專(zhuān)利名稱(chēng):動(dòng)物Torque Teno病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動(dòng)物TTV試劑盒，屬于動(dòng)物疫病分子生物學(xué)檢測(cè)方法及檢測(cè)試劑領(lǐng)域，具體是一種用于動(dòng)物TTV病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明還應(yīng)用所述的試劑盒對(duì)動(dòng)物TTV病毒進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)的生物學(xué)檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
TTV( Torque Teno virus)病毒是一種無(wú)囊膜的單鏈環(huán)狀球形DNA病毒,現(xiàn)歸類(lèi)為圓環(huán)病毒科(Circoviridae)指環(huán)病毒屬(Anellovirus),包括兩種不同的血清型，即TTVl和TTV2。該病毒最早是1997年由日本學(xué)者Nishizawa等從I例輸血后非甲 非庚型肝炎病人血清中分離到的新型肝炎病毒，而以該病人的姓名縮寫(xiě)(TT)而命名。又因TTV與輸血傳播病毒(transfusion transmitted virus, TTV)巧合，因此許多學(xué)者亦將其稱(chēng)為輸血傳播病毒。我國(guó)于1998年6月，由中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院首次分離出中國(guó)株TTV。同年，湖南醫(yī)科大學(xué)附二院傳染科學(xué)者克隆出TTV部分基因序列。TTV在各類(lèi)人群中感染比例都非常高，研究報(bào)道，在亞洲、非洲和南美洲的正常獻(xiàn)血者中感染率為30 % 100 %。除了人可感染TTV以外，現(xiàn)已經(jīng)證實(shí)TTV感染宿主很廣，包括靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物(黑猩猩、類(lèi)人猿和猴)、家畜(豬、牛、羊、犬、貓、雞)和其它動(dòng)物(老鼠、樹(shù)駒和駱駝)。目前，還沒(méi)有證實(shí)TTV可以引發(fā)某種具體的疾病，但許多學(xué)者認(rèn)為T(mén)TV可能與人類(lèi)肝炎和豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PWMS)、豬繁殖與呼吸綜合征(PRRSV)等疾病病原存在協(xié)同作用。有相關(guān)的研究顯示:TTV在豬繁殖和呼吸系統(tǒng)綜合征、結(jié)核、人類(lèi)肝炎等疾病中陽(yáng)性檢出率相當(dāng)高。因此，TTV在動(dòng)物群中傳播對(duì)人類(lèi)的生活和健康存在一定的潛在威脅。同時(shí)豬肉等肉制食品在人們的日常食用中非常普遍，攜帶該病毒的肉制品對(duì)人的健康存在威脅，因而該病毒的檢測(cè)在出入境和食品安全檢驗(yàn)中起著重要的作用。
TTV在豬群中的感染呈世界性分布。全世界范圍內(nèi)的感染分布很廣泛，但不同國(guó)家的感染率卻有較大的差異，感染率分布在24% 100%之間。同時(shí)，相同國(guó)家的不同城市不同豬場(chǎng)TTV的感染率也有很大差異。例如:對(duì)我國(guó)廣東等7省的258份豬血樣的檢測(cè)結(jié)果表明:TTV感染率在24.1% 100%之間。相關(guān)研究還表明:TTV的不同血清型可發(fā)生混合感染。目前的流行病學(xué)研究表明TTV在人群中主要經(jīng)血液及其血液制品傳播。研究發(fā)現(xiàn)，唾液、糞便、膽汁、精液、乳汁、活組織甚至毛發(fā)、皮膚中均能檢測(cè)到該病毒。且較多文獻(xiàn)報(bào)道，TTV除經(jīng)血液途徑傳播外，還可經(jīng)母嬰途徑、性交途徑、糞-口途徑傳播，飛沫及經(jīng)胃腸道傳播。同時(shí)，相關(guān)的研究也表明，TTV還可通過(guò)胎盤(pán)和子宮垂直傳播。TTV在豬中的傳播方式可能有以下幾種:①通過(guò)口糞途徑傳播；②注射了被TTV污染的疫苗或者是注射是的交叉感染；③垂直感染。
由于該病毒首先在人群中發(fā)現(xiàn)，因此，現(xiàn)有的研究主要針對(duì)人的TTV較多。主要的檢測(cè)方法有普通PCR法、巢式PCR法、熒光定量PCR法、原位雜交、酶聯(lián)免疫吸附法等。如1997年，日本學(xué)者Nishizawa等(1997)根據(jù)N22基因序列首次建立巢式PCR(nested PCR)用于檢測(cè)TTV。何忠平等(2003)運(yùn)用Mullins等在HIV基因變異分型中建立的異源雙鏈泳動(dòng)分析法(HMA)快速檢測(cè)TTV基因型。Catherine等(2000)建立了檢測(cè)TTV的免疫印跡法，隨后國(guó)內(nèi)學(xué)者(邢培清，2002)以TTV ORF2蛋白為抗原，建立了檢測(cè)TTV的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)。血清PCR檢測(cè)雖為主要檢測(cè)手段，但其擴(kuò)增受實(shí)驗(yàn)條件、費(fèi)用高、假陽(yáng)性率高等因素的限制，不宜廣泛推廣；而血清學(xué)試驗(yàn)僅能反應(yīng)是否感染，并不能檢測(cè)病毒含量和分型檢測(cè)。因此，發(fā)明一種可以同時(shí)鑒別檢測(cè)動(dòng)物Torque Teno virus兩種不同血清型的檢測(cè)方法對(duì)研究我國(guó)豬群中動(dòng)物Torque Teno virus感染情況具有重要意義。國(guó)內(nèi)外在病原體的檢測(cè)方法，利用LAMP方法對(duì)多種動(dòng)物疫病和微生物檢測(cè)已有很多報(bào)告，但在獸醫(yī)臨床診斷方法，尚未見(jiàn)有動(dòng)物Torque Teno virus的LAMP診斷方法。
環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增基因技術(shù)(loop-mediatedisothermal amplication ,簡(jiǎn)稱(chēng)LAMP)(國(guó)際專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)WO 00/28082)是2000年Notomi等開(kāi)發(fā)出的一種核酸擴(kuò)增新技術(shù)，針對(duì)待測(cè)靶基因序列的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)一套兩對(duì)特異引物，利用鏈置換DNA聚合酶(Bst DNApolymerase)在65°C左右等溫條件下能夠特異性、高效、快速的進(jìn)行核酸擴(kuò)增,擴(kuò)增結(jié)果可直接對(duì)擴(kuò)增副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀通過(guò)肉眼進(jìn)行判斷或檢測(cè)其濁度，也可用結(jié)合雙鏈的熒光染料優(yōu)選SYBR Green I染色，即可通過(guò)肉眼判定。由于LAMP技術(shù)擴(kuò)增的兩對(duì)引物是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)段，因而具有比PCR更高的特異性，同時(shí)是等溫條件下即不需要PCR儀等特殊儀器，且樣品的前處理非常簡(jiǎn)單、單位時(shí)間內(nèi)擴(kuò)增效率更高等優(yōu)點(diǎn)，已引起人們的關(guān)注。
中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利(申請(qǐng)?zhí)枮?200710030435.0,200710030437.X,200710132320.2、200710026389.7,200810052321.0,200810015001.8,200810093986.6,200910041358.8、200910251055.9,200910090037.7,201010555073.9,201110339104.X 等)分別公開(kāi)了采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增基因技術(shù)檢測(cè)病菌和動(dòng)物疫病的方法。但是，目前尚無(wú)利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增基因技術(shù)檢測(cè)動(dòng)物Torque Teno virus的試劑盒及檢測(cè)方法的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提`供一種用于同步進(jìn)行動(dòng)物TTV的TTVl和TTV2兩種不同血清型的檢測(cè)和鑒別診斷的LAMP檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。
在本發(fā)明的LAMP擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)上，遵循環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的引物設(shè)計(jì)要求，設(shè)計(jì)針對(duì)動(dòng)物TTVl和TTV2的特異性引物，且保證在等溫?cái)U(kuò)增的條件下均能獲得較好的擴(kuò)增，且可同時(shí)鑒別兩種不同的血清型。因此，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是，即一種動(dòng)物TorqueTeno病毒LAMP檢測(cè)試劑盒，包括LAMP擴(kuò)增反應(yīng)液I管、LAMP擴(kuò)增反應(yīng)液II管、Calcein顯色劑管、陽(yáng)性對(duì)照管、陰性對(duì)照管和滅菌去離子水管。其中:
所述LAMP擴(kuò)增反應(yīng)液I管管內(nèi)由以下反應(yīng)液組成:
序列為SEQ ID N0.1 的 60 mmol/L 的 TTVl 內(nèi)引物上游 1.0 μ L ；
序列為SEQ ID N0.2 的 60 mmol/L 的 TTVl 內(nèi)引物下游 1.0 μ L ；
序列為SEQ ID N0.3 的 5 mmol/L 的 TTVl 外引物上游 1.0 μ L ；
序列為SEQ ID N0.4 的 5 mmol/L 的 TTVl 外引物下游 1.0 μ L ；
10 X LAMP 緩沖液 12.5 μ L ;
5U/ μ L Bst DNA 聚合酶 0.8 μ L ;
滅菌去離子水3.7yL;[0017]合計(jì)21 μ L，為單次反應(yīng)的用量。
所述LAMP擴(kuò)增反應(yīng)液II管管內(nèi)由以下反應(yīng)液組成:
序列為SEQ ID N0.5 的 60 mmol/L 的 TTV2 內(nèi)引物上游 1.0 μ L ；
序列為SEQ ID N0.6 的 60 mmol/L 的 TTV2 內(nèi)引物下游 1.0 μ L ；
序列為SEQ ID N0.7 的 5 mmol/L 的 TTV2 外引物上游 1.0 μ L ；
序列為SEQ ID N0.8 的 5 mmol/L 的 TTV2 外引物下游 1.0 μ L ；
10 X LAMP buffer 緩沖液 12.5 μ L ;
5U/ μ L Bst DNA 聚合酶 0.8 μ L ;
滅菌去離子水3.7yL;
合計(jì)21 μ L，為單次反應(yīng)的用量。
所述陽(yáng)性對(duì)照管 管內(nèi)為T(mén)TVl和TTV2陽(yáng)性重組質(zhì)粒，比例為1:1，體積為20 μ L ;
TTVl陽(yáng)性重組質(zhì)粒為pMD19-T-G，其DNA序列為SEQ ID N0.9 ；
TTV2 陽(yáng)性重組質(zhì)粒為 pMD19-T-S，其 DNA 序列為 SEQ ID N0.10。
所述陰性對(duì)照管管內(nèi)為豬Torque Teno病毒陰性的豬血清，體積約50 μ L。
所述Calcein顯色劑管管內(nèi)體積約20yL。
所述滅菌去離子水管ImL 2mL。
動(dòng)物Torque Teno病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)方法，包括如下步驟；
(I)樣品中核酸模板的提取:取200 μ L 300 μ L或200mg 300mg待檢樣品，可選用相應(yīng)的市售商品化核酸提取試劑盒或?qū)嶒?yàn)室常規(guī)使用的提取病毒核酸的方法提取樣品中的DNA，即為核酸模板。
(2)LAMP反應(yīng)體系:取3 μ L核酸模板或陽(yáng)性對(duì)照或陰性對(duì)照，分別加入LAMP擴(kuò)增反應(yīng)液I或LAMP擴(kuò)增反應(yīng)液II 21yL，Calcein顯色劑I μ L，反應(yīng)體系的總體積為25 μ L。
(3) LAMP擴(kuò)增條件:將步驟(2)配制好的反應(yīng)體系的PCR管于65 °C恒溫反應(yīng)60min，80°C終止反應(yīng)。
(4)結(jié)果判定:通過(guò)LAMP Real Time Turbidimeter LA-320儀進(jìn)行實(shí)時(shí)觀察:陽(yáng)性擴(kuò)增在30min內(nèi)可見(jiàn)明顯的實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線和濁度擴(kuò)增曲線，陰性無(wú)任何擴(kuò)增；或者，反應(yīng)產(chǎn)物顯現(xiàn)綠色則為陽(yáng)性，橙色則為陰性；或者，通過(guò)肉眼觀察鑒定，與陰性對(duì)照管比較顯示，檢測(cè)管出現(xiàn)明顯渾濁為陽(yáng)性，未見(jiàn)渾濁為陰性。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是:1、本發(fā)明可以快速地對(duì)待檢樣品是否感染豬TTV進(jìn)行鑒定和鑒另IJ，具有較高的靈敏度。在引物設(shè)計(jì)上，選擇TTVl (AY823990.1)和TTV2(AY823991.1)已知核酸序列，并通過(guò)文獻(xiàn)檢索、多重對(duì)比等方法對(duì)收集到的核酸序列進(jìn)行了篩選。通過(guò)反復(fù)試驗(yàn)，排除了有非特異性擴(kuò)增的引物，最后選定SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4 引物，SEQ ID N0.5,SEQ ID N0.6,SEQ ID N0.7 和 SEQ ID N0.8 引物分別作為T(mén)TVl和TTV2的鑒定引物。并通過(guò)優(yōu)化LAMP反應(yīng)條件等，可高靈敏度地對(duì)豬TTVl和TTV2進(jìn)行鑒定。
2、本發(fā)明提供的擴(kuò)增試劑均經(jīng)試驗(yàn)反復(fù)驗(yàn)證和優(yōu)化，具有市場(chǎng)上同類(lèi)LAMP等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒相應(yīng)優(yōu)點(diǎn)。具有:(1)、不需要特殊試劑與設(shè)備；(2)、高特異性:應(yīng)用六個(gè)區(qū)段，四條引物，根據(jù)是否擴(kuò)增就能判斷靶標(biāo)物質(zhì)的存在與否，陽(yáng)性率可達(dá)于99.9%，假陽(yáng)性率小于0.1%; (3)、快速、高效擴(kuò)增:檢測(cè)時(shí)間2小時(shí)左右；(4)、靈敏度高:擴(kuò)增模板僅需100.0pg/mL或更少，血清樣本中DNA最低檢測(cè)極限達(dá)到50.0pg/mL ;標(biāo)本的檢出率達(dá)到99% ; (5)、鑒定簡(jiǎn)便:無(wú)需電泳等其他任何分析步驟，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的Mg2+結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物一一焦磷酸鎂乳白沉淀，與Calcein顯色劑結(jié)合，陽(yáng)性結(jié)果顯示為綠色，陰性結(jié)果為橙色，結(jié)果明顯可靠，可通過(guò)肉眼觀察鑒定；(6)、用途廣:可廣泛用于動(dòng)物TTV的安全快速檢測(cè)。
3、特異性好:本發(fā)明對(duì)圓環(huán)病毒屬其它病毒DNA無(wú)擴(kuò)增，假陽(yáng)性率低。
4、靈敏度高:本發(fā)明對(duì)豬血清樣本中TTVl和TTV2檢測(cè)的最低檢測(cè)量分別約為50.0pg/mL和 60.0pg/mL。


圖1豬TTVl LAMP擴(kuò)增特異性試驗(yàn)結(jié)果；
圖2豬TTVl LAMP擴(kuò)增靈敏性試驗(yàn)結(jié)果；
圖3陰陽(yáng)性對(duì)照LAMP擴(kuò)增結(jié)果；
圖中:A-實(shí)時(shí)擴(kuò)增濁度曲線，B-實(shí)時(shí)擴(kuò)增速率曲線，C-擴(kuò)增柱型分析圖；
圖1中:1-豬TTVl病毒DNA，2-豬TTV2病毒DNA，3-豬細(xì)小病毒(CPV)，4-豬圓環(huán)病毒II型(PCV-1I)，5-豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌(APP)，6-豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)，7-豬繁殖與呼吸綜合征病毒VR-2332株，8-陰性對(duì)照；
圖 2 中:1-0.5 X lO'g/mLTTVl DNA, 2-0.5 X l(T2ug/mLTTVl DNA, 3-0.5 X 10_3ug/mLTTVl DNA, 4-0.5 X 10_4ug/mLTTVl DNA, 5_0.5 X 10_5ug/mLTTVl DNA, 6_0.5 X 10_6ug/mLTTVl DNA，7、0.5Xl(T7ug/mLTTVl DNA，8-陰性對(duì)照;圖3中:D-豬TTVl陽(yáng)性，E-豬TTV2陽(yáng)性，F(xiàn)-陰性對(duì)照。
具體實(shí)施方式
下面提供具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明的技術(shù)方下面提供具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明的技術(shù)方案，但本發(fā)明技術(shù)的應(yīng)用不限于實(shí)施例。
實(shí)施列1、動(dòng)物Torque Teno病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)試劑盒包括LAMP擴(kuò)增反應(yīng)液I管、LAMP擴(kuò)增反應(yīng)液II管、Calcein顯色劑管、陽(yáng)性對(duì)照管、陰性對(duì)照管和滅菌去離子水管，其中:
LAMP擴(kuò)增反應(yīng)液I管管內(nèi)由以下反應(yīng)液組成:序列為SEQ ID N0.1的5 mmol/L的TTVl內(nèi)引物上游LOyL ;序列為SEQ ID N0.2的5 mmol/L的TTVl內(nèi)引物下游1.0μ L ;序列為SEQ ID N0.3的60 mmol/L的TTVl外引物上游LOyL ;序列為SEQ ID N0.4的 60 mmol/L 的 TTVl 外引物下游 1.0 μ L ; 10 X LAMP 緩沖液 12.5μ L ；5U/y L Bst DNA 聚合酶0.8 μ L ;滅菌去離子水3.7 μ L ;合計(jì)21 μ L，為單次反應(yīng)的用量。
LAMP擴(kuò)增反應(yīng)液II管管內(nèi)由以下反應(yīng)液組成:序列為SEQ ID N0.5的5 mmol/L的TTV2內(nèi)引物上游LOyL ;序列為SEQ ID N0.6的5 mmol/L的TTV2內(nèi)引物下游1.0μ L ;序列為SEQ ID N0.7的60 mmol/L的TTV2外引物上游LOyL ;序列為SEQ ID N0.8的 60 mmol/L 的 TTV2 外引物下游 1.0 μ L ； 10 X LAMP buffer 緩沖液 12.5μ L ；5U/y L BstDNA聚合酶0.8 μ L ;滅菌去離子水3.7 μ L ;合計(jì)21 μ L，為單次反應(yīng)的用量。
其中10XLAMP buffer緩沖液由以下成分組成:40mmol/L三輕基甲基氨基甲燒鹽酸鹽；20 mmol/L氯化鉀；20 mmol/L硫酸胺;體積百分比濃度為1% Tritonx-100 ；0.8mol/L Betaine ；7.5mmol/L氯化鎂；1.2mmol/L dNTP。上述濃度為溶液終濃度。
陽(yáng)性對(duì)照管管內(nèi)為豬TTVl和豬TTV2陽(yáng)性重組質(zhì)粒，比例為1: 1，體積為20 μ L ;豬TTVl陽(yáng)性重組質(zhì)粒PMD19-T-G的DNA序列為SEQ ID N0.9 ;豬TTV2陽(yáng)性重組質(zhì)粒PMD19-T-S 的 DNA 序列為 SEQ ID N0.10。
陰性對(duì)照管管內(nèi)為豬Torque Teno病毒陰性的豬血清，體積約50 μ L。
所述Calcein顯色劑管管內(nèi)體積約20 μ L。
所述滅菌去離子水管ImL 2mL。
實(shí)施例2、本發(fā)明引物的設(shè)計(jì)及篩選
根據(jù)已知的TTVl (AY823990.1)和TTV2 (AY823991.1)核酸序列的基因組全長(zhǎng)序列，利用應(yīng)用ClustW軟件進(jìn)行多重比對(duì),用LAMP引物設(shè)計(jì)軟件Primer Explorer V4.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物，分別標(biāo)記為=SEQ ID N0.1……SEQ ID N08.。所有引物均由寶生物工程(大連)有限公司合成。用市售病毒核酸提取試劑盒提取TTV病毒DNA，擴(kuò)增，排除有非特異性擴(kuò)增的引物。獲得引物如下:
`
權(quán)利要求
1.動(dòng)物TorqueTeno病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)試劑盒，其特征在于:它包括LAMP擴(kuò)增反應(yīng)液I管、LAMP擴(kuò)增反應(yīng)液II管、Calcein顯色劑管、陽(yáng)性對(duì)照管、陰性對(duì)照管和滅菌去離子水管，其中: 所述LAMP擴(kuò)增反應(yīng)液I管管內(nèi)由以下反應(yīng)液組成: 序列為SEQ ID N0.1的60 mmol/L的TTVl內(nèi)引物上游1.0 μ L ； 序列為SEQ ID N0.2的60 mmol/L的TTVl內(nèi)引物下游1.0 μ L ； 序列為SEQ ID N0.3的5 mmol/L的TTVl外引物上游1.0 μ L ； 序列為SEQ ID N0.4的5 mmol/L的TTVl外引物下游1.0 μ L ； 10XLAMP buffer 緩沖液 12.5μ L ；
5U/ μ L Bst DNA 聚合酶 0.8 μ L ; 滅菌去尚子水3.7 μ L ; 合計(jì)21 μ L,為單次反應(yīng)的用量； 所述LAMP擴(kuò)增反應(yīng)液II管管內(nèi)由以下反應(yīng)液組成: 序列為SEQ ID N0.5的60 mmol/L的TTV2內(nèi)引物上游1.0 μ L ；` 序列為SEQ ID N0.6的60 mmol/L的TTV2內(nèi)引物下游1.0 μ L ； 序列為SEQ ID N0.7的5 mmol/L的TTV2外引物上游1.0 μ L ； 序列為SEQ ID N0.8的5 mmol/L的TTV2外引物下游1.0 μ L ； 10XLAMP 緩沖液 12.5μ L ；
5U/ μ L Bst DNA 聚合酶 0.8 μ L ; 滅菌去尚子水3.7 μ L ; 合計(jì)21 μ L,為單次反應(yīng)的用量； 所述陽(yáng)性對(duì)照管管內(nèi)為T(mén)TVl和TTV2陽(yáng)性重組質(zhì)粒，比例為1: 1，體積為20 μ L ; TTVl陽(yáng)性重組質(zhì)粒為pMD19-T-G，其DNA序列為SEQ ID N0.9 ； TTV2陽(yáng)性重組質(zhì)粒為pMD19-T-S，其DNA序列為SEQ ID N0.10 ； 所述陰性對(duì)照管管內(nèi)為豬Torque Teno病毒陰性的豬血清，體積約50 μ L ; 所述Calcein顯色劑管管內(nèi)體積約20 μ L ; 所述滅菌去離子水管ImL 2mL。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述動(dòng)物TorqueTeno病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)試劑盒，其特征在于:所述10XLAMP緩沖液由以下成分組成: 40mmol/L三輕基甲基氨基甲燒鹽酸鹽；20 mmol/L氯化鉀；20 mmol/L硫酸胺；體積百分比濃度為 1% Tritonx-100 ；0.8mol/L Betaine ;7.5mmol/L 氯化鎂;1.2mmol/L dNTP。
3.利用權(quán)利要求
1所述試劑盒進(jìn)行動(dòng)物TorqueTeno病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的非疾病診斷目的的快速檢測(cè)方法，包括如下步驟； (1)樣品中核酸模板的提取:取200μ L 300 μ L或200mg 300mg待檢樣品，可選用相應(yīng)的市售商品化核酸提取試劑盒或?qū)嶒?yàn)室常規(guī)使用的提取病毒核酸的方法提取樣品中的DNA，即為核酸模板； (2)LAMP反應(yīng)體系:取3μ L核酸模板或陽(yáng)性對(duì)照或陰性對(duì)照，分別加入LAMP擴(kuò)增反應(yīng)液I或LAMP擴(kuò)增反應(yīng)液II 21 μ L，Calcein顯色劑I μ L，反應(yīng)體系的總體積為25 μ L; (3)LAMP擴(kuò)增條件:將步驟(2)配制好的反應(yīng)體系的PCR管于65°C恒溫反應(yīng)60min，80°C終止反應(yīng)；
(4)結(jié)果判定:通過(guò)LAMP Real Time Turbidimeter LA-320儀進(jìn)行實(shí)時(shí)觀察:陽(yáng)性擴(kuò)增在30min內(nèi)可見(jiàn)明顯的實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線和濁度擴(kuò)增曲線，陰性無(wú)任何擴(kuò)增；或者，反應(yīng)產(chǎn)物顯現(xiàn)綠色則為陽(yáng)性，橙色則為陰性；或者，通過(guò)肉眼觀察鑒定，與陰性對(duì)照管比較顯示，檢測(cè)管出現(xiàn)明顯渾濁為陽(yáng)性，未見(jiàn)渾濁為陰性。
專(zhuān)利摘要
本發(fā)明設(shè)涉及動(dòng)物疫病分子生物學(xué)檢測(cè)方法及檢測(cè)試劑領(lǐng)域，具體涉及一種動(dòng)物Torque Teno病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)用引物、試劑盒及其檢測(cè)方法。本發(fā)明根據(jù)動(dòng)物Torque Teno病毒的兩種不同血清型基因序列，用ClustalW進(jìn)行多重比對(duì)，分析序列的保守區(qū)，采用LAMP引物設(shè)計(jì)軟件，分別設(shè)計(jì)內(nèi)引物和外引物，均可特異性的實(shí)現(xiàn)快速對(duì)TTV1和TTV2血清型的檢測(cè)與鑒別。本發(fā)明公開(kāi)了一種快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便、設(shè)備要求低、省時(shí)省力并且易于觀察結(jié)果的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)對(duì)TorqueTeno病毒進(jìn)行檢測(cè)的方法，沒(méi)有復(fù)雜的后處理，適用性廣。
文檔編號(hào)C12Q1/68GKCN102367493 B發(fā)布類(lèi)型授權(quán) 專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)朇N 201110375835
公開(kāi)日2013年9月11日 申請(qǐng)日期2011年11月23日
發(fā)明者聶福平, 聶奎, 李應(yīng)國(guó), 王國(guó)民, 黃鶴, 楊俊 , 肖進(jìn)文, 李賢良, 吳曉薇, 王昱, 向海洋 申請(qǐng)人:重慶出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心, 聶福平導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專(zhuān)利引用 (3), 非專(zhuān)利引用 (4),