專利名稱:配子體克隆法繁育巨藻幼苗新方法
技術(shù)領(lǐng)域：
:
本發(fā)明屬于藻類繁殖技術(shù)，具體地涉及一種配子體克隆法繁育巨藻幼苗新方法。
背景技術(shù)：
:
巨藻被認(rèn)為是進(jìn)行海底植被恢復(fù)的首選大型藻類。巨藻由于體積龐大，生長速度極快，特別適合作為人工魚 礁的“配套藻林”來改善近海生態(tài)環(huán)境，我國原無巨藻分布，1978年中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所采用低溫水運(yùn)的方法從墨西哥成功地引進(jìn)了一種巨藻(Macrocystis pyrifera)幼藻和配子體。研究人員通過對巨藻養(yǎng)殖生物學(xué)研究,結(jié)合我國海況條件的特點(diǎn)，建立了巨藻人工育苗和養(yǎng)殖技術(shù)體系，夏苗培育達(dá)到一定的數(shù)量，建立了筏式養(yǎng)殖技術(shù)。然而，受苗種繁育技術(shù)的限制，一些苗種培育過程中的關(guān)鍵性的問題沒有有效的解決，因而不能獲得足量優(yōu)質(zhì)的苗種。王廣策等發(fā)明了“用配子體克隆法繁育能源海藻-巨藻孢子體的方法”(專利申請?zhí)?200510046473.6,公開號:1865433)，該發(fā)明通過把配子體粉碎后對粉碎液進(jìn)行培育并進(jìn)一步擴(kuò)繁獲得大量雌雄配子體，雌雄配子體混合受精培養(yǎng)兩周后獲得巨藻孢子體，盡管該發(fā)明文本中記載在兩周后有85-90%的配子體發(fā)育成孢子體，但在實(shí)際培養(yǎng)過程中，雌雄配子體混合受精后3-10周內(nèi)將有大量孢子體死亡，10周以后巨藻孢子體基本穩(wěn)定，養(yǎng)殖海區(qū)溫度適宜即可下海養(yǎng)殖，該發(fā)明的技術(shù)方案沒有公開3-10周的培養(yǎng)條件，并且該發(fā)明的技術(shù)方案通過對配子體粉碎后進(jìn)行擴(kuò)繁配子體，粉碎液中含有破碎細(xì)胞等及其它雜質(zhì)影響擴(kuò)繁的配子體質(zhì)量，盡管通過進(jìn)一步擴(kuò)繁，但是最后能夠獲得的優(yōu)質(zhì)孢子體數(shù)量有限，不能滿足大規(guī)模養(yǎng)殖的需要。

發(fā)明內(nèi)容
:
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種配子體克隆法繁育巨藻幼苗新方法，以解決優(yōu)質(zhì)巨藻幼苗不足，不能夠滿足養(yǎng)殖需要的問題。
本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
一種配子體克隆法繁育巨藻幼苗新方法，包括以下步驟:
(I)克隆與擴(kuò)繁當(dāng)游孢子發(fā)育到配子體階段時，利用毛細(xì)管分離技術(shù)在顯微鏡下將一個雌細(xì)胞和一個雄細(xì)胞分別從雌雄配子體中分離，再利用克隆無性繁殖技術(shù)對雌雄細(xì)胞進(jìn)行克隆，分別培育雌雄細(xì)胞使其發(fā)育成雌雄配子體并將配子體進(jìn)行擴(kuò)繁；
(2)受精當(dāng)雌雄配子體團(tuán)各擴(kuò)繁至直徑大于3毫米的細(xì)胞團(tuán)時，將形成的細(xì)胞團(tuán)分別用細(xì)胞搗碎機(jī)搗碎，將雌雄配子體進(jìn)行混合，培育兩周后雌雄配子體分別釋放卵子和精子，自發(fā)受:精；
(3)巨藻孢子體培育受精后的合子放進(jìn)營養(yǎng)鹽中進(jìn)行培育，并控制溫度和光照強(qiáng)度；受精后1-4周營養(yǎng)鹽為在滅菌的海水中KNO3 (1.8-2.4) X10^4mol / L，KH2PO4(1.8-2.4) Xl(T5mol / L，受精后 5-10 周營養(yǎng)鹽為 KNO3 (2.8-3.2) X 10_4mol / L, KH2PO4(2.8-3.2) X10_5mol / L;受精后1-4周溫度控制在8-11 °C，受精后5-10周溫度控制在17-19。。;光照強(qiáng)度為:受精后1-2周10-20 μ E mY1 ;受精后3-4周20-40 μ E m、-1 ;受精后 5-10 周 40-80 μ E m 2S、
進(jìn)一步，所述的步驟I對克隆的雌雄細(xì)胞培育過程中溫度保持在8°C，光照強(qiáng)度為20-40 μ E HT2s-1,營養(yǎng)鹽為在滅菌海水中:ΚΝ031.2Xl(T4mol / L, KH2PO4L 2 X 10_5mol / L。
進(jìn)一步，所述的步驟I擴(kuò)繁過程中的溫度在10-15°c，照強(qiáng)度為20-40 μ E πΓ2^，營養(yǎng)鹽為=KNO3 (1.2-1.8) ΧΙΟΛιοΙ / L，KH2PO4 (1.2-1.8) X l(T5mol / L，每周更換一次。
進(jìn)一步，所述的巨藻孢子體培育過程中，受精后1-4周營養(yǎng)鹽每周更換一次，受精后5-10周營養(yǎng)鹽每周更換兩次。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的有益效果:
(I)制種所用時間短。受精過程及溫度和光照的控制通過人工操作而實(shí)現(xiàn)，大大縮短了苗種生長的周期，提高了苗種的質(zhì)量和產(chǎn)量。受精后經(jīng)過4周培養(yǎng)即可生成巨藻孢子體，10周后即可達(dá)到出苗規(guī)格。
(2)制種費(fèi)用低廉。制種過程中所需的海水只需要煮沸消毒即可，營養(yǎng)鹽純度采用分析純規(guī)格，利用低溫展示柜來控制溫度，通過增減白熾燈管的數(shù)量來控制光照強(qiáng)度。步驟操作簡單可行，培養(yǎng)費(fèi)用低廉。
(3)制種過程采用毛細(xì)管分離單細(xì)胞技術(shù)，通過克隆無性繁殖技術(shù)獲得質(zhì)量較高的配子體，在后續(xù)的擴(kuò)培中能得到大量的雌雄配子體，產(chǎn)苗量大，苗種質(zhì)量高?？寺〕龅木拊逍℃咦芋w可達(dá)每厘米棕繩10-16棵，完全符合正常育苗密度。
(4)制種過程不受種苗和環(huán)境條件的制約。利用克隆無性繁殖技術(shù)對雌雄配子體進(jìn)行擴(kuò)增，制種過程無需大量的野生藻株，通過實(shí)驗(yàn)室人工條件控制環(huán)境，過程不受種苗和環(huán)境條件的制約。
(5)生態(tài)意義重大。制種過程無須大量野生巨藻，即保護(hù)了野生巨藻的種質(zhì)資源，又可以在近海產(chǎn)出大量海底森林，對近海生態(tài)的修復(fù)和維護(hù)起到重要的作用。

:
圖1巨藻的雌雄配子體團(tuán):A早為克隆培養(yǎng)的雌配子體團(tuán)；B ^為克隆培養(yǎng)的雄配子體團(tuán)。
圖2.雌雄配子的受精過程以及孢子體的前期發(fā)育:A，排放卵細(xì)胞；B，精卵細(xì)胞受精；C，受精后細(xì)胞拉長；D細(xì)胞橫向與縱向分裂；E形成的孢子體。
圖310周后的巨藻孢子體。
具體實(shí)施方式
:
下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的解釋。
一種配子體克隆法繁育巨藻幼苗新方法，包括以下步驟:
(I)克隆與擴(kuò)繁當(dāng)游孢子發(fā)育到配子體階段時，利用毛細(xì)管分離技術(shù)在顯微鏡下將一個雌細(xì)胞和一個雄細(xì)胞分別從雌雄配子體中分離，再利用克隆無性繁殖技術(shù)對雌雄細(xì)胞進(jìn)行克隆，分別培育雌雄細(xì)胞使其發(fā)育成雌雄配子體并將配子體進(jìn)行擴(kuò)繁；克隆的雌雄細(xì)胞培育過程中溫度保持在8°C，光照強(qiáng)度為ZO-^yEnT2iT1,營養(yǎng)鹽為在滅菌海水中:KNO3L 2X10_4mol / L，KH2PO4L 2X 10_5mol / L ;在擴(kuò)繁過程中的最佳環(huán)境條件為:溫度保持在10-15°C，光照強(qiáng)度為20-40 μ E IrT2iT1,營養(yǎng)鹽為在滅菌海水中:KNO3L 2-1.8X ΙΟΛιοΙ / L, KH2PO4L 2_1.8 X l(T5mol / L ；
(2)受精雌雄配子體擴(kuò)繁到一定量時，將形成的配子體團(tuán)分別用細(xì)胞搗碎機(jī)搗碎后，將雌雄配子體混合，培育兩周后雌雄配子體分別釋放卵子和精子，自發(fā)受精；
(3)巨藻孢子體培育受精后的合子放進(jìn)營養(yǎng)鹽中進(jìn)行培育，并控制溫度和光照強(qiáng)度；受精后1-4周營養(yǎng)鹽為在滅菌的海水中KNO3L 8-2.4 X10^4moI / L，KH2PO4L 8-2.4Xl(T5mol / L，每周更換一次；5-10 周 KN032.8-3.2 X 10_4mol / L,KH2P042.8-3.2X 10_5mol / L，每周更換兩次；受精后1_4周溫度控制在8_11°C，5_10周溫度控制在17-19。。;光照強(qiáng)度為:受精后1-2周，10-20 μ E mY1 ;受精后3-4周20-40 μ EHT2S-1 ;受精后 5-10 周 40-80 μ E nT2s'
實(shí)施例1
本實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行時間為2011年6月到2011年11月號。巨藻品種為MacrocystisPyrifera,6月份開始克隆繁殖雌雄配子體。
(I)克隆與擴(kuò)繁當(dāng)巨藻的游孢子發(fā)育到配子體階段時，在倒置顯微鏡下(顯微鏡為Nikon T1-U，倍數(shù)為100倍)，利用毛細(xì)管分離技術(shù)將一個雌細(xì)胞和一個雄細(xì)胞分別從雌雄配子體中分離，將分離的細(xì)胞分別放入加入營養(yǎng)鹽的IOOml無菌海水中進(jìn)行培養(yǎng)，操作時溫度和培養(yǎng)溫度保持在8°C，光照強(qiáng)度為20-40 μ E HT2s'營養(yǎng)鹽為在滅菌海水中:KNO3L 2X10_4mol / L，KH2PO4L 2X 10_5mol / L。雌雄細(xì)胞發(fā)育成雌雄配子體后繼續(xù)擴(kuò)繁。在擴(kuò)繁增殖過程中的環(huán)境條件為:溫度保持在10°C，光照強(qiáng)度為20-40 μ E HT2s'營養(yǎng)鹽為在滅菌海水中:ΚΝ031.2Xl(T4mol / L，KH2PO4L 2 X l(T5mol / L，每周更換一次;
(2)受精雌雄配子體分別擴(kuò)繁增殖20天后，當(dāng)雌雄配子體團(tuán)各擴(kuò)繁至直徑大于3毫米的細(xì)胞團(tuán)時，把雌雄配子體增殖形成的細(xì)胞團(tuán)分別用細(xì)胞搗碎機(jī)搗碎后，將雌雄配子體混合于1000毫升燒杯中培育，燒杯內(nèi)置棕繩制盤狀苗簾，培育兩周后雌雄配子體分別釋放卵子和精子，自發(fā)受精，受精后附著在苗簾上；
(3)巨藻孢子體培育將受精后的合子在棕繩附著基上進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中加入營養(yǎng)鹽，并控制溫度和光照強(qiáng)度；受精后1-4周營養(yǎng)鹽為在滅菌的海水中KNO3L 8X10_4mol / L，KH2PO4L 8 X 10_5mol / L，每周更換一次；5-10周營養(yǎng)鹽為在滅菌的海水中ΚΝ032.8X 10_4mol / L，ΚΗ2Ρ042.8 X 10_5mol / L，每周更換兩次；受精后1-4周溫度控制在8°C，5-10周溫度控制在17°C ;光照強(qiáng)度為:受精后1-2周10 μ E IrT2iT1 ;受精后3_4周20 μ E IrT2S-1 ;受精后5-10周40 μ EnT2S' 10周后，生成巨藻孢子體,長約1.5cm。
實(shí)施例2
本實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行時間為2011年7月到2011年12月號。巨藻品種為MacrocystisPyrifera，7月份開始克隆繁殖雌雄配子體。
(I)克隆與擴(kuò)繁當(dāng)巨藻的游孢子發(fā)育到配子體階段時在倒置顯微鏡下(顯微鏡為Nikon T1-U，倍數(shù)為100倍，)利用毛細(xì)管分離技術(shù)將一個雌細(xì)胞和一個雄細(xì)胞分別從雌雄配子體中分離，將分離的細(xì)胞分別放入加入營養(yǎng)鹽的IOOml無菌海水中分別培養(yǎng)，操作時溫度和培養(yǎng)溫度保持在7°C，光照強(qiáng)度為ZO-^yEnT2iT1,營養(yǎng)鹽為在滅菌海水中:KNO3L 5X10_4mol / L，KH2PO4L 5X 10_5mol / L。雌雄細(xì)胞發(fā)育成雌雄配子體后繼續(xù)擴(kuò)繁。在擴(kuò)繁增殖過程中的環(huán)境條件為:溫度保持在15°C，光照強(qiáng)度為20-30 μ E HT2s'營養(yǎng)鹽為在滅菌海水中:ΚΝ031.8Xl(T4mol / L，KH2PO4L 8 X l(T5mol / L，每周更換一次;[0034](2)受精雌雄配子體分別擴(kuò)繁增殖20天后，當(dāng)雌雄配子體團(tuán)各擴(kuò)繁至直徑大于3毫米的細(xì)胞團(tuán)時(圖1)，把雌雄配子體增殖形成的細(xì)胞團(tuán)分別用細(xì)胞搗碎機(jī)搗碎后，將雌雄配子體混合于1000毫升燒杯中培育，燒杯內(nèi)置棕繩制盤狀苗簾，培育兩周后雌雄配子體分別釋放卵子和精子，自發(fā)受精，受精后附著在苗簾上，受精及受精后發(fā)育為孢子體的過程如圖2所示；
(3)巨藻孢子體培育將受精后的合子在棕繩附著基上進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中加入營養(yǎng)鹽，并控制溫度和光照強(qiáng)度；受精后1-4周營養(yǎng)鹽為在滅菌的海水中KN032.4X 10_4mol / L，KH2P042.4X 10_5mol / L，每周更換一次；5-10 周營養(yǎng)鹽為在滅菌的海水中KN033.2X 10_4mol / L，ΚΗ2Ρ043.2 X 10_5mol / L，每周更換兩次；受精后1-4周溫度控制在11°C，5-10周溫度控制在19°C;光照強(qiáng)度為:受精后1-2周20 μ E IrT2iT1 ;受精后3_4周40 μ EnT2S4 ;受精后5-10周80 μ EnT2S' 10周后，生成巨藻幼苗,長約1.6cm (圖3)。
以上僅列舉幾個優(yōu)選的實(shí)施例，并非是對本發(fā)明作任何形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用尚屬揭示的技術(shù)內(nèi)容加以變更或改型為等同變化的等效實(shí)施例，但是凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明內(nèi)的技術(shù)實(shí)質(zhì)對以上實(shí)施例所作的任何簡單修改、等同變化與改型，仍屬 于本發(fā)明技術(shù)方案的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種配子體克隆法繁育巨藻幼苗新方法，其特征在于包括以下步驟: (1)克隆與擴(kuò)繁當(dāng)游孢子發(fā)育到配子體階段時，利用毛細(xì)管分離技術(shù)在顯微鏡下將一個雌細(xì)胞和一個雄細(xì)胞分別從雌雄配子體中分離，再利用克隆無性繁殖技術(shù)對雌雄細(xì)胞進(jìn)行克??；分別培育雌雄細(xì)胞使其發(fā)育成雌雄配子體并將配子體進(jìn)行擴(kuò)繁； (2)受精當(dāng)雌雄配子體團(tuán)各擴(kuò)繁至直徑大于3毫米的細(xì)胞團(tuán)時，將形成的細(xì)胞團(tuán)分別用細(xì)胞搗碎機(jī)搗碎，將雌雄配子體進(jìn)行混合，培育兩周后雌雄配子體分別釋放卵子和精子，自發(fā)受精； (3 )孢子體培育受精后的合子放進(jìn)營養(yǎng)鹽中進(jìn)行培育，并控制溫度和光照強(qiáng)度；受精后1-4 周營養(yǎng)鹽為在滅菌的海水中 KN03(1.8-2.4)Xl(T4mol / L, ΚΗ2Ρ04( 1.8_2.4) X 10_5mol /L，受精后5-10周營養(yǎng)鹽為在滅菌海水中KNO3 (2.8-3.2) X 10_4mol / L，KH2PO4(2.8-3.2) X10_5mol / L;受精后1-4周溫度控制在8-11 °C，受精后5-10周溫度控制在17-19℃;光照強(qiáng)度為:受精后1-2周10-20 μ Em、-1 ;受精后3-4周20-40 μ E mY1 ;受精后 5-10 周 40-80 μ E m 2S、
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于所述的步驟(I)對克隆的雌雄細(xì)胞培育過程中溫度保持在8°C，光照強(qiáng)度為20-40μΕ HT2iT1,營養(yǎng)鹽為在滅菌海水中:KNO3L 2X10_4mol / L，KH2PO4L 2 X l(T5mol / L。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于所述的步驟(I)擴(kuò)繁過程中的溫度在10-151:，光照強(qiáng)度為20-401^ HT2s-1,營養(yǎng)鹽為:在滅菌海水中ΚΝ03( 1.2-1.8)X 10_4mol /L, KH2PO4 (1.2-1.8) X10_5mol / L，每周更換一次營養(yǎng)鹽。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1-3任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述的巨藻孢子體培育過程中，受精后1-4周營養(yǎng)鹽每周更換一次，受精后5-10周營養(yǎng)鹽每周更換兩次。
專利摘要
一種配子體克隆法繁育巨藻幼苗新方法，利用毛細(xì)管分離技術(shù)在顯微鏡下將雌配子體上的一個雌細(xì)胞和雄配子體上的一個雄細(xì)胞分別分離下來，再利用克隆無性繁殖技術(shù)分別對雌細(xì)胞和雄細(xì)胞進(jìn)行克隆，使雌細(xì)胞和雄細(xì)胞分別長成雌雄配子體，將配子體繼續(xù)擴(kuò)繁。當(dāng)配子體擴(kuò)繁到一定量時，將形成的細(xì)胞團(tuán)用細(xì)胞搗碎機(jī)搗碎，將雌雄配子體進(jìn)行混合，2周后，雌雄配子體分別釋放卵子和精子，自發(fā)受精；受精后的合子放進(jìn)營養(yǎng)鹽中進(jìn)行培育；10周后長成1.5cm左右的幼苗。本發(fā)明的受精過程及溫度和光照的控制通過人工操作而實(shí)現(xiàn)，大大縮短了苗種生長的周期，同時利用毛細(xì)管分離技術(shù)從配子體中分離雌雄細(xì)胞進(jìn)行克隆培育，提高了苗種的質(zhì)量和產(chǎn)量，能夠滿足巨藻養(yǎng)殖，同時本發(fā)明方法繁育巨藻幼苗成本低廉。
文檔編號A01H4/00GKCN102487820 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請?zhí)朇N 201110373578
公開日2013年7月10日 申請日期2011年11月22日
發(fā)明者葉乃好, 范曉, 徐東, 張曉雯 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan