專利名稱:羊痘病毒屬病毒等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)用引物、試劑盒和檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動(dòng)物疫病分子生物學(xué)檢驗(yàn)方法及檢驗(yàn)試劑領(lǐng)域，具體涉及一種羊痘病毒屬病毒等溫?cái)U(kuò)散技術(shù)快速檢測(cè)用引物、試劑及其檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
羊痘病毒屬病毒(Capripoxvirus, CPV)主要包括山羊痘病毒(GoatpoxVirus, GTPV)、綿羊痘病毒(Sheeppox Virus, SPPV)和牛挖瘡皮膚病病毒(Lumpy SkinDisease Virus，LSDV)三種，能引起山羊、綿羊和牛的皮膚、器官表面廣泛性結(jié)節(jié)和水腫，病畜產(chǎn)乳量急劇減少，皮毛品質(zhì)極大下降，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。山羊痘、綿羊痘病毒引起的羊痘又名羊“天花”，是羊的一種急性、熱性、接觸性傳染病。綿羊痘和山羊痘，被我國(guó)列為一類傳染病，對(duì)畜牧業(yè)養(yǎng)殖影響重大。據(jù)不同毒株的毒力差異，易感羊群的致死率可達(dá)10% 58%或75% 100%不等。羔羊致死率可達(dá)100%，妊娠母羊極易流產(chǎn)。同時(shí)，因自由貿(mào)易受到限制造成了國(guó)家稅收的下降，致使此病也成為了重要的經(jīng)濟(jì)疾病。該病呈世界性分布，我國(guó)近年來在如廣西、貴州、黑龍江、甘肅等地也有發(fā)生。牛疙瘩皮膚病病毒引起牛的疙瘩皮膚病，又稱牛結(jié)節(jié)性皮炎或塊狀皮膚病，是以患牛發(fā)熱、皮膚、黏膜、器官表面廣泛性結(jié)節(jié)，淋巴結(jié)腫大，皮膚水腫為特征的傳染病，能引起感染動(dòng)物消瘦，產(chǎn)乳量大幅度降低，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致死亡。被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列為必須通報(bào)的動(dòng)物疫病，感染率為5% 85%，病死率為10% ;我國(guó)目前尚無牛疙瘩皮膚病病毒流行的報(bào)導(dǎo)，國(guó)內(nèi)也無檢測(cè)該病的相關(guān)研究，然而本病在公共衛(wèi)生方面具有一定的意義，印度和斯堪的納維亞都有人類感染羊痘病毒的報(bào)道。在印度，管理患病動(dòng)物的人有的手和腿上發(fā)生紅色丘疹，繼而出現(xiàn)水皰并結(jié)痂，但未見有全身性的擴(kuò)散。張瑞陽等(2003)首次報(bào)道了我國(guó)人感染羊痘的病例，病人手指、口唇、面頰等部位出現(xiàn)丘疹。攜帶有病毒的牛羊肉存在使人患病的可能性，對(duì)于食品安全存在潛在的隱患，因此本發(fā)明的試劑盒和檢測(cè)方法在動(dòng)物商品及其食品的出入境的快速檢驗(yàn)檢疫中具有重大的意義。
痘病毒(Capripoxvirus, CPV)在分類上屬于痘病毒科(poxviridae)脊椎動(dòng)物痘病毒亞科(chordopoxrinae)中的羊痘病毒屬(Capripoxvirus)。羊痘病毒為磚形病毒，在細(xì)胞漿內(nèi)復(fù)制，其基因組為雙鏈DNA。其大小約為290nmX270nm，屬于較小的痘病毒，病毒粒子由I個(gè)核心、2個(gè)側(cè)體和2層脂質(zhì)外膜組成，羊痘病毒的衣殼為對(duì)稱型，有囊膜，囊膜內(nèi)含有病毒特異性蛋白。該病毒對(duì)干燥有較強(qiáng)的抵抗力，在干燥的痂皮內(nèi)可存活3-6個(gè)月，在干燥羊舍內(nèi)可存活6-8個(gè)月。反復(fù)凍融對(duì)其沒有明顯的滅活作用。對(duì)直射陽光、常用消毒藥(酒精、碘酒等)以及乙醚或氯仿較敏感。放線菌素-D和溴脂氧尿苷可抑制病毒復(fù)制。
山羊痘、綿羊痘和牛疙瘩皮膚病病毒很強(qiáng)的宿主特異性，自然條件下，不會(huì)發(fā)生交叉感染。本病毒對(duì)上 皮細(xì)胞有特殊親和力，因此無論通過哪種途徑進(jìn)入機(jī)體的病毒，最終都經(jīng)血液達(dá)到皮膚和粘膜，在上皮細(xì)胞內(nèi)增殖，引起一系列的炎癥過程而發(fā)生特異性的痘疹。山羊和綿羊均為易感動(dòng)物。本病多有病羊和含有羊痘病毒的皮屑隨風(fēng)和灰塵吸入呼吸道而感染，也可以通過損傷的皮膚及消化道傳染。丘疹中含大量病毒，黏膜上的丘疹破潰后可從鼻、口分泌物和淚液排泄病毒。病毒進(jìn)入乳汁、尿液和精液也可成為病毒傳播的重要來源。被病羊污染的用具、飼料、墊草，病羊的糞便、分泌物、皮毛和體外寄生蟲(如羊虱)都可以成為傳播媒介。該病以春秋兩季多發(fā)，主要在冬季春初流行，常呈地方性或廣泛流行。氣候嚴(yán)寒、雨雪、霜凍、枯草和飼養(yǎng)管理不良等因素都有助于本病的發(fā)生和加重病情。目前控制該病最有效的方法還是使用高效疫苗對(duì)易感動(dòng)物進(jìn)行免疫接種。
環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增基因技術(shù)(loop-mediatedisothermal amplication ,簡(jiǎn)稱LAMP)(國(guó)際專利公開號(hào)WO 00/28082)是2000年Notomi等開發(fā)出的一種核酸擴(kuò)增新技術(shù)，針對(duì)待測(cè)靶基因序列的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)一套兩對(duì)特異引物，利用鏈置換DNA聚合酶(Bst DNApolymerase)在65°C左右等溫條件下能夠特異性、高效、快速的進(jìn)行核酸擴(kuò)增,擴(kuò)增結(jié)果可直接對(duì)擴(kuò)增副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀通過肉眼進(jìn)行判斷或檢測(cè)其濁度，也可用結(jié)合雙鏈的熒光染料優(yōu)選SYBR Green I染色，即可通過肉眼判定。由于LAMP技術(shù)擴(kuò)增的兩對(duì)引物是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)段，因而具有比PCR更高的特異性，同時(shí)是等溫條件下即不需要PCR儀等特殊儀器，且樣品的前處理非常簡(jiǎn)單、單位時(shí)間內(nèi)擴(kuò)增效率更高等優(yōu)點(diǎn)，已引起人們的關(guān)注。
中國(guó)發(fā)明專利(申請(qǐng)?zhí)枮?200710030435.0,200710030437.X,200710132320.2、200710026389.7,200810052321.0,200810015001.8,200810093986.6,200910041358.8、200910251055.9,200910090037.7,201010555073.9,201110339104.X 等)分別公開了采用等溫?cái)U(kuò)增基因技術(shù)檢測(cè)病菌和動(dòng)物疫病的方法。但是，目前尚無利用等溫?cái)U(kuò)增基因技術(shù)檢測(cè)羊痘病毒屬病毒的試劑盒及檢測(cè)方法的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
為克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種羊痘病毒等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)用引物，第二個(gè) 目的是提供使用該引物的試劑盒，第三個(gè)目的是提供使用上述檢測(cè)用引物的試劑盒的使用方法。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
一種羊痘病毒屬病毒等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)用試劑盒，包括擴(kuò)增反應(yīng)液管、鈣黃綠素顯色劑管、陽性對(duì)照管、陰性對(duì)照管和滅菌去離子水管，其中:
所述擴(kuò)增反應(yīng)液管管內(nèi)由以下反應(yīng)液組成:
序列為SEQ ID NOl的60 mmol/L的羊痘病毒內(nèi)引物上游1.0 μ L ；
序列為SEQ ID Ν02的60 mmol/L的羊痘病毒內(nèi)引物下游1.0 μ L ；
序列為SEQ ID Ν03的5 mmol/L的羊痘病毒外引物上游1.0 μ L ；
序列為SEQ ID Ν04的5 mmol/L的羊痘病毒外引物下游1.0 μ L ；
2XLAMP buffer 緩沖液 12.5yL;
5U/ μ L Bst DNA 聚合酶 0.8 μ L ;
滅菌去離子水3.7yL;
合計(jì)21 μ L,為單次反應(yīng)的用量。
所述陽性對(duì)照管，管內(nèi)為羊痘病毒陽性重組質(zhì)粒DNA，體積為20 μ L。
所述陰性對(duì)照管，管內(nèi)為無羊痘病毒感染的健康牛上皮組織基因組DNA，體積為20 μ L0
所述鈣黃綠素顯色劑管，管內(nèi)體積為20μ L ;
所述滅菌去離子水管ImL 2mL。
一種羊痘病毒屬等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)方法:包括如下步驟:
I)制備待檢模板DNA:選用商品化的病毒DNA提取試劑盒，提取樣品中的羊痘病毒DNA,獲得待檢模板DNA ；
2)擴(kuò)增反應(yīng)體系為:21 μ L擴(kuò)增反應(yīng)液,I μ L |丐黃綠素顯色劑；3 μ L待檢模板DNA或陽性對(duì)照或陰性對(duì)照；反應(yīng)體系的總體積為25 μ L;
3)羊痘病毒的等溫?cái)U(kuò)增:將配制好的步驟2)中的擴(kuò)增反應(yīng)體系的PCR管于62 64°C恒溫反應(yīng)60min，80°C反應(yīng)IOmin終止反應(yīng)；
4)結(jié)果判定:反應(yīng)產(chǎn)物顯現(xiàn)綠色則為陽性，橙色則為陰性。
若上述步驟中不加入鈣黃綠素顯色劑時(shí)，其結(jié)果判定為:通過肉眼觀察鑒定，與陰性對(duì)照管比較顯示，檢測(cè)管出現(xiàn)明顯白色渾濁為陽性，未見渾濁為陰性。
本發(fā)明的原理是:針對(duì)一段200bp左右的靶序列上6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條引物(2條外引物和2條內(nèi)引物)，利用核酸分子在63°C左右的溫度下處于自然松散狀態(tài)，采用具有鏈置換作用的Bst DNA聚合酶，在恒溫條件下對(duì)目的基因進(jìn)行高效擴(kuò)增，經(jīng)15 45min的反應(yīng)，模板擴(kuò)增效率能達(dá)到IO9 101°倍。由于該反應(yīng)不需要高溫節(jié)鏈、退火等步驟，因此不需要昂貴的PCR儀。在反應(yīng)的Buffer反應(yīng)液里加入一種特殊的發(fā)光劑鈣黃綠素顯色劑，鈣黃綠素顯色劑本身是一種 發(fā)綠光的熒光，在本反應(yīng)中采用的鈣黃綠素顯色劑是被錳離子整合處理過的，不能發(fā)綠色熒光，一旦LAMP反應(yīng)發(fā)生，產(chǎn)生的大量焦磷酸根離子可競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合錳離子，釋放出鈣黃綠素顯色劑，導(dǎo)致反應(yīng)呈綠色，通過綠色熒光的產(chǎn)生也能判定反應(yīng)結(jié)果。這種比較溫和的溫度條件以及沒有溫度循環(huán)使所需儀器簡(jiǎn)單化，克服了傳統(tǒng)PCR固有的檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、容易污染及檢測(cè)成本等缺點(diǎn)、此外，該檢測(cè)方法對(duì)檢測(cè)人員的技術(shù)素質(zhì)要求較低，實(shí)際操作極為簡(jiǎn)單，不需要特殊的試劑和儀器設(shè)備，有利于建立成本低廉的快速篩選體系。
LAMP是一種簡(jiǎn)便、快速、高度特異性的基因擴(kuò)增方法。將恒溫基因擴(kuò)增技術(shù)與PCR技術(shù)(包括熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù))進(jìn)行比較，可發(fā)現(xiàn)該技術(shù)在靈敏度、特異性和檢測(cè)范圍等指標(biāo)上相當(dāng)于或優(yōu)于PCR技術(shù)，且不依賴于任何專門的儀器設(shè)備即可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)高通量快速檢測(cè)，而且檢測(cè)成本遠(yuǎn)低于熒光定量PCR技術(shù)?，F(xiàn)有的羊痘病毒檢測(cè)周期較長(zhǎng)，約I 2天，操作繁瑣，而本發(fā)明的試劑盒僅需2小時(shí)。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是(I)、不需要特殊試劑與設(shè)備；(2)、高特異性:應(yīng)用六個(gè)區(qū)段，四條引物，根據(jù)是否擴(kuò)增就能判斷靶標(biāo)物質(zhì)的存在與否，陽性率可達(dá)于99.5%，假陽性率小于
0.1% ; (3)、快速、高效擴(kuò)增:檢測(cè)時(shí)間2小時(shí)左右；(4)、靈敏度高:擴(kuò)增模板僅需10拷貝或更少，最低檢測(cè)極限達(dá)到I個(gè)TCID5tl ;標(biāo)本的檢出率達(dá)到98.9% ; (5)、鑒定簡(jiǎn)便:通過肉眼觀察鑒定，無需電泳等其他任何分析步驟，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的Mg2+結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物一一焦磷酸鎂乳白沉淀，與熒光染料結(jié)合，陽性結(jié)果顯示為綠色，陰性結(jié)果為橙色，結(jié)果明顯可靠，可通過肉眼觀察鑒定；(6)、用途廣:可廣泛用于山羊、綿羊、牛的中羊痘病毒的安全快速檢測(cè)。


圖1陰陽性結(jié)果圖；
圖2特異性試驗(yàn)肉眼觀察結(jié)果；
圖3靈敏度試驗(yàn)電泳結(jié)果；
圖1中:A-白光下肉眼觀察，B-波長(zhǎng)312nm的紫外光下觀察；
圖2中:1_牛挖瘡皮膚病毒株Neethling vaccine Lff 1959, 2-牛挖瘡皮膚病毒株Neethling 2490,3-山羊痘病毒，4-綿羊痘病毒，5-牛布氏桿菌核酸，6-羊流產(chǎn)衣原體，7-肺炎衣原體，8-牛傳染性胸膜肺炎放線桿菌，9-?；蚪M，10-羊基因組，11-綠膿桿菌，12-大腸桿菌，13-沙門氏菌，14-志賀氏菌，15-金黃色葡萄球菌，16-陰性對(duì)照。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1，引物的設(shè)計(jì)及篩選
羊痘病毒屬病毒等溫?cái)U(kuò)增引物組，其設(shè)計(jì)是根據(jù)GenBank公布的山羊痘病毒、綿羊痘病毒以及牛疙瘩皮膚病病毒的參考序列，用Clustal W進(jìn)行多重比對(duì)，分析序列的保守區(qū)(119272bpSEQ ID NOl 代表的序列為:5’ 一CAAAACACAATAAAGGAACCAC— 3’
SEQ ID N02 代表的序列為:5’ 一AGAGATGGCGGTTGTGAT— 3’
SEQ ID N03代表的序列為:
5，—CCGAACTTGTTATTTCCTGTGCTTATAGTTGAAAGGATGATGAATATGGT— 3，
SEQ ID N04代表的序列為:
5，—TTCCCGTTCATTTTACAAGATGTCTTCATCATCTGAAAAGTTGTTTCG— 3，。
SEQ ID N05 代表的序列為:5’ 一CTACCATTAACTGTATTAGAT— 3’
SEQ ID N06 代表的序列為:5’ 一CAAATACAAGTGAGGCATCCT— 3’。
實(shí)施例2，陽性對(duì)照品的制備
用試劑盒核酸提取陽性羊痘病毒細(xì)胞培養(yǎng)物的DNA，電泳提取的核酸，采用PCR上游引物SEQ ID N05和PCR下游引物SEQ ID N06進(jìn)行擴(kuò)增，并使用膠回收試劑盒回收擴(kuò)增的條帶。按照1:10的比例和pmdl9載體進(jìn)行連接反應(yīng)，23°C連接2小時(shí)，轉(zhuǎn)化JM109菌，經(jīng)抗性選擇和PCR鑒定陽性后，再測(cè)序驗(yàn)證，利用分光光度計(jì)測(cè)定核酸的濃度，使其濃度控制在80 IOOng/ μ L,分裝為50 μ L每管。
實(shí)施例3，陰性對(duì)照品的制備
用試劑盒核酸提取無羊痘病毒感染的牛上皮組織的DNA，電泳提取的核酸，利用分光光度計(jì)測(cè)定核酸的濃度，使其濃度控制在80 IOOng/ μ L，分裝為50 μ L每管。
實(shí)施例4，羊痘病毒屬等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)方法:包括如下步驟:
I)制備待檢模板DNA:選用商品化的病毒DNA提取試劑盒，提取樣品中的羊痘病毒DNA,獲得待檢模板DNA ；
2)擴(kuò)增反應(yīng)體系為:21 μ L擴(kuò)增反應(yīng)液,I μ L |丐黃綠素顯色劑；3 μ L待檢模板DNA或陽性對(duì)照或陰性對(duì)照；反應(yīng)體系的總體積為25 μ L;
3)羊痘病毒的等溫?cái)U(kuò)增:將配制好的步驟2)中的擴(kuò)增反應(yīng)體系的PCR管于62 64°C恒溫反應(yīng)60min，80°C反應(yīng)IOmin終止反應(yīng)；
4)結(jié)果判定:反應(yīng)產(chǎn)物顯現(xiàn)綠色則為陽性，橙色則為陰性。
實(shí)施例5，步驟與實(shí)施例4基本相同，區(qū)別在于:在上述步驟2)中將I μ L鈣黃綠素顯色劑換為I μ L滅菌去離子水，其結(jié)果判定是:通過肉眼觀察鑒定，與陰性對(duì)照管比較顯示，檢測(cè)管出現(xiàn)明顯白色渾濁為陽性，未見渾濁為陰性。
參見圖1和圖2的結(jié)果顯示:圖1中A有渾濁的為陽性，用加號(hào)標(biāo)記，未見渾濁的為陰性用減號(hào)標(biāo)記；Β是在紫外光下的觀察結(jié)果，加號(hào)標(biāo)記為陽性，減號(hào)標(biāo)記為陰性。圖2中只有I 4號(hào)為羊痘病毒屬病毒所以有渾池現(xiàn)象,5 8、11 15為其他不屬于羊痘病毒屬的病毒因而未見渾濁現(xiàn)象，9和10號(hào)為牛羊的基因亦不含有羊痘病毒屬病毒，未見渾濁現(xiàn)象，16號(hào)為陰性對(duì)照。
實(shí)施例6，2 X LAMP buffer緩沖液的配制
40mmol/L三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl，Ph8，25°C)，20mmol/L氯化鉀，20mmol/L硫酸胺，體積百分比濃度為 1% TritonX-100,0.8mol/L Betaine, 7.5mmol/L 氯化鎂和1.2mm0l/L dNTP。各物質(zhì)的濃度滿足上述濃度要求即可構(gòu)成2XLAMP buffer緩沖液。
實(shí)施例7，試劑盒的組裝
將如上所配制的陽性對(duì)照、陰性對(duì)照、滅菌去離子水各一支、擴(kuò)增反應(yīng)液1.5mL/管，2支，鈣黃綠素顯色劑60 μ L/管一支放置于試劑盒的支架上，蓋好蓋子，貼上生產(chǎn)日期及產(chǎn)品標(biāo)簽，低溫保存及運(yùn)輸。
權(quán)利要求
1.一種羊痘病毒屬病毒等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)用試劑盒，其特征在于:它包括擴(kuò)增反應(yīng)液管、鈣黃綠素顯色劑管、陽性對(duì)照管、陰性對(duì)照管和滅菌去離子水管，其中: 所述擴(kuò)增反應(yīng)液管管內(nèi)由以下反應(yīng)液組成: DNA序列為SEQ ID N0.1的60 mmol/L的羊痘病毒內(nèi)引物上游1.0 μ L ； DNA序列為SEQ ID N0.2的60 mmol/L的羊痘病 毒內(nèi)引物下游1.0 μ L ； DNA序列為SEQ ID N0.3的5 mmol/L的羊痘病毒外引物上游1.0 μ L ； DNA序列為SEQ ID N0.4的5 mmol/L的羊痘病毒外引物下游1.0 μ L ； 2XLAMP 緩沖液 12.5μ L ；
5U/ μ L Bst DNA 聚合酶 0.8 μ L ; 滅菌去尚子水3.7 μ L ; 合計(jì)21 μ L,為單次反應(yīng)的用量； 所述陽性對(duì)照管，管內(nèi)為羊痘病毒陽性重組質(zhì)粒DNA，體積為20 μ L ; 序列為SEQ ID N0.5的PCR上游引物和序列為SEQ ID N0.6的PCR下游引物，PCR模板為標(biāo)準(zhǔn)陽性羊痘病毒細(xì)胞培養(yǎng)物的DNA，按常規(guī)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物與pmdl9載體進(jìn)行連接反應(yīng)獲得所述陽性重組質(zhì)粒DNA; 所述陰性對(duì)照管，管內(nèi)為無羊痘病毒感染的健康牛上皮組織基因組DNA，體積為20 μ L ； 所述鈣黃綠素顯色劑管，管內(nèi)體積為20μ L ; 所述滅菌去離子水管ImL 2mL ； 所述2 X LAMP緩沖液由以下成分組成: 40mmol/L三輕基甲基氨基甲燒鹽酸鹽,20mmol/L氯化鉀,20mmol/L硫酸胺,體積百分比濃度為 1% TritonX-100,0.8mol/L Betaine, 7.5mmol/L 氯化鎂和 1.2mmol/L dNTP。
2.一種羊痘病毒屬等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)非疾病診斷目的的快速檢測(cè)方法:包括如下步驟: 1)制備待檢模板DNA:選用商品化的病毒DNA提取試劑盒，提取樣品中的羊痘病毒DNA，獲得待檢模板DNA ； 2)擴(kuò)增反應(yīng)體系為:21μ L擴(kuò)增反應(yīng)液，I μ L鈣黃綠素顯色劑；3 μ L待檢模板DNA或陽性對(duì)照或陰性對(duì)照；反應(yīng)體系的總體積為25 μ L; 3)羊痘病毒的等溫?cái)U(kuò)增:將配制好的步驟2)中的擴(kuò)增反應(yīng)體系的PCR管于62 64°C恒溫反應(yīng)60min，80°C反應(yīng)IOmin終止反應(yīng)； 4)結(jié)果判定:反應(yīng)產(chǎn)物顯現(xiàn)綠色則為陽性，橙色則為陰性。
3.一種羊痘病毒屬等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)非疾病診斷目的的快速檢測(cè)方法:包括如下步驟: 1)制備待檢模板DNA:選用商品化的病毒DNA提取試劑盒，提取樣品中的羊痘病毒DNA，獲得待檢模板DNA ； 2)擴(kuò)增反應(yīng)體系為:21μ L擴(kuò)增反應(yīng)液，I μ L滅菌去離子水；3 μ L待檢模板DNA或陽性對(duì)照或陰性對(duì)照；反應(yīng)體系的總體積為25 μ L; 3)羊痘病毒的等溫?cái)U(kuò)增:將配制好的步驟2)中的擴(kuò)增反應(yīng)體系的PCR管于62 64°C恒溫反應(yīng)60min，80°C反應(yīng)IOmin終止反應(yīng)； 4)結(jié)果判定:通過肉眼觀察鑒定，與陰性對(duì)照管比較顯示，檢測(cè)管出現(xiàn)明顯白色渾濁為陽性，未見渾濁為陰性。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種基于LAMP等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)羊痘病毒屬病毒用引物、試劑盒及檢測(cè)方法。該試劑盒根據(jù)靶序列上6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條引物，2條外引物和2條內(nèi)引物，還包括2×LAMPbuffer緩沖液、BstDNA聚合酶管、陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和滅菌去離子水。利用本試劑盒在63℃左右的溫度下經(jīng)15～45min的反應(yīng)后，便可以根據(jù)肉眼觀察反應(yīng)結(jié)果判斷是否含有羊痘病毒屬病毒。本發(fā)明可以在等溫條件下快速、高效、特異性地?cái)U(kuò)增靶序列，且操作簡(jiǎn)便，不需要昂貴的儀器和試劑，可以憑肉眼判斷結(jié)果，對(duì)操作人員沒有技術(shù)上的要求，檢測(cè)成本低，檢測(cè)時(shí)間短。
文檔編號(hào)C12Q1/68GKCN102373302 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請(qǐng)?zhí)朇N 201110386925
公開日2013年8月21日 申請(qǐng)日期2011年11月29日
發(fā)明者李應(yīng)國(guó), 李賢良, 黃鶴, 聶福平, 王昱, 楊俊 申請(qǐng)人:重慶出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan