專(zhuān)利名稱(chēng):一種提高l-纈氨酸產(chǎn)率的發(fā)酵方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵領(lǐng)域，特別是涉及一種L-纈氨酸發(fā)酵的方法。
背景技術(shù)：
纈氨酸(Valine)，中文名為2-氨基-3-甲基丁酸，屬于分支鏈氨基酸，是人與動(dòng)物自身不能合成而必須依賴(lài)外源供給的八種必須氨基酸之一，具有多種生理功能，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、飼料和化妝品等領(lǐng)域。特別是在醫(yī)藥領(lǐng)域，纈氨酸可用于與其他必需氨基酸配制成復(fù)合氨基酸輸液，尤其是高支鏈氨基酸輸液及口服液，不僅可以提高人體免疫力，還能促進(jìn)病人康復(fù)及手術(shù)后復(fù)原。此外，其還應(yīng)用于血腦屏障、肝昏迷、慢性肝硬化及腎功能衰竭的治療，先天性代謝缺陷病的膳食治療，敗血癥及術(shù)后糖尿病患者的治療，腫瘤患者的營(yíng)養(yǎng)支持治療等。
L-纈氨酸生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法、提取法和發(fā)酵法。提取法和化學(xué)合成法由于存在原料來(lái)源受限制、生產(chǎn)成本高、污染環(huán)境等缺陷而難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。微生物發(fā)酵法具有原料成本低、反應(yīng)條件溫和、容易實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，是目前生產(chǎn)L-纈氨酸最主要的方法。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-纈氨酸包括微生物轉(zhuǎn)化和直接發(fā)酵兩種方式，其中前者使用葡萄糖作為碳源，在添加特異性前體的基礎(chǔ)上通過(guò)微生物作用將其轉(zhuǎn)化為纈氨酸，而后者是借助微生物具有合成自 身所需氨基酸的能力，通過(guò)選育營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株以解除代謝調(diào)節(jié)中的反饋抑制和反饋?zhàn)瓒糇饔?，從而達(dá)到積累纈氨酸的目的。
如公開(kāi)號(hào)為CN1844356A的中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利提供了一種黃色短桿菌突變株及用于發(fā)酵法生產(chǎn)L-纈氨酸的工藝，其以黃色短桿菌HL41(CICC10135)為出發(fā)菌種，選育具有遺傳標(biāo)記(Ι1θ_+Ι^ιΓ+5Ρ+ a -ABr+2-TAr)的突變株TV230，使其具有L-纈氨酸的生物合成能力。突變株經(jīng)擴(kuò)培、發(fā)酵培養(yǎng)、提取、純化等步驟可得到L-纈氨酸純品，其中L-纈氨酸的發(fā)酵產(chǎn)率大大提聞，最聞廣量可達(dá)55g/L。
又如公開(kāi)號(hào)為CN101962664A的中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利公開(kāi)了一種高效生產(chǎn)L-纈氨酸的發(fā)酵工藝，其以營(yíng)養(yǎng)缺陷型和纟顏氨酸滲漏型菌株為生產(chǎn)菌株，以一些營(yíng)養(yǎng)組分按一定比例配制成營(yíng)養(yǎng)豐富且均衡的培養(yǎng)基作為發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵過(guò)程中，通過(guò)調(diào)節(jié)發(fā)酵罐攪拌轉(zhuǎn)速和風(fēng)量將溶氧控制在適當(dāng)?shù)乃缴希ㄟ^(guò)流加液氨控制pH,并通過(guò)流加一定濃度的葡萄糖溶液將殘?zhí)强刂圃谳^低水平，發(fā)酵60h后L-纈氨酸的產(chǎn)量(55g/L以上)和轉(zhuǎn)化率(25%以上)大幅度提聞。
黃色短桿菌是生產(chǎn)L-纈氨酸的主要生產(chǎn)菌種，其代謝主要由EMP和HMP途徑進(jìn)入TCA。PEP通過(guò)CO2固定反應(yīng)生成0ΑΑ，而OAA是合成L-蘇氨酸等雜酸的前體，通過(guò)添加檸檬酸或鹽可以有效減少TCA循環(huán)的回補(bǔ)反應(yīng)，從而使更多的PEP參與L-纈氨酸的合成。公開(kāi)號(hào)為CN101979626A的中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利公開(kāi)了一種提高L-纈氨酸發(fā)酵產(chǎn)率和糖酸轉(zhuǎn)化率的方法，其根據(jù)調(diào)整細(xì)胞代謝流分配的原理，采用在培養(yǎng)基中添加檸檬酸或其鹽的方法，來(lái)有效提高L-纈氨酸發(fā)酵過(guò)程糖酸轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)率，L-纈氨酸的產(chǎn)量達(dá)到61.2g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率達(dá)到28.3%0[0007]甜菜堿是在甜菜糖蜜中發(fā)現(xiàn)的季銨型生物堿，其是細(xì)胞代謝的中間產(chǎn)物，具有提供甲基、調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)滲透壓、促進(jìn)脂肪代謝和蛋白質(zhì)合成等作用，此外其作為細(xì)胞內(nèi)一種重要的滲透壓緩沖物質(zhì)，能防止細(xì)胞中離子濃度的激變，特別是當(dāng)細(xì)胞內(nèi)滲透壓激變時(shí)(如夕卜部滲透壓升高時(shí))，細(xì)胞開(kāi)始產(chǎn)生或吸收甜菜堿以維持正常的滲透壓的平衡，同時(shí)防止細(xì)胞水分的流出和鹽分的入侵。公開(kāi)號(hào)為CN101705262A的中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利公開(kāi)了利用甜菜堿或磷酸鹽甜菜堿來(lái)提高L-谷氨酸的發(fā)酵產(chǎn)率，然而還沒(méi)有應(yīng)用于L-纈氨酸發(fā)酵方面的相關(guān)研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要目的是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題提供一種利用甜菜堿提高L-纈氨酸產(chǎn)率的發(fā)酵方法，本發(fā)明方法工藝簡(jiǎn)單、生產(chǎn)成本低、L-纈氨酸的產(chǎn)量及糖酸轉(zhuǎn)化率有較大提高，特別適合用于工業(yè)化生產(chǎn)。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明一方面提供一種提高L-纈氨酸產(chǎn)率的發(fā)酵方法，將纈氨酸生產(chǎn)菌接種至含有甜菜堿的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，得到L-纈氨酸。
其中，所述甜菜堿在發(fā)酵培養(yǎng)基中的含量為0.l-10g/L,優(yōu)選為0.5_5g/L,進(jìn)一步優(yōu)選為l_3g/L。本發(fā)明的甜菜堿可作為菌體甲基供體、調(diào)節(jié)體內(nèi)滲透壓、促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)脂肪代謝和蛋白質(zhì)合成等，具有刺激菌體生長(zhǎng)、促進(jìn)產(chǎn)酸等作用，因而可以通過(guò)在發(fā)酵培養(yǎng)基添加甜菜堿的方法提高纈氨酸生產(chǎn)菌L-纈氨酸的發(fā)酵產(chǎn)率。
其中，所述纟顏氨酸生產(chǎn)菌為黃色短桿菌(Brevibacterium flavum),所述黃色短桿菌為黃色短桿菌HL41，其保藏于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，保藏編號(hào)為CICC10135。
其中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為:葡萄糖70_90g/L，豆餅水解液20_30ml/L，玉米漿 15-25ml/L，(NH4) 2S04l_3g/L，K2HPO4.3H201_2g/L，MgSO4.7Η200.1-lg/L,MnSO4.7Η200.01-0.02g/L，甜菜堿 0.1-lOg/L，發(fā)酵培養(yǎng)基的 pH 值為 6.7-7.0。
特別是，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方優(yōu)選為:葡萄糖80g/L，豆餅水解液25ml/L，玉米漿 20ml/L，(NH4) 2S042g/L, K2HPO4.3Η201.2g/L, MgSO4.7H200.4g/L, MnSO4.7H200.015g/L,甜菜堿3g/L。
其中，采用分段供氧方式控制所述發(fā)酵的發(fā)酵液中的溶氧濃度，其中所述分段供氧具體包括:在發(fā)酵0-20h期間控制發(fā)酵液中的溶氧濃度為20-30%，在發(fā)酵20h至發(fā)酵結(jié)束期間控制發(fā)酵液中的溶氧濃度為10-20%。
特別是,在發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)調(diào)節(jié)通氣量(l_2L/min)和攪拌轉(zhuǎn)速(500r/min-880r/min)來(lái)進(jìn)行所述分 段供氧。本發(fā)明在發(fā)酵過(guò)程中將溶氧濃度控制在恰當(dāng)?shù)乃缴?，既不因溶氧濃度過(guò)低導(dǎo)致TCA循環(huán)代謝流量減小，不足以平衡葡萄糖酵解速率，從而刺激了乳酸脫氫酶的酶活，使代謝流轉(zhuǎn)向乳酸生成，造成乳酸積累；也不因溶氧濃度過(guò)高導(dǎo)致TCA循環(huán)流量加大生成大量CO2而造成碳源的大量流失、引起乙酰乳酸合成酶酶活明顯降低而致使L-纈氨酸產(chǎn)量下降。
特別是，所述發(fā)酵為補(bǔ)料分批發(fā)酵，其具體包括:視所述發(fā)酵的發(fā)酵液中殘留葡萄糖的情況來(lái)流加葡萄糖溶液，使發(fā)酵液中的葡萄糖濃度維持在1.ο-l.5%，其中所述葡萄糖溶液的濃度為80-90wt%。尤其是，自發(fā)酵液中殘留葡萄糖的濃度為3-1%時(shí)開(kāi)始流加所述葡萄糖溶液。本發(fā)明通過(guò)流加葡萄糖溶液，使發(fā)酵液中的葡萄糖濃度維持在合適的水平，既不會(huì)構(gòu)成底物限制，又不會(huì)引起“葡萄糖效應(yīng)”，菌種的生產(chǎn)能力得到最大限度的發(fā)揮。
其中，將所述纈氨酸生產(chǎn)菌擴(kuò)大培養(yǎng)后再接種至含有甜菜堿的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，得到L-纈氨酸。
特別是，所述擴(kuò)大培養(yǎng)包括將所述纈氨酸生產(chǎn)菌接種至種子培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，得到種子液，其中所述種子培養(yǎng)基配方為:葡萄糖20-30g/L，玉米漿15-25mL/L，豆餅水解液 10-20mL/L，酵母粉 2_8g/L，尿素 0.1-lg/L, K2HPO4.3Η200.5-1.5g/L，MgSO4.7Η200.l_lg/L，MnSO4.7Η200.005-0.02g/L, VB10.1-lmg/L,生物素 0.1-lmg/L,種子培養(yǎng)基的 pH 值為
6.7-7.0。
尤其是，所述種子培養(yǎng)基配方優(yōu)選配方為:葡萄糖25g/L，玉米漿20mL/L，豆餅水解液 15mL/L，酵母粉 4g/L，尿素 0.6g/L，K2HPO4.3H201g/L, MgSO4.7Η200.4g/L，MnSO4.7Η200.0lg/L, VB10.3mg/L,生物素 0.2mg/L。
其中，所述擴(kuò)大培養(yǎng)的溫度為30_34°C，優(yōu)選為32°C，時(shí)間為12_16小時(shí)，優(yōu)選為14小時(shí)，擴(kuò)大培養(yǎng)過(guò)程中培養(yǎng)液溶氧濃度為20-30% ;所述發(fā)酵的接種量為5-15%，優(yōu)選為10%，發(fā)酵溫度為30-34°C， 優(yōu)選為32°C，發(fā)酵時(shí)間為50-70小時(shí)，優(yōu)選為60小時(shí)。
其中，所述發(fā)酵還包括:流加一定濃度的氨水，使發(fā)酵液的pH維持在6.7-7.0。特別是，所述氨水的濃度為20-30%，優(yōu)選為25%。
其中，所述發(fā)酵還包括:根據(jù)發(fā)酵罐中的泡沫情況流加15-25%，優(yōu)選為20%的泡敵進(jìn)行消泡。
相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):
1、本發(fā)明通過(guò)在L-纈氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基添加甜菜堿來(lái)提高纈氨酸生產(chǎn)菌L-纈氨酸發(fā)酵產(chǎn)率及糖酸轉(zhuǎn)化率，其中L-纈氨酸產(chǎn)率高達(dá)67.3g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為27.5%, L-乳酸產(chǎn)量為2.5g/L，相對(duì)于未添加甜菜堿的發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵，L-纈氨酸產(chǎn)率提高了 8.5%，糖酸轉(zhuǎn)化率提高了 6.2%，L-乳酸產(chǎn)量降低了 28.5% ；
2、本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)化了 L-纈氨酸的發(fā)酵工藝，通過(guò)流加葡萄糖使發(fā)酵液中殘?zhí)呛靠刂圃?-1.5%，既不會(huì)構(gòu)成底物限制，又不會(huì)引起“葡萄糖效應(yīng)”，菌種的生產(chǎn)能力得到最大限度的發(fā)揮；同時(shí)通過(guò)分段供氧控制發(fā)酵液中的溶氧，既不會(huì)造成乳酸積累，也不會(huì)浪費(fèi)碳源，L-纈氨酸得以大量積累；
3、本發(fā)明發(fā)酵方法可以通過(guò)發(fā)酵罐進(jìn)行自動(dòng)控制，工藝操作簡(jiǎn)便、設(shè)備要求低、發(fā)酵時(shí)間短、生產(chǎn)成本低、經(jīng)濟(jì)效益顯著，特別適合工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
實(shí)施例1
一、配制培養(yǎng)基
種子培養(yǎng)基:葡萄糖25g/L，玉米漿20mL/L，豆餅水解液15mL/L，酵母粉4.0g/L,尿素 0.6g/L (分消)，K2HPO4.3Η201.0g/L, MgSO4.7Η200.4g/L, MnSO4.7Η200.0lg/L, VB10.3mg/L,生物素0.2mg/L, pH值6.7-7.0,于0.75kg/cm2滅菌20min,其中尿素進(jìn)行分消(0.5kg/cm2, 30min)；
發(fā)酵培養(yǎng)基1:葡萄糖80.0g/L (分消)，豆餅水解液25mL/L，玉米20mL/L，(NH4) 2S042.0g/L, K2HPO4.3Η201.2g/L, MgSO4.7Η200.4g/L, MnSO4.7Η200.015g/L,于 0.75kg/cm2滅菌20min,其中葡萄糖進(jìn)行分消(0.5kg/cm2, 30min)；
發(fā)酵培養(yǎng)基I1:向上述發(fā)酵培養(yǎng)基I中添加甜菜堿0.5g/L，于0.75kg/cm2滅菌20min,其中葡萄糖進(jìn)行分消(0.5kg/cm2, 30min)；
二、L-纈氨酸發(fā)酵
將搖瓶活化的黃色短桿 菌HL41按10%接種量接入裝有上述種子培養(yǎng)基的5L自動(dòng)控制發(fā)酵罐中，于32°C、pH值7.0和溶氧濃度為30%條件下培養(yǎng)14h至對(duì)數(shù)期，制得種子液；
將種子液按10%接種量分別接入裝有上述發(fā)酵培養(yǎng)基I和發(fā)酵培養(yǎng)基II的5L自動(dòng)控制發(fā)酵罐中，控制發(fā)酵溫度為32°C，初始通氣量為2L/min，初始攪拌轉(zhuǎn)速為800r/min，在發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速來(lái)分段供氧，使發(fā)酵0-20h發(fā)酵液中的溶氧濃度為30%，發(fā)酵20-60h溶氧濃度為20%，通過(guò)自動(dòng)流加25%的氨水控制發(fā)酵液的pH在6.7
7.0，通過(guò)流加20%的泡敵進(jìn)行消泡，并通過(guò)流加濃度為800g/L的葡萄糖溶液將發(fā)酵液中殘?zhí)强刂圃?.0%-1.5% ；
發(fā)酵至60h結(jié)束，其中發(fā)酵培養(yǎng)基II的培養(yǎng)液中L-纈氨酸的產(chǎn)量為64.2g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為26.1%，L-乳酸產(chǎn)量為2.8g/L ;發(fā)酵培養(yǎng)基I的培養(yǎng)液中L-纈氨酸的產(chǎn)量為62.0g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為25.9%, L-乳酸產(chǎn)量為3.5g/L，由此可見(jiàn)添加甜菜堿后L-纈氨酸的產(chǎn)量提高了 3.5%，糖酸轉(zhuǎn)化率提高了 0.8%，副產(chǎn)物L(fēng)-乳酸產(chǎn)量降低了 20%。
實(shí)施例2
一、配制培養(yǎng)基
種子培養(yǎng)基:葡萄糖20g/L，玉米漿25mL/L，豆餅水解液10mL/L，酵母粉6.0g/L,尿素 0.2g/L (分消),K2HPO4.3Η200.6g/L, MgSO4.7Η201.0g/L, MnSO4.7Η200.0OegZLjVB10.8mg/L,生物素0.5mg/L, pH值6.7-7.0,于0.75kg/cm2滅菌20min,其中尿素進(jìn)行分消(0.5kg/cm2, 30min)；
發(fā)酵培養(yǎng)基1:葡萄糖75g/L (分消)，豆餅水解液20mL/L，玉米24mL/L，(NH4)2SO4L 0g/L, K2HPO4.3Η201.8g/L, MgSO4.7Η200.I g/L, MnSO4.7Η200.0lg/L,于 0.75kg/cm2滅菌20min,其中葡萄糖進(jìn)行分消(0.5kg/cm2, 30min)；
發(fā)酵培養(yǎng)基I1:向上述發(fā)酵培養(yǎng)基I中添加甜菜堿1.(^/1，于0.751^/(^2滅菌20min,其中葡萄糖進(jìn)行分消(0.5kg/cm2, 30min)；
二、L-纈氨酸發(fā)酵
將搖瓶活化的黃色短桿菌HL41按12%接種量接入裝有上述種子培養(yǎng)基的5L自動(dòng)控制發(fā)酵罐中，于32°C、pH值6.8和溶氧濃度為20%條件下培養(yǎng)14h至對(duì)數(shù)期，制得種子液；
將種子液按15%接種量分別接入裝有上述發(fā)酵培養(yǎng)基I和發(fā)酵培養(yǎng)基II的5L自動(dòng)控制發(fā)酵罐中，控制發(fā)酵溫度為32°C，初始通氣量為lL/min，初始攪拌轉(zhuǎn)速為500r/min，在發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速來(lái)分段供氧，使發(fā)酵0-20h發(fā)酵液中的溶氧濃度為20%，發(fā)酵20-60h溶氧濃度為10%，通過(guò)自動(dòng)流加25%的氨水控制發(fā)酵液的pH在6.7
7.0，通過(guò)流加20%的泡敵進(jìn)行消泡，并通過(guò)流加濃度為800g/L的葡萄糖溶液將發(fā)酵液中殘?zhí)强刂圃?.0%-1.5%，發(fā)酵至6011結(jié)束，其中發(fā)酵培養(yǎng)基II的培養(yǎng)液中L-纈氨酸的產(chǎn)量為65.5g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為26.7%，副產(chǎn)物L(fēng)-乳酸產(chǎn)量為2.7g/L，發(fā)酵培養(yǎng)基I的培養(yǎng)液中L-纈氨酸的產(chǎn)量為61.2g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為25.1%，副產(chǎn)物L(fēng)-乳酸產(chǎn)量為3.6g/L，添加甜菜堿后L-纈氨酸的產(chǎn)量提高了 7.0%，糖酸轉(zhuǎn)化率提高了 6.4%，L-乳酸產(chǎn)量降低了 25.0%。
實(shí)施例3
一、配制培養(yǎng)基
種子培養(yǎng)基:葡萄糖30g/L，玉米漿16mL/L，豆餅水解液18mL/L，酵母粉2.0g/L，尿素 0.8g/L(分消),K2HPO4.3Η201.2g/L,MgSO4.7Η200.2g/L,MnSO4.7Η200.0lSgZLjVB10.lmg/L,生物素0.8mg/L, pH值6.7-7.0,于0.75kg/cm2滅菌20min,其中尿素進(jìn)行分消(0.5kg/cm2, 30min)；
發(fā)酵培養(yǎng)基1:葡萄糖90g/L (分消)，豆餅水解液28mL/L，玉米15mL/L，(NH4) 2S043.0g/L, K2HPO4.3Η201.0g/L, MgSO4.7Η200.8g/L, MnSO4.7Η200.02g/L,于 0.75kg/cm2滅菌20min,其中葡萄糖進(jìn)行分消(0.5kg/cm2, 30min)；
發(fā)酵培養(yǎng)基I1:向上述發(fā)酵培養(yǎng)基I中添加甜菜堿6.0g/L,于0.75kg/cm2滅菌20min,其中葡萄糖進(jìn)行分消(0.5kg/cm2, 30min)；
二、L-纈氨酸發(fā)酵
將搖瓶活化的黃色短桿菌HL41按8%接種量接入裝有上述種子培養(yǎng)基的5L自動(dòng)控制發(fā)酵罐中，于 32°C、pH值7.0和溶氧濃度為25%條件下培養(yǎng)14h至對(duì)數(shù)期，制得種子液；
將種子液按8%接種量分別接入裝有上述發(fā)酵培養(yǎng)基I和發(fā)酵培養(yǎng)基II的5L自動(dòng)控制發(fā)酵罐中，控制發(fā)酵溫度為32°C，初始通氣量為1.5L/min，初始攪拌轉(zhuǎn)速為650r/min，在發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速來(lái)分段供氧，使發(fā)酵0-20h發(fā)酵液中的溶氧濃度為25%，發(fā)酵20-60h溶氧濃度為15%，通過(guò)自動(dòng)流加25%的氨水控制發(fā)酵液的pH在6.7
7.0，通過(guò)流加20%的泡敵進(jìn)行消泡，并通過(guò)流加濃度為800g/L的葡萄糖溶液將發(fā)酵液中殘?zhí)强刂圃?.0%-1.5%，發(fā)酵至60h結(jié)束，其中發(fā)酵培養(yǎng)基II的培養(yǎng)液中L-纈氨酸的產(chǎn)量為66.8g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為27%，副產(chǎn)物L(fēng)-乳酸產(chǎn)量為2.6g/L，發(fā)酵培養(yǎng)基I的培養(yǎng)液中L-纈氨酸的產(chǎn)量為61.6g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為25.5%，副產(chǎn)物L(fēng)-乳酸產(chǎn)量為3.6g/L，添加甜菜堿后L-纈氨酸的產(chǎn)量提高了 8.4%，糖酸轉(zhuǎn)化率提高了 5.9%，L-乳酸產(chǎn)量降低了 27.8%。
實(shí)施例4
種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基I同實(shí)施例1 ;
發(fā)酵培養(yǎng)基I1:向上述發(fā)酵培養(yǎng)基I中添加甜菜堿3.0g/L,于0.75kg/cm2滅菌20min,其中葡萄糖進(jìn)行分消(0.5kg/cm2, 30min)；
發(fā)酵工藝控制及相關(guān)參數(shù)同實(shí)施例1，其中發(fā)酵培養(yǎng)基II I的培養(yǎng)液中L-纈氨酸的產(chǎn)量為67.3g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為27.5%，副產(chǎn)物L(fēng)-乳酸產(chǎn)量為2.5g/L，添加甜菜堿后L-纈氨酸的產(chǎn)量提高了 8.5%，糖酸轉(zhuǎn)化率提高了 6.2%，L-乳酸產(chǎn)量降低了 28.5%。
實(shí)施例5[0058]種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基I同實(shí)施例1 ;
發(fā)酵培養(yǎng)基I1:向上述發(fā)酵培養(yǎng)基I中添加甜菜堿8.0g/L,于0.75kg/cm2滅菌20min,其中葡萄糖進(jìn)行分消(0.5kg/cm2, 30min)；
發(fā)酵工藝控制及相關(guān)參數(shù)同實(shí)施例1，其中發(fā)酵培養(yǎng)基II的培養(yǎng)液中L-纈氨酸的產(chǎn)量為66.9g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為27.1%，副產(chǎn)物L(fēng)-乳酸產(chǎn)量為2.6g/L，添加甜菜堿后L-纈氨酸的產(chǎn)量提高了 8.0%·，糖酸轉(zhuǎn)化率提高了 4.6%，L-乳酸產(chǎn)量降低了 25.7%。
權(quán)利要求
1.一種提高L-纈氨酸產(chǎn)率的發(fā)酵方法，其特征在于，將纈氨酸生產(chǎn)菌接種至含有甜菜堿的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，得到L-纈氨酸。
2.如權(quán)利要求
1所述的發(fā)酵方法，其特征在于，所述甜菜堿在發(fā)酵培養(yǎng)基中的含量為0.l-10g/L。
3.如權(quán)利要求
1或2所述的發(fā)酵方法，其特征在于，所述纈氨酸生產(chǎn)菌為黃色短桿菌。
4.如權(quán)利要求
1或2所述的發(fā)酵方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為:葡萄糖70-90g/L，豆餅水解液 20-30ml/L，玉米漿 15_25ml/L，(NH4) 2SO41-3g/L，K2HPO4.3H201_2g/L，MgSO4.7Η200.1-lg/L, MnSO4.7Η200.01-0.02g/L,甜菜堿 0.1-lOg/L，發(fā)酵培養(yǎng)基的 pH 值為 6.7-7.0。
5.如權(quán)利要求
1或2所述的發(fā)酵方法，其特征在于，采用分段供氧方式控制所述發(fā)酵的發(fā)酵液中的溶氧濃度，其中所述分段供氧具體包括:在發(fā)酵0-20h期間控制發(fā)酵液中的溶氧濃度為20-30%，在發(fā)酵20h 至發(fā)酵結(jié)束期間控制發(fā)酵液中的溶氧濃度為10-20%。
6.如權(quán)利要求
1或2所述的發(fā)酵方法，其特征在于，所述發(fā)酵為補(bǔ)料分批發(fā)酵，其具體包括:視所述發(fā)酵的發(fā)酵液中殘留葡萄糖的情況來(lái)流加葡萄糖溶液，使發(fā)酵液中的葡萄糖濃度維持在1.ο-l.5%。
7.如權(quán)利要求
1或2所述的發(fā)酵方法，其特征在于，將所述纈氨酸生產(chǎn)菌擴(kuò)大培養(yǎng)后再接種至含有甜菜堿的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，得到L-纈氨酸。
8.如權(quán)利要求
7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述擴(kuò)大培養(yǎng)包括將所述纈氨酸生產(chǎn)菌接種至種子培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，得到種子液，其中所述種子培養(yǎng)基配方為:葡萄糖20-30g/L,玉米漿 15-25mL/L,豆餅水解液 10-20mL/L,酵母粉 2_8g/L，尿素 0.1-lg/L,K2HPO4.3H200.5-1.5g/L, MgSO4.7H200.1-lg/L, MnSO4.7H200.005-0.02g/L, VB10.1-0.5mg/L，生物素0.1-0.5mg/L，種子培養(yǎng)基的pH值為6.7-7.0。
9.如權(quán)利要求
1或2所述的發(fā)酵方法，其特征在于，所述發(fā)酵的溫度為30-34°C，發(fā)酵時(shí)間為50-70小時(shí)。
10.如權(quán)利要求
1或2所述的發(fā)酵方法，其特征在于，所述發(fā)酵還包括:流加一定濃度的氨水，使發(fā)酵液的PH維持在6.7-7.0。
專(zhuān)利摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種提高L-纈氨酸產(chǎn)率的發(fā)酵方法，將纈氨酸生產(chǎn)菌接種至含有甜菜堿的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，得到L-纈氨酸，其中所述甜菜堿在發(fā)酵培養(yǎng)基中的含量為0.1-10g/L。本發(fā)明的甜菜堿可作為纈氨酸生產(chǎn)菌的甲基供體，用于調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的滲透壓、促進(jìn)脂肪代謝及蛋白質(zhì)合成等，此外還能夠刺激菌體生長(zhǎng)、促進(jìn)產(chǎn)酸等，添加甜菜堿進(jìn)行發(fā)酵后L-纈氨酸的產(chǎn)率高達(dá)67.3g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率高達(dá)27.5%，相對(duì)于未添加甜菜堿的發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵分別提高了8.5%和6.2%。
文檔編號(hào)C12R1/13GKCN103215322SQ201310127515
公開(kāi)日2013年7月24日 申請(qǐng)日期2013年4月12日
發(fā)明者邱博, 徐慶陽(yáng), 萬(wàn)紅兵, 歐陽(yáng)宇紅, 曹文杰, 江衍哲, 龍輝 申請(qǐng)人:北京輕發(fā)生物技術(shù)中心, 北京智睿先鋒技術(shù)中心, 天津科技大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan