專利名稱:一種啟動(dòng)子BgIosP517、其制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種啟動(dòng)子，具體地，涉及一種來(lái)源于水稻的啟動(dòng)子。本發(fā)明還涉及含有該啟動(dòng)子的重組載體、含有該重組載體的重組細(xì)胞、轉(zhuǎn)化有所述啟動(dòng)子的愈傷組織、一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法、以及所述啟動(dòng)子的制備方法及用途。
背景技術(shù)：
啟動(dòng)子是基因的一個(gè)組成部分，通常位于結(jié)構(gòu)基因5’端上游，是RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合和開(kāi)始轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。啟動(dòng)子能夠指導(dǎo)全酶(holoenzyme)同模板正確結(jié)合,活化RNA聚合酶，啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄，從而控制基因表達(dá)(轉(zhuǎn)錄)的起始時(shí)間和表達(dá)的程度。在轉(zhuǎn)基因植物中，啟動(dòng)子是影響轉(zhuǎn)基因表達(dá)效率的重要因素之一，選擇高效率的啟動(dòng)子是高效率表達(dá)外源基因的關(guān)鍵。
根據(jù)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄模式可將其分為3類組成型啟動(dòng)子、組織或器官特異性啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。所謂組成型啟動(dòng)子是指在組成型啟動(dòng)子調(diào)控下，不同組織器官和發(fā)育階段的基因表達(dá)沒(méi)有明顯差異，因而稱之組成型啟動(dòng)子。雙子葉植物中最常使用的組成型啟動(dòng)子是花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S啟動(dòng)子。另一種高效的組成型啟動(dòng)子CsVMV是從木薯葉脈花葉病毒(cassava vein mosaic virus)中分離的。
人們高度重視從植物本身克隆組成型啟動(dòng)子。例如肌動(dòng)蛋白(actin)和泛素(ubiquitin)等基因的啟動(dòng)子已被克隆。用這些啟動(dòng)子代替CaMV 35S啟動(dòng)子，可以更有效地在單子葉植物中驅(qū)動(dòng)外源基因的轉(zhuǎn)錄。Naomi等分別從擬南芥的色氨酸合酶P亞基基因和植物光敏色素基因中克隆了相應(yīng)啟動(dòng)子，用其代替CaMV 35S啟動(dòng)子，在轉(zhuǎn)基因煙草中也取得了很好的表達(dá)效果(Plant biotechnology, 2002,19 (I) :19-26)。
單子葉植物基因中常見(jiàn)的啟動(dòng)子有Ubi啟動(dòng)子(Plant ubiquitin promoter) >Actin 啟動(dòng)子(Plant Actin promoter)和 Adh-I 啟動(dòng)子(Maize alcohol dehydrogenase
Ipromoter)。
Ubi啟動(dòng)子以其啟動(dòng)效率高、甲基化程度低、遺傳性狀穩(wěn)定等因素而倍受青睞。目前，已經(jīng)從很多泛素基因中分離得到啟動(dòng)子序列，例如玉米基因組中的Ubi-I啟動(dòng)子、水稻泛素RUBQ2啟動(dòng)子、擬南芥泛素啟動(dòng)子、向日葵泛素UbBl啟動(dòng)子、煙草泛素Ubi. U4啟動(dòng)子、馬鈴薯泛素Ubi7啟動(dòng)子、番茄泛素Ubil-I啟動(dòng)子、大麥泛素Mubl啟動(dòng)子，等等。玉米泛素Ubi-I啟動(dòng)子已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于玉米、小麥、水稻等單子葉植物中，水稻泛素RUBQ2啟動(dòng)子在水稻和甘蔗中也有較多的應(yīng)用。
Actin啟動(dòng)子1990年由康奈爾大學(xué)的McElroy等首次在水稻中發(fā)現(xiàn),屬于強(qiáng)組成型啟動(dòng)子。Actin啟動(dòng)子在單子葉禾本科中作用顯著，但是鄰近科屬的植物中的基因調(diào)控功能卻十分不理想。因此，許多相關(guān)研究通過(guò)其它單子葉植物尋找Actin啟動(dòng)子，并成功在香蕉、甜瓜、玉米和擬南芥中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)。Actin啟動(dòng)子由于對(duì)基因表達(dá)的強(qiáng)調(diào)控作用，在單子葉植物優(yōu)良性狀的轉(zhuǎn)基因中已經(jīng)得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。
Adh-I啟動(dòng)子調(diào)控乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase)基因，對(duì)植物在缺氧環(huán)境下乙醇脫氫酶的表達(dá)至關(guān)重要。Adh-I啟動(dòng)子對(duì)單子葉植物特別是谷類植物如水稻、燕麥和大麥，和少部分雙子葉植物如煙草，基因的調(diào)控功能比花椰菜花葉病毒CaMV 35S啟動(dòng)子提高10-50倍。Adh-I啟動(dòng)子主要應(yīng)用于單子葉植物，對(duì)絕大部分雙子葉植物基因表達(dá)的調(diào)控效果都很有限。
單子葉植物是被子植物的主要類群，單子葉植物中的禾本科、百合科、棕櫚科和天南星等，是非常重要的農(nóng)業(yè)作物。單子葉植物基因的強(qiáng)效啟動(dòng)子，能夠調(diào)控植物高效率表達(dá)具有特殊性狀的外源基因，對(duì)優(yōu)良作物的分子育種研究意義重大。
在強(qiáng)效啟動(dòng)子相關(guān)研究領(lǐng)域，發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證了許多單子葉植物的啟動(dòng)子。此外，雙子葉植物中的一些強(qiáng)效啟動(dòng)子如CsVMV啟動(dòng)子、番茄E8啟動(dòng)子、白藜蘆醇合酶基因Vstl啟動(dòng)子等高效啟動(dòng)子，在單子葉植物中也有很強(qiáng)的基因調(diào)控作用。
盡管已經(jīng)有上述已知的單子葉植物的啟動(dòng)子，本發(fā)明人通過(guò)對(duì)水稻基因組的深入研究，提供了一種新的來(lái)源于單子葉植物的啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子能夠用于調(diào)控單子葉植物甚至是雙子葉植物中目的基因表達(dá)，為研究單子葉植物和雙子葉植物中目的基因表達(dá)提供 了一種新的工具和選擇。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人經(jīng)過(guò)大量的試驗(yàn)和創(chuàng)造性的勞動(dòng),從水稻日本晴(Oryza sativa L. ssp.japonica cv. Nipponbare)中得到了一種啟動(dòng)子,并且本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn),該啟動(dòng)子不僅能夠調(diào)控單子葉植物(例如水稻)中目的基因的表達(dá)，而且能夠調(diào)控雙子葉植物(例如煙草)中目的基因的表達(dá)。由此提供了下述發(fā)明
本發(fā)明的一個(gè)方面提供了一種具有SEQ ID NO :1所不核苷酸序列的啟動(dòng)子。在本發(fā)明中，所述啟動(dòng)子的具體堿基序列長(zhǎng)度為1756個(gè)堿基，如SEQ ID NO :I所示
CATCAATGGCATGACCGTTTCTATAAAACCCTTCTTATTGATCAATGCATGATATCTTTAATTAAATCCCCTTTCCCTTTTTCTCTTCTAAGGTGATGTTTGGAACCAGATACTTAACTTTAGTCTATATATTTAGACACTAATTTAGAGTATTAAATATAGACTACTTACAAAACTAATTACATAAATGAAAGCTAATTTGCGAGATAAATTTTTTAAGCCTAATTAATCTATAATTAGAGAATTTTTACTGTAGCATCATATAGGCTTATCATGGATTAATTAGGCTCAATAGATTTGTCTCGCGAATTAGTCCGAGATTATGGATGAGTTTTATTGATAGTCTACGTTTAATATTTATAATTAGTGTCCAAACATCCCATGTAATAGGGACTTAAAAGTTTTAGTCCCATCTAAACAGGGTCTAAGTCCTTCTAAATCTGTTACTCATATAACTGTCTAACTGAGATAAAGTTTAAGGTTGTCATATCATATCATCGTCACGTTATATATATGATCCCTGCACTTCTCTTTTTATAGAATGGACGAGACTCTTTTTTCTGTATATGTAGCGGTCTTGTACTCTTGTTAGTACCATTTTGCGTCCCATTTTGACGAGACGACTGGCGTGCCATTTTGCGTCCTGGTTCATTACAGTCTAATTTGGTGACAAACAAACAAGGAACAAATAGGTCCCATGGTCTAGCGGTTAGGACATTGGACTCTGAATCCAGTAACCCGAGTTCAAATCTCGGTGGGACCTTAATTTTCTCGGTTTTATTTTCTGCCTGAGCTTATTGTCCTCCTCCTGATTTTTTGTTGTTGTCTATTTTCTCTGCCGGAAAAATGTATCAAACTCGTCGATTCTACTCGTTTGAGAGCTTAGTGTGATATTGTCCTTCTCCTGAAGTTTCTATTTTTTACTCTCTCTGTTATGAAAATTTTCATGCTAGAATGATTTACATTGTGAAATGGAGAGAGAACTCGTTTGTGCTTATTTATCCTTCCCCTGATTTTTTTCCACACCAAAACATATATTGTGATAATTGAGTATGCTACGCGTCTGACGTACTACGAGTTTACTCCCTCCGTCCCAAAAAAAGACAAACCCTGAGTTTTCATGTCCAATGTTTGATCATATTATTTGAAAAAATTATGAAAAAAATTAAAAAGACAAGTTACGTATAAAGTATTAATCATATTTTATCATATAACAACAATGAAAATACTAATTATAAAAATTTTTCATATAAGACGGACAGTTAAACGTTGGACACGAAAATCTAGGATTTATTTTTTTTTATAGAGGGAGTACGAGGTAAAAATCGTCCTCAGCGCCTTCAGAAAAAAAAAGGACAAAAATCCTCAGCGCCAACCGACTCCGCTCCACAGACCACAGCCGCCCAAGTGTGCGAGGACAACGGCGGCGGCGGCGGCGGCTAGGTTTTTGCTGCACCCGACGCCACCGCCCACCAGCGAGTGTGGTGGGCCGCGGCGGCCCATAAAAGAAATATCTAGGCGGCCCATGTAGCGCCAGAAAATATCTTCTCCCCCGCCTCGGGATCCTTATCCTCCGCCTCGCGCGGGGTGCCGTCCGATCAGATCAGGACGGCCGCGTGGGGCTATAAAAGGAGGGGGGGTAGGGCAAGCAGTGCCTCCTCGTGCTCTCTTTGAGGTGGGTTGGCTTCTCCTCCCCCTCTTTACCTTTTCCTCCTCGGTTCGGTTCCGTGGTTCGTCTAGGGTTTAGTGGGTTGAG(SEQ IDNO 1)
在本發(fā)明中，將SEQ ID NO :1所示的啟動(dòng)子序列稱為啟動(dòng)子BgIosP517，或簡(jiǎn)稱為P517啟動(dòng)子。
帶有該啟動(dòng)子和⑶S(0 -葡萄糖苷酸酶,其英文名稱為0-glucuronidase,簡(jiǎn)稱 為GUS)基因的水稻愈傷組織以及轉(zhuǎn)基因水稻苗經(jīng)GUS染色實(shí)驗(yàn)后，所述水稻愈傷組織和轉(zhuǎn)基因水稻苗的根、葉等變?yōu)樗{(lán)色。帶有該啟動(dòng)子和GUS基因的轉(zhuǎn)基因煙草苗經(jīng)GUS染色實(shí)驗(yàn)后，所述轉(zhuǎn)基因煙草苗的根、葉等也變?yōu)樗{(lán)色。
本發(fā)明的又一方面涉及具有與SEQ ID NO :1所示核苷酸序列互補(bǔ)的序列的啟動(dòng)子。
本發(fā)明的又一方面還涉及SEQ ID NO :1所示啟動(dòng)子的具有啟動(dòng)子功能的選自如下的變體
I)在高等嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列雜交的核苷酸序列，
2)對(duì)SEQ ID NO :I所示的核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列，和
3)與SEQ ID NO :I所不的核苷酸序列具有至少90%的序列同一丨丨生的核苷酸序列。
典型地，“雜交條件”根據(jù)測(cè)量雜交時(shí)所用條件的“嚴(yán)緊性”程度來(lái)分類。嚴(yán)緊性程度可以以例如核酸結(jié)合復(fù)合物或探針的解鏈溫度(Tm)為依據(jù)。例如，“最大嚴(yán)緊性”典型地發(fā)生在約Tm-5°C (低于探針Tm 5°C )高等嚴(yán)緊性”發(fā)生在Tm以下約5_10°C;“中等嚴(yán)緊性”發(fā)生在探針Tm以下約10-20°C ;“低嚴(yán)緊性”發(fā)生在Tm以下約20_25°C。作為替代，或者進(jìn)一步地，雜交條件可以以雜交的鹽或離子強(qiáng)度條件和/或一或多次的嚴(yán)緊性洗滌為依據(jù)。例如，6XSSC =極低嚴(yán)緊性；3XSSC =低至中等嚴(yán)緊性；1XSSC =中等嚴(yán)緊性；0. 5XSSC =高等嚴(yán)緊性。從功能上說(shuō)，可以采用最大嚴(yán)緊性條件確定與雜交探針嚴(yán)緊同一或近嚴(yán)緊同一的核酸序列；而采用高等嚴(yán)緊性條件確定與該探針有約80%或更多序列同一性的核酸序列。
對(duì)于要求高選擇性的應(yīng)用，典型地期望采用相對(duì)嚴(yán)緊的條件來(lái)形成雜交體，例如，選擇相對(duì)低的鹽和/或高溫度條件。Sambrook等(Sambrook, J.等(1989)分子克隆,實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，Cold Spring Harbor Press,Plainview,N. Y.)提供了包括中等嚴(yán)緊性和高等嚴(yán)緊性在內(nèi)的雜交條件。
為便于說(shuō)明，用于檢測(cè)本發(fā)明的多核苷酸與其它多核苷酸雜交的合適的中度嚴(yán)緊條件包括用 5XSSC、0. 5% SDS、1. OmM EDTA(pH8. 0)溶液預(yù)洗；在 50-65°C下在 5XSSC 中雜交過(guò)夜；隨后用含0. 1% SDS的2X、0. 5X和0. 2XSSC在65°C下各洗滌兩次20分鐘。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，能容易地操作雜交嚴(yán)緊性，如改變雜交溶液的含鹽量和/或雜交溫度。例如，在另一個(gè)實(shí)施方案中，合適的高度嚴(yán)緊雜交條件包括上述條件，不同之處在于雜交溫度升高到例如60-65°C或65-70°C。
在本發(fā)明中，所述在高等嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列雜交的核苷酸序列，其具有與SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列相同或相似的啟動(dòng)子活性。
在本發(fā)明中，所述對(duì)SEQ ID NO :I所示的核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列，是指分別或同時(shí)在所述核苷酸序列的5’端和/或3’端，和/或序列內(nèi)部進(jìn)行例如不超過(guò)2-45個(gè),或者不超過(guò)2-30個(gè),或者不超過(guò)3-20個(gè),或者不超過(guò)4-15個(gè),或者不超過(guò)5-10個(gè),或者不超過(guò)6-8個(gè)的分別用逐個(gè)連續(xù)整數(shù)表示的堿基的取代、缺失、添加修飾。
在本發(fā)明中，所述對(duì)SEQ ID NO : I所示的核苷酸序列進(jìn)行如上述一個(gè)或多個(gè)堿基的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列具有與SEQ ID NO :I所示的核苷酸序列相同或相似的啟動(dòng)子活性。通過(guò)一種多核苷酸進(jìn)行說(shuō)明，其所具有的核苷酸序列例如與SEQ ID NO 1的參考核苷酸序列至少具95%的“同一性”是指在SEQ ID NO 1的參考核苷酸序列之每100個(gè)核苷酸中，該多核苷酸的核苷酸序列除了含有多達(dá)5個(gè)核苷酸的不同外,該多核苷酸之核苷酸序列與參考序列相同。換句話說(shuō)，為了獲得核苷酸序列與參考核苷酸序列至少95%相同的多核苷酸，參考序列中多達(dá)5%的核苷酸可被刪除或被另一核苷酸替代；或可將一些核苷酸插入?yún)⒖夹蛄兄?，其中插入的核苷酸可多達(dá)參考序列之總核苷酸的5% ;或在一些核苷酸中，存在刪除、插入和替換的組合，其中所述核苷酸多達(dá)參考序列之總核苷酸的5%。參考序列的這些突變可發(fā)生在參考核苷酸序列的5’或3’末端位置，或在這些末端位置之間的任意地方，它們或單獨(dú)散在于參考序列的核苷酸中，或以一個(gè)或多個(gè)鄰近的組存在于參考序列中。
在本發(fā)明中，用于確定序列同一性和序列相似性百分?jǐn)?shù)的算法是例如BLAST和BLAST 2. 0 算法，它們分別描述在 Altschul 等(1977)Nucl. Acid. Res. 25 :3389-3402 和Altschul等(1990) J. Mol. Biol. 215 :403_410。采用例如文獻(xiàn)中所述或者默認(rèn)參數(shù)，BLAST和BLAST 2.0可以用于確定本發(fā)明的核苷酸序列同一性百分?jǐn)?shù)。執(zhí)行BLAST分析的軟件可以通過(guò)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)為公眾所獲得。
在本發(fā)明中，所述與SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一性的核苷酸序列包括與SEQ ID NO :1所公開(kāi)序列基本同一的多核苷酸序列，例如當(dāng)采用本文所述方法(例如采用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)的BLAST分析)時(shí)，與本發(fā)明多核苷酸序列相比含有至少90%序列同一性、優(yōu)選至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更高的序列同一性的那些序列。
在本發(fā)明中，所述與SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一性的核苷酸序列具有與SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列相同或相似的啟動(dòng)子活性。
本發(fā)明中，所述的啟動(dòng)子來(lái)源于單子葉植物；具體地，為禾本科；更具體地，為稻屬或水稻，例如所述水稻為日本晴(Oryza sativa L. ssp. japonica cv. Nipponbare)。水稻日本晴種子已經(jīng)于2009年12月18日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號(hào)為CCTCC NO :P200910，保藏單位地址為中國(guó).武漢.武漢大學(xué)，郵編430072 ;水稻日本晴的保藏記載在公開(kāi)號(hào)為CN 101864418A的中國(guó)專利申請(qǐng)(申請(qǐng)?zhí)枮?00910249575. 6，
公開(kāi)日為2010年10月20日)中。[0033]本發(fā)明的又一方面，涉及一種核酸構(gòu)建體，包含本發(fā)明的啟動(dòng)子，以及與啟動(dòng)子可操作地連接的基因，其中啟動(dòng)子與基因的來(lái)源相同或者不同。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”是指兩個(gè)或多個(gè)核苷酸區(qū)域或核酸序列的功能性的空間排列。在本發(fā)明的核酸構(gòu)建體中，例如，啟動(dòng)子被置于所述基因的核酸序列的特定位置，例如啟動(dòng)子位于所述基因核酸序列的上游位置，使得核酸序列的轉(zhuǎn)錄受到該啟動(dòng)子區(qū)域的引導(dǎo)，從而，啟動(dòng)子區(qū)域被“可操作地連接”到該基因的核酸序列上。所述基因一般是需要提高轉(zhuǎn)錄水平的任何核酸序列，或者，可設(shè)計(jì)本發(fā)明所述啟動(dòng)子和基因以便下調(diào)特定核酸序列。也就是通過(guò)將啟動(dòng)子與反義方向的基因相連來(lái)實(shí)現(xiàn)。
所述“可操作地連接”可以通過(guò)基因重組的手段實(shí)現(xiàn)，具體地，所述核酸構(gòu)建體為重組核酸構(gòu)建體。在本發(fā)明一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述基因?yàn)棰荢基因。本發(fā)明的又一方面，還涉及一種含有本發(fā)明的啟動(dòng)子或核酸構(gòu)建體的載體。具體地，為重組載體。所述重組載體可以通過(guò)將上述啟動(dòng)子或核酸構(gòu)建體插入到克隆載體或表達(dá)載體而得到。
適于構(gòu)建本發(fā)明所述重組載體的克隆載體包括但不限于，例如pUC18、pUC19、pUC118、pUC119、pMD19-T、pMD20-T、pMD18-T Simple Vecter、pMD19_T Simple Vecter 等。
適于構(gòu)建本發(fā)明所述的表達(dá)載體包括但不限于，例如pBI121、pl3W4、pGEM等。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述重組載體為pMD18-T+P517重組載體或p8+P517
重組載體。
本發(fā)明的又一方面還涉及含有本發(fā)明的啟動(dòng)子或核酸構(gòu)建體或重組載體的重組細(xì)胞。所述重組細(xì)胞可以通過(guò)將本發(fā)明的啟動(dòng)子或核酸構(gòu)建體或重組載體轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞而得到。
適于構(gòu)建本發(fā)明所述重組細(xì)胞的宿主細(xì)胞包括但不限于，例如根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞LBA4404、EHA105、GV3101 等。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述重組細(xì)胞為重組大腸桿菌細(xì)胞DH5 a -P517或重組根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens) EHA105-P517。根癌農(nóng)桿菌 EHA105Agrobacterium tumefaciens EHA105已經(jīng)于2009年12月24日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號(hào)為CCTCC NO M 209315，保藏單位地址為中國(guó).武漢.武漢大學(xué)，郵編430072 ;農(nóng)桿菌EHA105的保藏記載在公開(kāi)號(hào)為CN 101864418A的中國(guó)專利申請(qǐng)(申請(qǐng)?zhí)枮?00910249575. 6，
公開(kāi)日為2010年10月20日)中。
本發(fā)明的又一方面還涉及一種含有本發(fā)明的啟動(dòng)子或本發(fā)明的核酸構(gòu)建體或本發(fā)明的載體或本發(fā)明的重組細(xì)胞的植物愈傷組織或植物外植體或植物。具體地，所述植物為被子植物，更具體地為單子葉植物或雙子葉植物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述單子葉植物為水稻。所述水稻包括但不限于，例如中花9、中花10、中花11、臺(tái)北309、丹江8號(hào)、云稻2號(hào)、汕優(yōu)63、汕優(yōu)608、豐優(yōu)22，黔優(yōu)88、II優(yōu)416、II優(yōu)107、II優(yōu)128、II優(yōu)718、準(zhǔn)兩優(yōu)527、川農(nóng)I號(hào)、雜0152、皖稻88、皖稻90、皖稻92、皖稻94、皖稻96、皖稻185、皖稻187、皖稻189、皖稻191、皖稻193、皖稻195、皖稻197、皖稻199、皖稻201、皖稻203、皖稻205、皖稻207，以及津原101 (上述水稻品種均可購(gòu)自安徽徽商農(nóng)家福有限公司)等。在本發(fā)明的又一實(shí)施方案中，所述水稻為日本晴。所述雙子葉植物為煙草，具體為煙草K326、K346、K394、NC82、NC89、G140、G28、G80、中煙 90、Cokerl76、或 CV87。其中，煙草 NC89 種子已經(jīng)于2010年11月12日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號(hào)為CCTCC NO P201017，保藏單位地址為中國(guó).武漢.武漢大學(xué)，郵編430072。
本發(fā)明的又一發(fā)明，涉及用于擴(kuò)增本發(fā)明的啟動(dòng)子的引物對(duì)，其具有Seq ID NO 2和Seq ID NO :3所示的核苷酸序列；具體地，所述引物對(duì)為在Seq ID NO :2和Seq ID NO:3所示核苷酸序列的5’端分別連接有限制性酶切位點(diǎn)和/或保護(hù)堿基；更具體地，所述引物對(duì)具有Seq ID No 4和Seq ID No 5所示的核苷酸序列。
CATCAATGGCATGACCGTTTC(SEQ ID NO :2)。
CTCAACCCACTAAACCCTAG(SEQ ID NO :3)。
CCGgaattcCATCMTGGCATGACCGTTTC(SEQ ID NO :4)，其中小寫字母代表EcoRI 酶切位點(diǎn)。GCctgcagCTCAACCCACTAAACCCTAG(SEQ ID NO :5)，其中小寫字母代表 PstI 酶切位點(diǎn)。
本發(fā)明的又一發(fā)明，涉及一種制備本發(fā)明的啟動(dòng)子的方法，包括下述步驟
I)根據(jù)SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列，設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物對(duì)；具體地，PCR擴(kuò)增引物對(duì)為 SEQ ID NO 2 和 SEQ ID NO :3，或者為 SEQ ID NO 4 和 SEQ ID NO 5 ；
2)以水稻日本晴基因組DNA為模板，使用步驟I)中所設(shè)計(jì)的PCR擴(kuò)增引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
本領(lǐng)域技術(shù)人員周知，可以根據(jù)待擴(kuò)增的目的核苷酸序列按照堿基互補(bǔ)原則設(shè)計(jì)相應(yīng)的PCR擴(kuò)增引物對(duì)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述PCR擴(kuò)增引物對(duì)如SEQ ID NO:
2和 SEQ ID NO 3 所示。
本發(fā)明的又一方面，還涉及一種調(diào)控植物中基因表達(dá)的方法，所述方法包括將本發(fā)明的啟動(dòng)子或本發(fā)明的核酸構(gòu)建體或本發(fā)明的載體或本發(fā)明的重組細(xì)胞導(dǎo)入植物的步驟，具體地，導(dǎo)入植物愈傷組織；具體地，包括使用本發(fā)明的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化植物愈傷組織的步驟。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述植物愈傷組織的轉(zhuǎn)化利用了含有本發(fā)明的啟動(dòng)子的重組細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述植物愈傷組織的轉(zhuǎn)化過(guò)程中利用了前述的重組農(nóng)桿菌EHA105-P517。具體地，所述植物為被子植物，更具體地，為單子葉植物或雙子葉植物。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述單子葉植物為水稻，具體地，所述水稻為日本晴。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述雙子葉植物為煙草，例如煙草NC89。
在本發(fā)明中，可采用植物基因轉(zhuǎn)化技術(shù)將目的基因插入到植物基因組中，包括農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化、病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、顯微注射、粒子轟擊、基因槍轉(zhuǎn)化和電穿孔等。本領(lǐng)域周知，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化常被用于單子葉植物或雙子葉植物的基因轉(zhuǎn)化，但其它轉(zhuǎn)化技術(shù)也可用于本發(fā)明的啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)化。當(dāng)然，適于本發(fā)明的轉(zhuǎn)化單子葉或雙子葉植物的另一種方法是粒子轟擊(顯微金或鎢粒子包覆轉(zhuǎn)化的DNA)胚性愈傷組織或胚胎開(kāi)發(fā)。另外，還可以采用的轉(zhuǎn)化單子葉或雙子葉植物的方法是原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化。基因轉(zhuǎn)化后，采用通用的方法來(lái)篩選和再生整合有表達(dá)單元的植株。
本發(fā)明中，可利用本發(fā)明的啟動(dòng)子調(diào)控目的基因表達(dá)的所述單子葉植物包括但不限于,例如水稻、小麥、玉米、小米、甘蔗、高粱、大麥等。
煙草是典型的基因工程模式植物。故本發(fā)明選擇煙草進(jìn)行轉(zhuǎn)基因研究，以研究本發(fā)明的啟動(dòng)子在雙子葉植物中的效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該啟動(dòng)子能在轉(zhuǎn)基因煙草中起作用。本發(fā)明中，可利用本發(fā)明的啟動(dòng)子調(diào)控目的基因表達(dá)的所述雙子葉植物包括但不限于，例如煙草、大豆，馬鈴薯、蠶豆、蘿卜、花生等。
本發(fā)明的又一方面還涉及本發(fā)明的啟動(dòng)子或本發(fā)明的核酸構(gòu)建體或本發(fā)明的載體或本發(fā)明的重組細(xì)胞或本發(fā)明的植物愈傷組織或植物外植體或植物在調(diào)控植物中目的基因表達(dá)中的用途。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，利用本發(fā)明所述啟動(dòng)子調(diào)控的目的基因是GUS。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述單子葉植物為水稻，具體地，所述水稻為日本晴。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述雙子葉植物為煙草，例如煙草NC89。
為實(shí)現(xiàn)上述調(diào)控目的基因表達(dá)的目的，本發(fā)明所述啟動(dòng)子可以以單拷貝和/或多拷貝的形式應(yīng)用，也可以與現(xiàn)有技術(shù)中已知的啟動(dòng)子聯(lián)用。
一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括在有效產(chǎn)生植物的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的重組細(xì)胞或本發(fā)明的植物愈傷組織或植物外植體或植物的步驟。
本發(fā)明的又一方面還涉及本發(fā)明的啟動(dòng)子或本發(fā)明的核酸構(gòu)建體或本發(fā)明的載體或本發(fā)明的重組細(xì)胞或本發(fā)明的植物愈傷組織或植物外植體或植物在植物育種中的用途；具體地，所述植物為單子葉植物或雙子葉植物；更具體地，所述單子葉植物為稻屬植物或水稻，所述雙子葉植物為煙草屬植物；進(jìn)一步具體地，所述水稻為日本晴、中花9、中花10、中花11、臺(tái)北309、丹江8號(hào)、云稻2號(hào)、汕優(yōu)63、汕優(yōu)608、豐優(yōu)22，黔優(yōu)88、II優(yōu)416、II優(yōu)107、II優(yōu)128、II優(yōu)718、準(zhǔn)兩優(yōu)527、川農(nóng)I號(hào)、雜0152、皖稻88、皖稻90、皖稻92、皖稻94、皖稻96、皖稻185、皖稻187、皖稻189、皖稻191、皖稻193、皖稻195、皖稻197、皖稻199、皖稻201、皖稻203、皖稻205、皖稻207、或津原101，所述煙草屬植物為煙草K326、 K346、K394、NC82、NC89、G140、G28、G80、中煙 90、Cokerl76、或 CV87。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述水稻為日本晴。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述煙草為煙草NC89。
本發(fā)明的啟動(dòng)子可成為一種新的啟動(dòng)子作為單子葉植物(尤其是水稻)或雙子葉植物(尤其是煙草)轉(zhuǎn)基因的工具啟動(dòng)子，為開(kāi)展低表達(dá)基因轉(zhuǎn)化苗篩選、植物花器官敗育等分子育種研究提供便利，從而極大的縮短優(yōu)良品種的選育時(shí)間。本發(fā)明的啟動(dòng)子可廣泛用于培育水稻、小麥、玉米、小米、甘蔗、高粱、大麥等單子葉植物以及煙草、大豆、馬鈴薯、蠶豆、蘿卜、花生等雙子葉植物。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“單子葉植物”，具體地，可以為禾本科植物，更具體地，可以為稻屬植物例如水稻，包括但不限于，例如日本晴、中花9、中花10、中花11、臺(tái)北309、丹江8號(hào)、云稻2號(hào)、汕優(yōu)63、汕優(yōu)608、豐優(yōu)22，黔優(yōu)88、II優(yōu)416、II優(yōu)107、II優(yōu)128、II優(yōu)718、準(zhǔn)兩優(yōu)527、川農(nóng)I號(hào)、雜0152、皖稻88、皖稻90、皖稻92、皖稻94、皖稻96、皖稻185、皖稻187、皖稻189、皖稻191、皖稻193、皖稻195、皖稻197、皖稻199、皖稻201、皖稻203、皖稻205、皖稻207，以及津原101。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“雙子葉植物”，具體地，可以為茄科植物，更具體地，可以為煙草屬植物例如煙草，包括但不限于煙草K326、K346、K394、NC82、NC89、G140、G28、G80、中煙90、Cokerl76、*CV87。
發(fā)明的有益效果
本發(fā)明提供了一種新的啟動(dòng)子。所述啟動(dòng)子不僅能夠調(diào)控單子葉植物(例如水稻)中目的基因的表達(dá)，而且能夠調(diào)控雙子葉植物(例如煙草)中目的基因的表達(dá)。具體地，所述啟動(dòng)子能夠在水稻和基因工程模式植物-煙草中均能夠調(diào)控GUS基因的表達(dá)。


圖I :用于構(gòu)建p8質(zhì)粒的pCAMBIA-1301質(zhì)粒示意圖。
圖2:p8質(zhì)粒示意圖。
圖3 p8質(zhì)粒示意圖中多克隆位點(diǎn)和⑶S序列部分的示意圖。
圖4 :經(jīng)轉(zhuǎn)化的水稻愈傷組織的GUS染色結(jié)果。其中，由帶有本發(fā)明所述啟動(dòng)子P517序列的重組根癌農(nóng)桿菌P8+P517轉(zhuǎn)化的水稻愈傷組織(右)經(jīng)⑶S染色后呈現(xiàn)藍(lán)色；不帶有本發(fā)明啟動(dòng)子序列的重組根癌農(nóng)桿菌P8質(zhì)粒的水稻愈傷組織(對(duì)照，左)經(jīng)⑶S染色后顏色未發(fā)生變化。
圖5:經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因水稻苗的根的GUS染色結(jié)果。其中，由帶有本發(fā)明所述啟動(dòng)子P517序列的重組根癌農(nóng)桿菌P8+P517轉(zhuǎn)化的水稻苗的根(右)經(jīng)⑶S染色后，呈現(xiàn)藍(lán) 色；不帶有本發(fā)明啟動(dòng)子序列的重組根癌農(nóng)桿菌P8轉(zhuǎn)化的水稻苗的根(對(duì)照，左)經(jīng)⑶S染色后根的顏色未發(fā)生變化。
圖6:經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因水稻苗的葉的GUS染色結(jié)果。其中，由帶有本發(fā)明所述啟動(dòng)子P517序列的重組根癌農(nóng)桿菌p8+P517轉(zhuǎn)化的水稻苗的葉(右)經(jīng)⑶S染色后，呈現(xiàn)藍(lán)色；不帶有本發(fā)明啟動(dòng)子序列的重組根癌農(nóng)桿菌P8轉(zhuǎn)化的水稻苗的葉(對(duì)照，左)經(jīng)GUS染色后葉的顏色未發(fā)生變化。
圖7:經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因煙草苗的葉的GUS染色結(jié)果。其中，由帶有本發(fā)明所述啟動(dòng)子P517序列的重組根癌農(nóng)桿菌p8+P517轉(zhuǎn)化的煙草苗的葉(右)經(jīng)⑶S染色后，呈現(xiàn)藍(lán)色；不帶有本發(fā)明啟動(dòng)子序列的重組根癌農(nóng)桿菌P8轉(zhuǎn)化的煙草苗的葉(對(duì)照，左)經(jīng)GUS染色后葉的顏色未發(fā)生變化。
圖8:經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因煙草苗的根的GUS染色結(jié)果。其中，由帶有本發(fā)明所述啟動(dòng)子P517序列的重組根癌農(nóng)桿菌p8+P517轉(zhuǎn)化的煙草苗的根(右)經(jīng)⑶S染色后，呈現(xiàn)藍(lán)色；不帶有本發(fā)明啟動(dòng)子序列的重組根癌農(nóng)桿菌P8轉(zhuǎn)化的煙草苗的根(對(duì)照，左)經(jīng)GUS染色后葉的顏色未發(fā)生變化。
本發(fā)明涉及保藏的生物材料
煙草NC89種子，2010年11月12日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號(hào)為CCTCC NO :P201017，保藏單位地址為中國(guó).武漢.武漢大學(xué)，郵編430072。
具體實(shí)施方式
下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件(例如參考J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，第三版，科學(xué)出版社)或者按照產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
實(shí)施例中涉及的N6D培養(yǎng)基、YM液體培養(yǎng)基、YM固體培養(yǎng)基、AAM培養(yǎng)基、N6-AS共培養(yǎng)基、MS-R分化培養(yǎng)基、1/2MS生根培養(yǎng)基，其具體配方可以參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》或者參考公開(kāi)號(hào)為CN101864418A的中國(guó)專利申請(qǐng)(申請(qǐng)?zhí)枮?00910249575. 6，
公開(kāi)日為2010 年 10 月 20 日)。[0078]實(shí)施例I :P517啟動(dòng)子片段的PCR擴(kuò)增和DMD18-T+P517重鉬載體的構(gòu)律
I) PCR 擴(kuò)增
使用植物基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN新型植物基因組DNA提取試劑盒，目錄號(hào)DP320-02)提取水稻日本晴的基因組DNA，根據(jù)該啟動(dòng)子在水稻日本晴gDNA中的序列，分別在首尾設(shè)計(jì)一對(duì)PCR特異性擴(kuò)增引物(上游引物F1，加限制性酶切位點(diǎn)EcoRI和保護(hù)堿基，下游引物R1，加限制性酶切位點(diǎn)PstI和保護(hù)堿基)。以上述提取的水稻日本晴的gDNA為模板，使用高保真Ex Taq(TaKaRa,DRR100B)聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增啟動(dòng)子的PCR體系如下
組成體積(Ul)
基因組DNA0.2
dNTPs (2. 5mM)2
IOXEx Buffer (含續(xù)離子)2.5
引物Fl (50 u M)I
引物Rl(50iiM)I
Ex taq0. 2
ddH20補(bǔ)滿至總體積25 ill
PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min，然后以94°C變性45s，55°C退火50s，72°C延伸90s，進(jìn)行35個(gè)反應(yīng)循環(huán)，最后72°C延伸7min。
其中，上游引物Fl :CCGgaattcCATCAATGGCATGACCGITTC(SEQ ID NO :4)，其中小寫字母代表EcoRI酶切位點(diǎn)。
下游引物Rl:GCctgcagCTCAACCCACTAAACCCTAG(SEQ ID NO :5)，其中小寫字母代表PstI酶切位點(diǎn)。
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，使用TIANGEN瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(目錄號(hào)DP209-03)進(jìn)行純化回收。
2)pMD18_T+P517重組載體的構(gòu)建
將如上述得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行T/A克隆(pMD18-T質(zhì)粒，TaKaRa，D103A)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取陽(yáng)性克隆測(cè)序，測(cè)序結(jié)果證明得到的序列準(zhǔn)確。
其中，T/A克隆的連接條件如下
T/A 連接體系10 ill
pMD18-TIU I
2*solution I5 U I
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(回收插入片段)10_20ng，根據(jù)其濃度定
ddH20補(bǔ)齊至 10 ill
于16 °C在節(jié)能型智能恒溫槽(寧波新芝，SDC-6)中連接8h以上，得到PMD18-T+P517重組載體。將經(jīng)過(guò)上述連接后的產(chǎn)物按照如下方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌
從超低溫冰箱中取出按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版，科學(xué)出版社)所示氯化鈣法制備的感受態(tài)細(xì)胞IOOiil DH5a (中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所董楊提供；或者可從例如上海生工購(gòu)得)，冰上融化后，加入IOu I如上所得的連接產(chǎn)物，即pMD18-T+P517重組載體，輕輕攪勻，冰浴30min，42°C熱激60s，冰浴5min，加入600 u I 4°C預(yù)冷的SOC培養(yǎng)基(具體配方詳見(jiàn)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，第三版，科學(xué)出版社)，37°C 220rpm復(fù)蘇45min,8000rpm離心30s,去上清，留取150y I,用剩下的150 y I上清重懸沉淀后的混合物,輕輕吹勻，玻璃珠涂布LB (卡那霉素)平板(具體配方詳見(jiàn)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，第三版，科學(xué)出版社)，37°C倒置培養(yǎng)16h 24h。獲得含有pMD18-T+P517克隆載體的重組大腸桿菌，命名為DH5 a -P517。深圳華大基因科技股份有限公司對(duì)pMD18_T+P517克隆載體中的P517進(jìn)行測(cè)序，證明獲得的PMD18-T+P517克隆載體中P517啟動(dòng)子序列正確。
實(shí)施例2 p8+P517重纟目載體的構(gòu)律
按照TIANGEN普通質(zhì)粒小提試劑盒(目錄號(hào)DP103_03)的操作手冊(cè)，從實(shí)施例I構(gòu)建的轉(zhuǎn)化有啟動(dòng)子P517的大腸桿菌DH5a -P517中提取帶有本發(fā)明P517啟動(dòng)子序列的克隆載體PMD18-T+P517 ;純化后用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶EcoRI (NEB)和PstI (NEB)進(jìn)行酶切，回收相應(yīng)的啟動(dòng)子插入片段，并分別與P8質(zhì)粒用相同的限制性內(nèi)切酶酶切后回收的載 體大片段進(jìn)行連接。
將所得連接產(chǎn)物p8+P517重組載體轉(zhuǎn)化按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版，科學(xué)出版社)所示氯化鈣法制備的感受態(tài)細(xì)胞DH5a，37°C倒置培養(yǎng)16-24h，待轉(zhuǎn)化子長(zhǎng)出菌落后，挑取單克隆進(jìn)行PCR檢測(cè)和酶切鑒定。
具體操作如下
l)p8質(zhì)粒構(gòu)建
本發(fā)明中所使用的p8質(zhì)粒是由pCAMBIA-1301質(zhì)粒(中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所董楊提供；或者可從例如上海國(guó)瑞基因科技有限公司購(gòu)得，該公司的pCAMBIA-1301質(zhì)粒的原始來(lái)源是 The CAMBIA Bios (biological open source) Licensee, Australia)按照如下 方式改造并構(gòu)建的，具體說(shuō)明如下
用Kpn I/Nco I (NEB)雙酶切質(zhì)粒pCAMBIA-1301 (參見(jiàn)圖I)，回收大片段。根據(jù)所采用的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)合成如下序列GGTACCAAGCTTACTAGTCCTGCAGGTCTAGAGGATCCGTCGACCATGG(SEQ ID NO :6)(包含的酶切位點(diǎn)是 Kpn I/Hind III/Spe I/Sbf I/Pst I/Xba I/BamH I/Sal I/Nco I)，用Kpn I/Nco I雙酶切后回收，與上述所回收的大片段連接后轉(zhuǎn)化toplO細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所董楊提供；或者可從例如北京索萊寶科技有限公司購(gòu)得)。用引物 GCTTCCGGCTCGTATGITGT (SEQ ID NO 7)和 GAGTCGTCGGTTCTGTAAC (SEQ IDNO 8)篩選轉(zhuǎn)化子，通過(guò)PCR檢測(cè)方法，帶有擴(kuò)增片段為350bp的轉(zhuǎn)化子即為含有需要構(gòu)建的多克隆位點(diǎn)及GUS序列的p8質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子(參見(jiàn)圖2)。
所述p8質(zhì)粒中的多克隆位點(diǎn)和⑶S序列的長(zhǎng)度2353堿基，如SEQ ID NO :9所示(參見(jiàn)圖3)
GTTGGCAAGCTGCTCTAGCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTAT GCTTCCGGCTCGTATGTT GT GTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTC
ACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTAC |GAATT|^[ GAGCTC jGGTACCl AAGCTT lACTAGT| C ICTGCAG
G jTCTAGAl GGATCC jGTCGA^ C ATGG TAG A TCT
權(quán)利要求
1.一種啟動(dòng)子，其核苷酸序列為SEQ ID NO: I所示的核苷酸序列或者為與SEQ ID NO:I互補(bǔ)的核苷酸序列。
2.—種核酸構(gòu)建體，包含權(quán)利要求
I所述的啟動(dòng)子，和與啟動(dòng)子可操作地連接的基因序列，其中所述啟動(dòng)子與所述基因序列來(lái)源相同或者不同。
3.ー種載體，其特征在于，所述載體含有權(quán)利要求
I所述的啟動(dòng)子或權(quán)利要求
2所述的核酸構(gòu)建體。
4.根據(jù)權(quán)利要求
3所述的載體，其為權(quán)利要求
I所述的啟動(dòng)子或權(quán)利要求
2所述的核酸構(gòu)建體與PMD18-T或p8質(zhì)粒經(jīng)重組得到的重組載體。
5.ー種重組細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞含有權(quán)利要求
I所述的啟動(dòng)子或者權(quán)利要求
2所述的核酸構(gòu)建體或者權(quán)利要求
3或4所述的載體；并且所述重組細(xì)胞為重組大腸桿菌細(xì)胞或重組農(nóng)桿菌細(xì)胞。
6.ー組引物對(duì)，所述引物對(duì)用于擴(kuò)增得到權(quán)利要求
I所述的啟動(dòng)子，其特征在于所述引物對(duì)的兩條引物的核苷酸序列分別為SEQ IDNO :2所示的序列和SEQ ID NO :3所示的序列。
7.—組引物對(duì)，所述引物對(duì)用于擴(kuò)增得到權(quán)利要求
I所述的啟動(dòng)子，其特征在于所述引 物對(duì)的兩條引物的核苷酸序列分別為在SEQ IDNO :2所示序列的5’端連接有限制性酶切位點(diǎn)和/或保護(hù)堿基，和在SEQID NO 3所示序列的5’端連接有限制性酶切位點(diǎn)和/或保護(hù)堿基。
8.權(quán)利要求
7的引物對(duì)，其特征在于，所述引物對(duì)的兩條引物分別如SEQID N0:4和SEQ ID NO 5 所示。
9.制備SEQID NO 1所示的啟動(dòng)子的方法，包括下述步驟 以水稻日本睛基因組DNA為模板，使用一對(duì)擴(kuò)增引物進(jìn)行擴(kuò)增，所述擴(kuò)增引物根據(jù)SEQID NO 1在水稻日本睛gDNA中的序列分別針對(duì)首尾進(jìn)行設(shè)計(jì)。
10.根據(jù)權(quán)利要求
9所述的方法，其中，所述引物對(duì)為權(quán)利要求
6至8中任一項(xiàng)所示的引物對(duì)。
11.一種調(diào)控植物中基因表達(dá)的方法，所述方法包括，將權(quán)利要求
I所述的啟動(dòng)子或者權(quán)利要求
2的核酸構(gòu)建體或者權(quán)利要求
3或4的載體或權(quán)利要求
5的重組農(nóng)桿菌細(xì)胞導(dǎo)入植物的步驟，所述植物為單子葉植物或雙子葉植物；并且所述單子葉植物為稻屬，所述雙子葉植物為煙草屬。
12.根據(jù)權(quán)利要求
11所述的方法，其中，所述導(dǎo)入植物為導(dǎo)入植物愈傷組織。
13.根據(jù)權(quán)利要求
11所述的方法，其中，所述植物為水稻或煙草。
14.根據(jù)權(quán)利要求
13所述的方法，其中，所述植物為水稻日本睛或煙草NC89。
15.ー種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括在有效產(chǎn)生植物的條件下培養(yǎng)植物愈傷組織或植物外植體或植物的步驟，其中，所述植物愈傷組織或植物外植體或植物含有權(quán)利要求
I的啟動(dòng)子或權(quán)利要求
2的核酸構(gòu)建體或權(quán)利要求
3或4的載體或權(quán)利要求
5的重組農(nóng)桿菌細(xì)胞；所述植物為單子葉植物或雙子葉植物；并且所述單子葉植物為稻屬，所述雙子葉植物為煙草屬。
16.根據(jù)權(quán)利要求
15所述的方法，其中，所述植物為水稻或煙草。
17.根據(jù)權(quán)利要求
16所述的方法，其中，所述植物為水稻日本睛或煙草NC89。
18.權(quán)利要求
I所述的啟動(dòng)子、或者權(quán)利要求
2的核酸構(gòu)建體、或者權(quán)利要求
3或4的載體、或者權(quán)利要求
5的重組農(nóng)桿菌細(xì)胞、或者植物愈傷組織或植物外植體或植物在調(diào)控植物中目的基因表達(dá)或植物育種中的用途，其中，所述植物愈傷組織或植物外植體或植物含有權(quán)利要求
I的啟動(dòng)子或者權(quán)利要求
2的核酸構(gòu)建體或者權(quán)利要求
3或4的載體或者權(quán)利要求
5的重組農(nóng)桿菌細(xì)胞；所述植物是單子葉植物或雙子葉植物；并且所述單子葉植物為稻屬，所述雙子葉植物為煙草屬。
19.根據(jù)權(quán)利要求
18所述的用途，其中，所述植物為水稻或煙草。
20.根據(jù)權(quán)利要求
19所述的用途，其中，所述植物為水稻日本睛或煙草NC89。
專利摘要
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種啟動(dòng)子BgIosP517、其制備方法及用途。具體而言，本發(fā)明所述啟動(dòng)子具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，或其具有啟動(dòng)子功能的選自如下的變體1)在高等嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO1所示的核苷酸序列雜交的核苷酸序列，2)對(duì)SEQ ID NO1所示的核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列，和3)與SEQ ID NO1所示的核苷酸序列具有至少90％的序列同一性的核苷酸序列。本發(fā)明還涉及所述啟動(dòng)子的制備方法以及所述啟動(dòng)子在調(diào)控單子葉植物或雙子葉中目的基因表達(dá)和水稻或煙草育種中的用途。
文檔編號(hào)C12N1/21GKCN102146390 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請(qǐng)?zhí)朇N 201010614964
公開(kāi)日2013年2月27日 申請(qǐng)日期2010年12月30日
發(fā)明者楊爽, 全志武, 倪雪梅, 夏秋菊 申請(qǐng)人:深圳華大基因科技有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (3), 非專利引用 (2),