專利名稱:一種l-谷氨酸基因工程菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種能夠提高L-谷氨酸產(chǎn)量的基因工程菌、其構(gòu)建方法及其在生產(chǎn)L-谷氨酸上的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
谷氨酸(Glutamic acid),其學(xué)名為2_氨基_5_羧基戍酸,是構(gòu)成蛋白質(zhì)的20種常見氨基酸之一，在生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)代謝過程中占有重要地位，參與動物、植物和微生物中的許多重要化學(xué)反應(yīng)。L-谷氨酸是谷氨酸的左旋體，其具有增鮮、降低血氨、改善中樞神經(jīng)系統(tǒng)、改善兒童智力發(fā)育、擴張血管、增強血液循環(huán)、促進(jìn)花穗發(fā)育等功能，并且可以生產(chǎn)許多重要的下游產(chǎn)品，如L-谷氨酸鈉、L-蘇氨酸、聚谷氨酸等，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、人造制革、化妝品、農(nóng)業(yè)等行業(yè)。
谷氨酸的制備起始于18世紀(jì)。1866年德國化學(xué)家從小麥面筋的水解物中提取得到谷氨酸，1957年日本率先采用微生物發(fā)酵的方法生產(chǎn)谷氨酸，因發(fā)酵法具有原料成本低、反應(yīng)條件溫和、可大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點，目前仍是谷氨酸生產(chǎn)的主要方法。目前我國發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸的菌種主要包括谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)、天津短桿菌(Brevibacterium tianjinese)、純齒棒桿菌(Corynebaclerium crenalum)、北京棒桿菌(Corynebaclerium pekinense)、黃色短桿菌(Brevibacterium fIavum)以及它們的突變株,如天津短桿菌T613的 突變株TG-916、FM-415、CMTC6286、S9114等，鈍齒棒桿菌ASL 542的突變株B9、F-263，北京棒桿菌ASl.299的突變株7338、D110、WTH-1等。
上述谷氨酸生產(chǎn)菌主要是通過選育及誘變育種的方式獲得，其產(chǎn)酸能力伴隨著谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)的發(fā)展獲得了很大的提高。然而在現(xiàn)有的產(chǎn)酸能力下，繼續(xù)采用經(jīng)典微生物育種的方式來選育菌種，以期達(dá)到大幅度提高產(chǎn)酸率和糖酸轉(zhuǎn)化率已經(jīng)相當(dāng)困難。近年來，隨著谷氨酸棒桿菌模式菌株ATCC13032基因組測序的完成以及谷氨酸棒桿菌基因操作技術(shù)的不斷完善，使得通過分子生物學(xué)手段對谷氨酸棒桿菌進(jìn)行相關(guān)改造成為現(xiàn)實。
谷氨酸的生物合成的途徑包括糖酵解作用(EMP途徑)、磷酸戊糖途徑(HMP途徑)、三羧酸循環(huán)(TCA循環(huán))、乙醛酸循環(huán)和丙酮酸羧化支路等。在谷氨酸發(fā)酵中，生成谷氨酸的主要反應(yīng)包括谷氨酸脫氫酶(GHD)所催化的還原氨基化反應(yīng)、轉(zhuǎn)氨酶(AT)所催化的轉(zhuǎn)氨反應(yīng)以及谷氨酸合成酶(GS)所催化的合成反應(yīng)，其中還原氨基化反應(yīng)為主導(dǎo)反應(yīng)。由葡萄糖生物合成谷氨酸的理想代謝途徑是先通過EMP和HMP途徑生成丙酮酸，丙酮酸一部分在丙酮酸脫氫酶系統(tǒng)作用下生成乙酰CoA，另一部分經(jīng)CO2固定反應(yīng)生成草酰乙酸，草酰乙酸與乙酰CoA在檸檬酸合成酶的催化下合成檸檬酸，進(jìn)入TCA循環(huán)，最終生成α -酮戊二酸，其經(jīng)谷氨酸脫氫酶作用經(jīng)還原氨基化作用生成谷氨酸，此時理論糖酸轉(zhuǎn)化率為81.7%。
日本味之素株式會社依據(jù)谷氨酸合成的代謝途徑對谷氨酸生產(chǎn)菌種作了一些基因改造，如在公開號為CN1261627A的中國發(fā)明專利中公開了通過在培養(yǎng)基中培養(yǎng)屬于腸細(xì)菌并具有L-谷氨酸生成能力的引入了來自棒狀細(xì)菌的檸檬酸合成酶基因微生物來生產(chǎn)L-谷氨酸；在CN1270226A中公開通過增加編碼細(xì)胞內(nèi)丙酮酸脫氫酶的基因的拷貝數(shù)獲得的增強的細(xì)胞內(nèi)丙酮酸脫氫酶活性和具有谷氨酸生產(chǎn)能力的棒桿菌細(xì)菌；在CN1938418A中公開通過在培養(yǎng)基中培養(yǎng)其中L-谷氨酸輸出基因YHFK基因的表達(dá)增強或過表達(dá)的微生物以產(chǎn)生并導(dǎo)致L-谷氨酸在培養(yǎng)基中累積等。
除了上述酶外，在谷氨酸生物合成代謝途徑中，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶是催化CO2固定化從而使磷酸烯醇式丙酮酸合成草酰乙酸的關(guān)鍵酶，如CO2固定反應(yīng)不起作用，則丙酮酸將全部氧化成乙酰CoA，再通過乙醛酸循環(huán)供給四碳二羧酸，此時理論糖酸轉(zhuǎn)化率僅為54.4%，因此通過該酶的過量表達(dá)可能提高谷氨酸的發(fā)酵水平。此外，谷氨酸脫氫酶是谷氨酸合成途徑中另一個關(guān)鍵酶，該酶催化α -酮戊二酸還原生成L-谷氨酸且受L-谷氨酸的反饋作用，因此過表達(dá)該酶可解除L-谷氨酸的反饋作用，從而達(dá)到提高產(chǎn)量的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要目的是針對上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題提供一種依據(jù)代謝工程理論來通過分子生物學(xué)方法構(gòu)建的谷氨酸基因工程菌，對該基因工程菌進(jìn)行發(fā)酵可以顯著提高L-谷氨酸的產(chǎn)量以及糖酸轉(zhuǎn)化率。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明一方面提供一種高產(chǎn)L-谷氨酸的基因工程菌，其是將谷氨酸生產(chǎn)菌中編碼磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的Pepc基因以及編碼谷氨酸脫氫酶的gdh基因通過表達(dá)載體引入谷氨酸生產(chǎn)菌中進(jìn)行串聯(lián)表達(dá)所得到的重組菌。
特別是，所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶用于催化CO2固定化從而使磷酸烯醇式丙酮酸合成草酰乙酸，谷氨酸脫氫酶用于催化α -酮戊二酸還原生成L-谷氨酸，這兩種酶的大量表達(dá)有利用谷氨酸生產(chǎn)菌利用葡萄糖大量積累L-谷氨酸，從而提高谷氨酸的產(chǎn)量及糖酸轉(zhuǎn)化率。
理論上，所有的谷氨 酸生物素營養(yǎng)缺陷型菌株均適用于本發(fā)明，目前現(xiàn)有技術(shù)中以糖質(zhì)為碳源的谷氨酸產(chǎn)生菌幾乎都是生物素營養(yǎng)缺陷型。特別是，本發(fā)明所述谷氨酸生產(chǎn)菌選自谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)、天津短桿菌(Corynebacteriumtianjin)、北京棒桿菌(Corynebacterium pekinense)、純齒棒桿菌(Corynebacteriumcrenatum)、黃色短桿菌(Brevibacterium f Iavum)中的一種，優(yōu)選為谷氨酸棒桿菌⑶K-9、北京棒桿菌ASl.299、鈍齒棒桿菌ASl.542、天津短桿菌T613中的一種，進(jìn)一步優(yōu)選為谷氨酸棒桿菌GDK-9 (其具有酮基丙二酸、氟乙酸、磺胺胍、谷氨酰抗性遺傳標(biāo)記，其定向育種研究已于2008年在《食品與發(fā)酵工業(yè)》第34卷第7期發(fā)表，現(xiàn)保藏于天津科技大學(xué)代謝工程研究室)；所述表達(dá)載體為PXMJ19。
特別是，所述基因工程菌的構(gòu)建方法包括:利用PCR技術(shù)擴增谷氨酸生產(chǎn)菌中編碼磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的Pepc基因以及編碼谷氨酸脫氫酶編碼的gdh基因，將所述pepc基因和gdh基因克隆至表達(dá)載體后，轉(zhuǎn)入谷氨酸生產(chǎn)菌中進(jìn)行串聯(lián)表達(dá)，得到所述基因工程菌。
尤其是，所述基因工程菌為⑶K-PG，其構(gòu)建方法包括:
I)利用谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum ATCC13032)的 pepc 基因的DNA序列(GeneID:3343481)和gdh基因的DNA序列(GeneID: 3343980)分別設(shè)計引物；
2)以谷氨酸棒桿菌⑶K-9的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴增；
3)回收PCR擴增產(chǎn)物，與穿梭質(zhì)粒pXMJ19進(jìn)行連接，得到重組的表達(dá)載體PXMJ19PG ；
4)將重組的表達(dá)載體pXMJ19PG導(dǎo)入谷氨酸棒桿菌⑶K_9的感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性轉(zhuǎn)化子，即構(gòu)建得到谷氨酸基因工程菌GDK-PG。
其中，所述谷氨酸棒桿菌GDK-9的感受態(tài)細(xì)胞采用常規(guī)方法制備得到。
本發(fā)明另一方面提供所述的基因工程菌在生產(chǎn)L-谷氨酸上的應(yīng)用。
特別是，所述應(yīng)用是利用所述基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)L-谷氨酸。
本發(fā)明再一方面提供一種生產(chǎn)L-谷氨酸的方法，將所述基因工程菌接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，制得L-谷氨酸。
特別是，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為:葡萄糖70_90g/L，玉米漿(來源于梅花生物科技集團(tuán)股份有限公司霸州廠區(qū))3-6ml/L，豆餅水解液(來源于寧夏伊品生物科技股份有限公司)15-25ml/L, KC10.5_2g/L，Na2HPO4.12Η200.5_2g/L，MgSO4.7H201_2g/L，MnSO4 *H201-3mg/L, FeSO4 ^H2Ol-SmgZLjVB10.1-0.5mg/L，發(fā)酵培養(yǎng)基的 pH 值為 7.0 7.4。
尤其是，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方優(yōu)選為:葡萄糖80g/L，玉米漿4.5ml/L,豆餅水解液 19.8ml/L, KC11.2g/L, Na2HPO4.12Η201.2g/L, MgSO4.7Η201.5g/L, MnSO4.H202mg/L,FeSO4.7H202mg/L, VB10.2mg/L,發(fā)酵培養(yǎng)基的 pH 值為 7.0 7.2。
其中，所述方法具體包括:先將所述基因工程菌接種于斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，然后將活化的菌種接種于種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長中后期，得到種子液；再將所述種子液以一定的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，并在攪拌的方式下進(jìn)行發(fā)酵，制得L-谷氨酸。
特別是，所述種子培養(yǎng)基的配方為:葡萄糖20_30g/L，尿素2_4g/L，K2HPO4.3H201-3g/L, MgSO4.7H200.5-1.5g/L,玉米漿 30_40mL/L，豆餅水解液 20_30mL/L，ρΗ7.0-7.4 ;優(yōu)選為葡萄糖 25.0g/L，尿素 3g/L，K2HPO4.3Η202.2g/L，MgSO4.7Η200.9g/L，玉米漿33mL/L，豆餅水解液22mL/L，pH7.0-7.2 ;所述接種量為5_15%，優(yōu)選為10% ;所述攪拌的速度為 500r/min-880r/min，優(yōu)選為 500_600r/min。
其中，所述發(fā)酵為補料分批發(fā)酵；采用補料分批發(fā)酵可以避免在分批發(fā)酵中因一次投料過多而產(chǎn)生的底物抑制、產(chǎn)物反饋抑制及分解代謝物阻遏等作用，從而減少菌體生
長量及提高糖酸轉(zhuǎn)化率。
特別是，所述補料分批發(fā)酵具體包括:視所述發(fā)酵的發(fā)酵液中殘留葡萄糖的情況來流加葡萄糖溶液，使發(fā)酵液中的葡萄糖濃度維持在1.0-2.0%，其中所述葡萄糖溶液的濃度為80-90wt%。較低的殘?zhí)菨舛瓤墒拱l(fā)酵液具有低的滲透壓，從而有利于谷氨酸向胞外分泌。
尤其是，自發(fā)酵液中殘留葡萄糖的濃度為5-2%時開始流加所述葡萄糖溶液(此時為發(fā)酵開始6-8h)，優(yōu)選自發(fā)酵液中殘留葡萄糖的濃度為3-2%時開始流加所述葡萄糖溶液。
其中，采用間隔升溫方式控制所述發(fā)酵的溫度；所述間隔升溫具體包括:控制發(fā)酵的起始溫度為34°C，并且自發(fā)酵開始后每間隔4h使發(fā)酵溫度升高0.5°C。由于谷氨酸發(fā)酵屬于II型，而谷氨酸棒桿菌⑶K-9為溫度敏感型菌種，因此溫度的控制既是菌體生長所需，也是細(xì)胞轉(zhuǎn)型和產(chǎn)酸的關(guān)鍵。本發(fā)明采用間隔升溫，使細(xì)胞逐漸從生長型轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)酸型，從而避免了因原料的影響而造成產(chǎn)酸不穩(wěn)定的現(xiàn)象，有利于L-谷氨酸的大量積累。
其中，采用分段供氧方式控制所述發(fā)酵的發(fā)酵液中的溶氧濃度；所述分段供氧具體包括:控制所述基因工程菌在其生長延滯期至對數(shù)生長期后期發(fā)酵液中的溶氧濃度為15-25%，優(yōu)選為20%，所述基因工程菌在其生長穩(wěn)定期至發(fā)酵結(jié)束發(fā)酵液中的溶氧濃度(10%，優(yōu)選為 1-5%。
特別是，所述基因工程菌的生長延滯期至生長對數(shù)期后期為發(fā)酵O-lOh，此階段菌體大量生長，所需溶氧濃度大；所述生長穩(wěn)定期至發(fā)酵結(jié)束為發(fā)酵IOh至發(fā)酵結(jié)束，此階段耗氧量降低，控制較低溶氧，利于產(chǎn)酸。
尤其是，在發(fā)酵過程中通過調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速來進(jìn)行所述分段供氧，其中控制初始通氣量為l_2L/min，攪拌轉(zhuǎn)速為500r/min_880r/min。
其中，所述發(fā)酵還包括:流加一定濃度的氨水，使發(fā)酵液的pH維持在7.0-7.4。特別是，所述氨水的濃度為20-30%，優(yōu)選為25%。
其中，所述發(fā)酵還包括:根據(jù)發(fā)酵罐中的泡沫情況流加15-25%，優(yōu)選為20%的泡敵進(jìn)行消泡。
本發(fā)明采用所述谷氨酸基因工程菌進(jìn)行發(fā)酵，具體包括:以一定的接種量將所述基因工程菌的菌液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，并在攪拌的方式下進(jìn)行發(fā)酵；其中，在發(fā)酵過程中通過間隔升溫的方式控制發(fā)酵溫度，通過分段供氧的方式控制發(fā)酵液中的溶氧濃度，并且通過流加葡萄糖溶液，使發(fā)酵液中的葡萄糖濃度維持在1.0-2.0%。
特別是，所述接種量為5-15%，優(yōu)選為10% ;所述攪拌的速度為500r/min-880r/min,優(yōu)選為 500-600r/min。
采用所述谷氨酸基因工程菌發(fā)酵28-32小時后，發(fā)酵液中L-谷氨酸的含量達(dá)到145-160g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為60-6 5%。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點:
1、本發(fā)明采用基因工程手段，將P印c基因和ghd基因通過表達(dá)載體引入谷氨酸生產(chǎn)菌中進(jìn)行串聯(lián)表達(dá)來構(gòu)建基因工程菌，不僅構(gòu)建方法簡單易行、適用菌種范圍廣泛，此外構(gòu)建的基因工程菌質(zhì)粒穩(wěn)定，不易丟失；
2、采用本發(fā)明構(gòu)建的基因工程菌發(fā)酵制備L-谷氨酸，通過采用間隔升溫、分段供氧及補料分批發(fā)酵等對發(fā)酵工藝進(jìn)行控制，可以獲得較高的谷氨酸產(chǎn)量及糖酸轉(zhuǎn)化率，其中L-谷氨酸的產(chǎn)量高達(dá)145-160g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率高達(dá)60-65%，此方法工藝易于控制、所需設(shè)備簡單，特別適用于L-谷氨酸的大規(guī)?；a(chǎn)制備。


圖1是本發(fā)明基因工程菌重組質(zhì)粒構(gòu)建的流程圖。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
實施例1
一、谷氨酸基因工程菌的構(gòu)建[0045]1、pepc基因和gdh基因的克隆
根據(jù)谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum ATCC13032)的 pepc 基因的DNA序列(GeneID:3343481)和gdh基因的DNA序列(GeneID: 3343980)分別設(shè)計引物進(jìn)行PCR擴增，引物序列如下:
Primerl:5’ -GCGAAGCTTGCTCCAGCAAACGCCT-3，(下劃線為引入的 Hind III酶切位點)
Primer2:5，-GCGTCTAGACACGCTTAAAGACACC-3，(下劃線為引入的 Xba I 酶切位點)
Primerf:5，-GGCGGTAACTGAACAAAAGAGCCCATCAAC-3，(下劃線為引入的 Kpn I 酶切位點)
Primer4:5，-GGCGAATTCTTACTTCTTCAGTGCGTCAACG-3，(下劃線為引入的 EcoR I 酶切位點)
以谷氨酸棒桿菌⑶K-9的基因組DNA為模板，采用TaKaRa Ex Taq PCR試劑盒(貨號:DROOI AM)、分別以Primerl和Primer 2、以及Primer 3和Primer4為引物進(jìn)行PCR擴增，其中:
P印c 基因的擴增體系(50μ I)為:DNA 聚合酶(5υ/μ 1)0.25μ 1，10XPCRBuffer5 μ I, dNTP Mixture (各 2.5mmol/L)4y I,模板(2.5ng/ μ I) I μ I, Primerl 和Primer2 (10ymol/l)各 2μ 1，去離子水 35.75 μ I ;擴增條件為:94 °C 5minl 個循環(huán)，94°C 30s,56°C 30s,72°C 3min30 個循環(huán)，72°C IOminl 個循環(huán)；
gdh 基因的擴增體系(50 μ I)為:DNA聚合酶(5U/y I), 10XPCR Buffer5 μ I, dNTPMixture (各 2.5mmol/L)4 μ 1，模板(2.5ng/ μ 1)1 μ I,Primerl 和 Primer2 (10 μ mol/1)各2 μ 1，去離子水 35.75 μ I ;擴增條件為:94°C 5minl 個循環(huán)，94°C 30s,56°C 30s,72°C 2min30個循環(huán)，72°C IOminl個循環(huán)；
PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，分別得到大小為2789bp (pepc基因)和1344bp (gdh基因)的擴增條帶；
2、基因工程菌的構(gòu)建
用DNA回收試劑盒回收PCR擴增產(chǎn)物，與穿梭質(zhì)粒pXMJ19進(jìn)行連接，得到重組的表達(dá)載體PXMJ19PG ；
采用電轉(zhuǎn)化法將上述重組的表達(dá)載體pXMJ19PG導(dǎo)入谷氨酸棒桿菌⑶K_9的感受態(tài)細(xì)胞中，在含有l(wèi)Oug/ml氯霉素的平板上篩選陽性轉(zhuǎn)化子，經(jīng)提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR和酶切驗證后，得到谷氨酸基因工程菌⑶K-PG，凍存于-80°C甘油管中。
二、谷氨酸基因工程菌的質(zhì)粒穩(wěn)定性
采用平板稀釋計數(shù)法，將上述凍存于-80°C甘油管中的谷氨酸基因工程菌在含10 μ g/L氯霉素的LB平板上進(jìn)行三區(qū)劃線，于37°C培養(yǎng)16h后，挑取單菌落接種于5ml液體選擇性培養(yǎng)基(LB/Cnf)中，搖管培養(yǎng)12h后以I %的接種量轉(zhuǎn)入5ml液體非選擇性培養(yǎng)基(LB)，開始連續(xù)搖管培養(yǎng)試驗；其中每12h轉(zhuǎn)接一次，接種量為1%，連續(xù)傳代30次，并每隔5次取樣進(jìn)行平板稀釋檢測質(zhì)粒的缺失程度；
檢測時，取菌液Iml用無菌水逐級稀釋，取三個合適的梯度，分別涂布在固體選擇性培養(yǎng)基和非選擇性培養(yǎng)基平板上，倒置在37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16h后，計算各皿中的菌落數(shù)，其中每個處理三個重復(fù)；[0061]將選擇性培養(yǎng)基中的菌落數(shù)與非選擇性培養(yǎng)基中菌落數(shù)進(jìn)行比較，計算出質(zhì)粒的缺失率，結(jié)果見表1;
表1谷氨酸基因工程菌⑶K-PG的質(zhì)粒穩(wěn)定性
權(quán)利要求
1.一種L-谷氨酸基因工程菌，其特征在于，其是將谷氨酸生產(chǎn)菌中編碼磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的P印c基因以及編碼谷氨酸脫氫酶的gdh基因通過表達(dá)載體引入谷氨酸生產(chǎn)菌中進(jìn)行串聯(lián)表達(dá)所得到的重組菌。
2.如權(quán)利要求
1所述的基因工程菌，其特征在于，所述谷氨酸生產(chǎn)菌選自谷氨酸棒桿菌、天津短桿菌、北京棒桿菌、鈍齒棒桿菌中的一種，所述表達(dá)載體為PXMJ19。
3.權(quán)利要求
1或2所述的基因工程菌在生產(chǎn)L-谷氨酸上的應(yīng)用。
4.一種生產(chǎn)L-谷氨酸的方法，其特征在于，將權(quán)利要求
1或2所述的基因工程菌接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，制得L-谷氨酸。
5.如權(quán)利要求
4所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為:葡萄糖70-90g/L，玉米漿 3-6ml/L,豆餅水解液 15_25ml/L，KC10.5_2g/L，Na2HPO4.12H200.5_2g/L，MgSO4.7H201-2g/L, MnSO4.H201_3mg/L，F(xiàn)eSO4.7H201_3mg/L，VB10.1-0.5mg/L,發(fā)酵培養(yǎng)基的 pH 值為 7.0-7.4。
6.如權(quán)利要求
4所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵為補料分批發(fā)酵。
7.如權(quán)利要求
6所述的方法，其特征在于，所述補料分批發(fā)酵具體包括:視所述發(fā)酵的發(fā)酵液中殘留葡萄糖的情況來流加葡萄糖溶液，使發(fā)酵液中的葡萄糖濃度維持在1.0-2.0%。
8.如權(quán)利要求
4-7中任一所述的方法，其特征在于，采用間隔升溫方式控制所述發(fā)酵的溫度，其中所述間隔升溫具體包括:控制發(fā)酵的起始溫度為34°C，并且自發(fā)酵開始后每間隔4h使發(fā)酵溫度升高0.5°C。
9.如權(quán)利要求
4-7中任一所述的方法，其特征在于，采用分段供氧方式控制所述發(fā)酵的發(fā)酵液中的溶氧濃度，其中所述分段供氧具體包括:控制所述基因工程菌在其生長延滯期至對數(shù)生長期后期發(fā)酵液中的溶氧濃度為15-25%，所述基因工程菌在其生長穩(wěn)定期至發(fā)酵結(jié)束發(fā)酵液中的溶氧濃度< 10%。
10.如權(quán)利要求
4-7中任一所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵還包括:流加一定濃度的氨水，使發(fā)酵液的PH維持在7.0-7.4。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種L-谷氨酸基因工程菌及其應(yīng)用，所述基因工程菌是將谷氨酸生產(chǎn)菌中編碼磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的pepc基因以及編碼谷氨酸脫氫酶的gdh基因通過表達(dá)載體引入谷氨酸生產(chǎn)菌中進(jìn)行串聯(lián)表達(dá)所得到的重組菌。本發(fā)明進(jìn)一步對所述基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)L-谷氨酸的工藝進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后的發(fā)酵工藝能夠顯著提高所述基因工程菌中L-谷氨酸的產(chǎn)量，達(dá)到大約150g/L的水平，并且發(fā)酵過程中糖酸轉(zhuǎn)化率也有所提高，達(dá)到60%以上。本發(fā)明方法構(gòu)建的基因工程菌穩(wěn)定、質(zhì)粒不易丟失，此外發(fā)酵方法簡單易行、周期短、設(shè)備要求低，特別適合進(jìn)行工業(yè)化大規(guī)模的生產(chǎn)。
文檔編號C12P13/14GKCN103205390SQ201310127579
公開日2013年7月17日 申請日期2013年4月12日
發(fā)明者邱博, 謝希賢, 張成林, 萬紅兵, 歐陽宇紅, 曹文杰 申請人:北京輕發(fā)生物技術(shù)中心, 天津科技大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan