專利名稱:一種在微流控芯片內(nèi)進(jìn)行核酸擴(kuò)增的裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于核酸擴(kuò)增技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種核酸擴(kuò)增裝置，尤其是涉及一種在微流控芯片內(nèi)進(jìn)行核酸擴(kuò)增的裝置及其方法。
背景技術(shù)：
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction, PCR)在體外酶促合成特異DNA 片段，是現(xiàn)代核酸分析的重要手段之一(Saiki RK, Scharf S, Faloona F，Mullis KB, Horn GT, Erlich HA, Arnheim N Science 1985,230 :1350) 由高溫變性、低溫退火及適溫延伸等步驟組成一個循環(huán)，在一個循環(huán)內(nèi)能將目標(biāo)核酸分子的數(shù)目增加近一倍，整個聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)所包含的20 40個循環(huán)能將有限的核酸分子擴(kuò)增IO9倍。具有操作簡便、靈敏度高、特異性強、產(chǎn)率高、重現(xiàn)性好、易于自動化等優(yōu)勢。一個循環(huán)過程主要由以下三個基本步驟構(gòu)成①模板DNA的變性將反應(yīng)溶液加熱至93 98°C，溶液中的雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂而形成單鏈DNA;②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至陽 70°C左右，引物與單鏈DNA的互補序列配對結(jié)合；③引物的延伸 在60 75°C下，DNA模板-引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶等的作用下，以dNTP作為反應(yīng)原料，靶序列作為模板，按堿基互補配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA單鏈互補的半保留復(fù)制鏈。在一個循環(huán)過程完成后，每個目標(biāo)核酸分子由一條DNA雙鏈擴(kuò)增成為兩條DNA雙鏈。
在PCR擴(kuò)增過程中，溫度的控制至關(guān)重要。PCR擴(kuò)增儀是目前廣泛使用的擴(kuò)增設(shè)備，通過微機(jī)控制溫控模塊的溫度，從而實現(xiàn)試管中的PCR反應(yīng)溶液的升溫和降溫?，F(xiàn)有 PCR擴(kuò)增儀存在著如下缺點溫控模塊熱容量大、升溫降溫速度慢；采用導(dǎo)熱性較差的塑料管作為反應(yīng)容器，反應(yīng)溶液的溫度變化滯后于溫控模塊；設(shè)定溫度或模塊溫度并不能代表反應(yīng)溶液的實際溫度，溫度控制精度較差，擴(kuò)增效率較低，通常一個循環(huán)需幾分鐘到十幾分鐘，完成全部的擴(kuò)增過程需要數(shù)個小時的時間。
微流控芯片是利用各種微加工技術(shù)在芯片材料(如玻璃、PDMS或PMMA等其他材料)上加工出具有各種功能的微結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)反應(yīng)、分離、檢測等功能，最大限度地把實驗室的功能集成到便攜的芯片上。自20世紀(jì)90年代初Manz和Widmer等(ManzA，GraberN, Widemer H Μ. Sens. Acturators, B，1990，Bl 244)首次提出以來，微流控芯片技術(shù)得到了快速發(fā)展，已經(jīng)從單純的化學(xué)分析擴(kuò)展到各個領(lǐng)域，包括核酸分析、蛋白質(zhì)分析和細(xì)胞分析等。微流控芯片的通道及各種結(jié)構(gòu)均在微米級別，具有比表面積大、導(dǎo)熱快、傳質(zhì)迅速等優(yōu)點，在微流控芯片上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，能夠有效降低熱容量、縮短擴(kuò)增所需時間、降低樣品和試劑消耗(Zhang CS, Xing D. Nucleic Acids Res. 2007,35 :4223)。到目前為止，有關(guān)在微流控芯片上進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)已有許多報道，主要采用以下兩種方式
1.在微流控芯片上加工一個PCR反應(yīng)腔，將PCR反應(yīng)溶液加入到反應(yīng)腔內(nèi)，通過在芯片底部集成加熱部件或外置的加熱裝置進(jìn)行溫度控制，反應(yīng)溶液在反應(yīng)腔內(nèi)實現(xiàn)靜止式的三溫區(qū)循環(huán)，完成擴(kuò)增過程(Lagally E T, Medintz I，Mathies RA. Anal. Chem. 2001,73 565 ；Ohashi T, Kuyama H, Hanafusa N, Togawa Y. Biomed. Microdevice, 2007,9 :695 ； 路卡 布塞張建平中國專利專利公開號CN101680013A)。
2.利用三個集成或外置的加熱裝置，分別控制微流控芯片的不同區(qū)域處于三種不同的溫度下，微流控芯片的微通道分別經(jīng)過這三個不同的溫度區(qū)域，這樣PCR反應(yīng)溶液在微通道內(nèi)依次循環(huán)流經(jīng)3個不同溫區(qū)，在流動過程中完成擴(kuò)增過程(Kopp M U,de Mello A J,Manz A. Science. 1998,280 :1046 ；Mohr S,Zhang YH,Macaski11 A,Day PJR,Barber Rff, Goddard NJ,Emerson DR,Fielden PR. Microfluid. Nanofluid, 2007, 3:611 ；中國實用新型專利公告號CN2767454)。但目前已報道的這兩種方式仍有一定的不足，采用第1種方式仍需要反復(fù)進(jìn)行升溫和降溫過程，需要一定的時間完成溫度變化，而且溫度的重現(xiàn)性較差，精確控溫對溫度控制系統(tǒng)有較高的要求；采用第2種方式反應(yīng)溶液要流經(jīng)完整的微通道，容易被吸附到微通道內(nèi)壁上而導(dǎo)致干擾和交叉污染。
公告號為CN27674M的實用新型專利提供了一種應(yīng)用于PCR擴(kuò)增的微流控芯片應(yīng)用封裝結(jié)構(gòu)，屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。從上至下包括接口結(jié)構(gòu)，公知的微流路單元和溫控單元。 常規(guī)PCR擴(kuò)增儀，存在著熱容大、加熱速度和冷卻速度慢、樣品耗用高等缺點。通常完成一個擴(kuò)增循環(huán)通常需要幾到十幾分鐘，因此對于30個循環(huán)的擴(kuò)增過程需要花費數(shù)個小時，而且對于反應(yīng)物的需求量大。該實用新型實現(xiàn)了 PCR系統(tǒng)中由時間向空間的轉(zhuǎn)換，即維持系統(tǒng)不同地方的溫度恒定，而是樣品流經(jīng)不同的溫區(qū)。這種方式能夠大大提高反應(yīng)速度，僅需十幾分鐘實現(xiàn)快速PCR反應(yīng)，此外也可通過注射泵改變流速也擴(kuò)大了樣品容量的選擇范圍。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對目前常規(guī)的PCR擴(kuò)增儀所存在的不足，提供一種能夠?qū)崿F(xiàn)快速的溫度循環(huán)，縮短擴(kuò)增過程所需的時間，實現(xiàn)溫度的精確控制，提高擴(kuò)增效率，降低試劑和樣品的消耗，減少干擾和交叉污染的在微流控芯片內(nèi)進(jìn)行核酸擴(kuò)增的裝置。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種在微流控芯片內(nèi)進(jìn)行核酸擴(kuò)增的方法。
本發(fā)明所述的在微流控芯片內(nèi)進(jìn)行核酸擴(kuò)增的裝置設(shè)有微流控芯片、步進(jìn)電機(jī)、 轉(zhuǎn)盤、溫控器和均布在轉(zhuǎn)盤同一半徑圓周上的至少2個試管；轉(zhuǎn)盤與步進(jìn)電機(jī)輸出軸連接，各試管固于轉(zhuǎn)盤上，各試管內(nèi)均設(shè)有加熱件和溫度探頭，溫控器設(shè)于試管外部，加熱件和溫度探頭均與溫控器連接，微流控芯片的微通道入口端可插入試管中。
所述各個試管最好為相同的試管。
所述微通道可為玻璃微通道、石英微通道、硅微通道或高聚物微通道等，所述高聚物可為聚二甲基硅氧烷、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯等可用于制作微流控芯片的高聚物。
所述微通道可為經(jīng)可逆或不可逆鍵合組成完整的微通道。
所述微通道的尺寸可為Inm 1cm。
所述溫控器可為單片機(jī)或電腦。
本發(fā)明所述一種在微流控芯片內(nèi)進(jìn)行核酸擴(kuò)增的方法，采用所述在微流控芯片內(nèi)進(jìn)行核酸擴(kuò)增的裝置，包括以下步驟
1)將微流控芯片的微通道預(yù)先充滿與水不互溶的有機(jī)相，在各試管內(nèi)加入傳熱液體，然后將PCR反應(yīng)溶液以液滴的形式引入到微流控芯片的微通道入口端內(nèi)，并在微通道入口處用有機(jī)相進(jìn)行封閉；再將微流控芯片的微通道入口端插入到盛有傳熱液體的試管中，PCR反應(yīng)溶液液滴所處位置浸在試管內(nèi)的傳熱液體中；
2)根據(jù)不同PCR反應(yīng)溶液對溫區(qū)的要求，將相應(yīng)數(shù)量的試管安裝在與步進(jìn)電機(jī)固連的轉(zhuǎn)盤上，對各試管內(nèi)的傳熱液體進(jìn)行水浴加熱，并分別控制各試管內(nèi)的傳熱液體，使各試管內(nèi)的傳熱液體分別恒定于PCR擴(kuò)增所需要的不同溫度；
3)控制步進(jìn)電機(jī)轉(zhuǎn)動，讓微流控芯片的微通道入口端內(nèi)的PCR反應(yīng)溶液液滴依次浸沒在不同溫度的試管的傳熱液體中，并滿足PCR反應(yīng)各基本步驟對反應(yīng)時間的要求，步進(jìn)電機(jī)轉(zhuǎn)動一圈即完成一次PCR循環(huán)，轉(zhuǎn)動20 40圈就能完成一次完整的PCR擴(kuò)增過程。
在步驟1)中，所述傳熱液體可為水，所述有機(jī)相為與水不互溶或部分互溶的有機(jī)溶液，可為醇、酯或礦物油等。所述醇可為丁醇或己醇等，所述酯可為乙酸乙酯或甘油三乙酸酯等。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于通過步進(jìn)電機(jī)帶動3個試管的快速切換與 PCR反應(yīng)溶液液滴的快速傳熱，能夠?qū)崿F(xiàn)快速的3種溫度循環(huán)，縮短擴(kuò)增過程所需的時間，3 個試管內(nèi)的溫度可實現(xiàn)精確控制，這樣可顯著提高擴(kuò)增效率、降低試劑和樣品的消耗、減少干擾和交叉污染。


圖1是本發(fā)明實施例的結(jié)構(gòu)及使用示意圖。
圖2是圖1中3個試管的安置示意圖。
圖3為圖1中的微流控芯片的入口端放大示意圖。
具體實施方式
參見圖1 3，3個試管2內(nèi)裝有水(也可為其他液體)，3個試管2按順序均布安裝在轉(zhuǎn)盤11上，轉(zhuǎn)盤11連接在步進(jìn)電機(jī)1上，試管2內(nèi)安裝有加熱件7和溫度探頭8用于將試管2內(nèi)的液體恒定在一定溫度，加熱件7和溫度探頭8通過導(dǎo)線10與外部溫控器9連接。溫控器9對3個試管2中的水分別控制在PCR反應(yīng)過程所需的3種不同溫度(如93°C、 52°C和72。C )。微流控芯片3的微通道4內(nèi)預(yù)先充滿與水不混溶的有機(jī)相，微流控芯片3 的入口端5加工成尖針狀，入口端5內(nèi)有1滴PCR反應(yīng)溶液6，而且入口處用有機(jī)相(采用丁醇，也可己醇或礦物油)進(jìn)行封閉，將入口端5從試管2末端的開口(開槽)21中插入， 并確保PCR反應(yīng)液滴6所處位置浸沒在試管2內(nèi)的水中。本裝置工作時，步進(jìn)電機(jī)1旋轉(zhuǎn)， 3個試管2可依次對準(zhǔn)微流控芯片3的入口端5，PCR反應(yīng)液滴6依次在不同溫度的3個試管2中浸沒并保持所需的不同的時間，完成PCR反應(yīng)所需的三個溫區(qū)循環(huán)過程。步進(jìn)電機(jī)1 轉(zhuǎn)動一圈即完成一次PCR循環(huán)，一般轉(zhuǎn)動20 40圈就能完成一次完整的PCR擴(kuò)增過程。
權(quán)利要求
1.一種在微流控芯片內(nèi)進(jìn)行核酸擴(kuò)增的裝置，其特征在于設(shè)有微流控芯片、步進(jìn)電機(jī)、 轉(zhuǎn)盤、溫控器和均布在轉(zhuǎn)盤同一半徑圓周上的至少2個試管；轉(zhuǎn)盤與步進(jìn)電機(jī)輸出軸連接， 各試管固于轉(zhuǎn)盤上，各試管內(nèi)均設(shè)有加熱件和溫度探頭，溫控器設(shè)于試管外部，加熱件和溫度探頭均與溫控器連接，微流控芯片的微通道入口端插入試管中。
2.如權(quán)利要求
1所述的一種在微流控芯片內(nèi)進(jìn)行核酸擴(kuò)增的裝置，其特征在于所述各試管為相同試管。
3.如權(quán)利要求
1所述的一種在微流控芯片內(nèi)進(jìn)行核酸擴(kuò)增的裝置，其特征在于所述微通道為玻璃微通道、石英微通道、硅微通道或高聚物微通道。
4.如權(quán)利要求
3所述的一種在微流控芯片內(nèi)進(jìn)行核酸擴(kuò)增的裝置，其特征在于所述高聚物為聚二甲基硅氧烷、聚碳酸酯或聚甲基丙烯酸甲酯聚合物。
5.如權(quán)利要求
1或3或4所述的一種在微流控芯片內(nèi)進(jìn)行核酸擴(kuò)增的裝置，其特征在于所述微通道的徑向尺寸為Inm 1cm。
6.如權(quán)利要求
1所述的一種在微流控芯片內(nèi)進(jìn)行核酸擴(kuò)增的裝置，其特征在于所述溫控器為單片機(jī)或電腦。
7.—種在微流控芯片內(nèi)進(jìn)行核酸擴(kuò)增的方法，其特征在于，采用如權(quán)利要求
1所述一種在微流控芯片內(nèi)進(jìn)行核酸擴(kuò)增的裝置，所述方法包括以下步驟1)將微流控芯片的微通道預(yù)先充滿與水不互溶的有機(jī)相，在各試管內(nèi)加入傳熱液體， 然后將PCR反應(yīng)溶液以液滴的形式引入到微流控芯片的微通道入口端內(nèi)，并在微通道入口處用有機(jī)相進(jìn)行封閉；再將微流控芯片的微通道入口端插入到盛有傳熱液體的試管中，PCR 反應(yīng)溶液液滴所處位置浸在試管內(nèi)的傳熱液體中；2)根據(jù)不同PCR反應(yīng)溶液對溫區(qū)的要求，將相應(yīng)數(shù)量的試管安裝在與步進(jìn)電機(jī)固連的轉(zhuǎn)盤上，對各試管內(nèi)的傳熱液體進(jìn)行水浴加熱，并分別控制各試管內(nèi)的傳熱液體，使各試管內(nèi)的傳熱液體分別恒定于PCR擴(kuò)增所需要的不同溫度；3)控制步進(jìn)電機(jī)轉(zhuǎn)動，讓微流控芯片的微通道入口端內(nèi)的PCR反應(yīng)溶液液滴依次浸沒在不同溫度的試管的傳熱液體中，滿足PCR反應(yīng)各基本步驟對反應(yīng)時間的要求，步進(jìn)電機(jī)轉(zhuǎn)動一圈即完成一次PCR循環(huán)，轉(zhuǎn)動20 40圈就能完成一次完整的PCR擴(kuò)增過程。
8.如權(quán)利要求
7所述的一種在微流控芯片內(nèi)進(jìn)行核酸擴(kuò)增的方法，其特征在于在步驟 1)中，所述傳熱液體為水。
9.如權(quán)利要求
7所述的一種在微流控芯片內(nèi)進(jìn)行核酸擴(kuò)增的方法，其特征在于在步驟 1)中，所述有機(jī)相為醇、酯或礦物油。
專利摘要
一種在微流控芯片內(nèi)進(jìn)行核酸擴(kuò)增的裝置，涉及一種核酸擴(kuò)增裝置。提供一種能夠?qū)崿F(xiàn)快速的溫度循環(huán)，縮短擴(kuò)增過程所需的時間，實現(xiàn)溫度的精確控制，提高擴(kuò)增效率，降低試劑和樣品的消耗，減少干擾和交叉污染的在微流控芯片內(nèi)進(jìn)行核酸擴(kuò)增的裝置及其方法。裝置設(shè)有微流控芯片、步進(jìn)電機(jī)、轉(zhuǎn)盤、溫控器和均布在轉(zhuǎn)盤同一半徑圓周上的至少2個試管；轉(zhuǎn)盤與步進(jìn)電機(jī)輸出軸連接，各試管固于轉(zhuǎn)盤上，各試管內(nèi)均設(shè)有加熱件和溫度探頭，溫控器設(shè)于試管外部，加熱件和溫度探頭均與溫控器連接，微流控芯片的微通道入口端插入試管中。可采用所述裝置在微流控芯片內(nèi)進(jìn)行核酸擴(kuò)增。
文檔編號C12N15/10GKCN102154261 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請?zhí)朇N 201010604153
公開日2012年5月23日 申請日期2010年12月23日
發(fā)明者宋站雨, 瞿祥猛, 陳宏 , 陳瑞川 申請人:廈門大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (1), 非專利引用 (3),