專利名稱:癌癥和高度增生的自動(dòng)檢測(cè)方法
癌癥和高度增生的自動(dòng)檢測(cè)方法
發(fā)明背景
相關(guān)申請(qǐng)交叉引用
本PCT申請(qǐng)要求2009年3月10日提交的，申請(qǐng)?zhí)枮?2/400，975的美國(guó)專利申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)，該美國(guó)專利申請(qǐng)是2007年10月26日提交的，申請(qǐng)?zhí)枮?1/925，123的美國(guó)專利申請(qǐng)的部分繼續(xù)申請(qǐng)，所述11/925，123為2007年10月25日提交的，申請(qǐng)?zhí)枮?1/924，293的美國(guó)專利申請(qǐng)的繼續(xù)申請(qǐng)，所述11/924，293要求2006年10月25日提交的，申請(qǐng)?zhí)枮?0/862, 974的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)優(yōu)先權(quán)。該參考文獻(xiàn)和所有在本說(shuō)明書(shū)中引用的其他參考文獻(xiàn)，以及它們的參考文獻(xiàn)在適合用于教導(dǎo)額外的或備選的細(xì)節(jié)、特征和/或技術(shù)背景的情況下均通過(guò)弓I用的方式并入本文。
發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明一般涉及用于檢測(cè)受試者中癌癥和發(fā)育異常，尤其是高度發(fā)育異常的自動(dòng)方法。一方面，提供用于監(jiān)測(cè)一種或更多種癌癥治療方案有效性的方法。
相關(guān)技術(shù)的描述
許多方法已知有助于樣本的顯微分析。例如，非限制地，已知某些染料對(duì)某些細(xì)胞或亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)具有親和力。因此所述染料通過(guò)輔助進(jìn)一步顯示所述結(jié)構(gòu)，可用于輔助分析。染料與所述結(jié)構(gòu)的結(jié)合可以使用多種顯微檢測(cè)技術(shù)鑒定和分析。
細(xì)胞和組織的熒光顯微術(shù)為本領(lǐng)域所熟知。已開(kāi)發(fā)出在顯微鏡中使熒光細(xì)胞成像和提取所述細(xì)胞中發(fā)生的空間分布和時(shí)間變化相關(guān)信息的方法。一些上述方法及其應(yīng)用由Taylor等在American Scientist 80 (1992),第322-335頁(yè)的文章中有所描述。這些方法經(jīng)過(guò)設(shè)計(jì)和優(yōu)化，用于制備一些標(biāo)本，用于細(xì)胞中熒光報(bào)告分子的分布、含量和生化環(huán)境的高時(shí)空分辨率成像測(cè)量?？刹扇÷渖錈晒怙@微鏡檢測(cè)熒光信號(hào)，其使用發(fā)射的熒光形成圖像(而常規(guī)反射顯微鏡使用散射的照明光形成圖像)。落射熒光顯微鏡的激發(fā)光用于激發(fā)樣本中的熒光標(biāo)簽，使其發(fā)射熒光。落射熒光顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)在于，制備好的樣本中，熒光分子優(yōu)先附著在感興趣的生物結(jié)構(gòu)上，使該感興趣的生物結(jié)構(gòu)得以鑒別。
生物樣本的自動(dòng)顯微分析方法改進(jìn)了診斷程序，優(yōu)化了基于顯微鏡的診斷設(shè)備中的樣本通量。以下更全面描述的多個(gè)共同擁有的美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)了用于自動(dòng)顯微分析的設(shè)備和方法的方面和實(shí)施方案，包括整合的機(jī)器人顯微鏡系統(tǒng)，動(dòng)態(tài)自動(dòng)顯微操作和載玻片掃描系統(tǒng)，多種可互換的物鏡，濾鏡和適于在自動(dòng)顯微鏡系統(tǒng)中使用的類似元件，適于在自動(dòng)顯微鏡系統(tǒng)中使用的自動(dòng)顯微鏡載物臺(tái)，適于在自動(dòng)顯微鏡系統(tǒng)中使用的自動(dòng)顯微鏡載玻片盒和載玻片操作系統(tǒng)，適于在自動(dòng)顯微鏡系統(tǒng)中使用的自動(dòng)顯微鏡載玻片裝載和卸載機(jī)構(gòu)，應(yīng)用電腦內(nèi)置程序驅(qū)動(dòng)對(duì)生物樣本中的熒光信號(hào)進(jìn)行顯微檢測(cè)的自動(dòng)化方法，其可用于驅(qū)動(dòng)自動(dòng)顯微鏡的系統(tǒng)，使用電腦內(nèi)置程序以驅(qū)動(dòng)顯微鏡進(jìn)行用于圖像處理的FISH分析的顯微鏡自動(dòng)化操作。
縮寫(xiě)詞“FISH”(熒光原位雜交)指使用在被例如紫外或可見(jiàn)光源照射時(shí)發(fā)出特征性光或顏色的熒光標(biāo)簽或標(biāo)記以檢測(cè)染色體結(jié)構(gòu)的技術(shù)。FISH使用只與與其具有高度序列相似性的染色體的那些部分結(jié)合的熒光探針，所述探針可針對(duì)特異性染色體和特異性染色體區(qū)域，必須具有足夠長(zhǎng)度以與其靶標(biāo)(不與基因組中相似的序列)特異性雜交，但是不能太大而阻礙雜交過(guò)程，并且應(yīng)該用熒光團(tuán)直接標(biāo)記。標(biāo)記可以采用多種方式，例如，缺口平移和使用標(biāo)記核苷酸的PCR。如果需要增強(qiáng)信號(hào)而超過(guò)顯微鏡的檢測(cè)閾值(其取決于許多因素，例如探針標(biāo)記效率、探針和熒光染料的種類)，可以使用以例如生物素或地高辛等半抗原標(biāo)記的探針，特異性熒光標(biāo)記的抗體或鏈霉親和素與所述半抗原分子結(jié)合，從而使熒光增強(qiáng)。FISH技術(shù)可用于鑒定染色體異常和基因定位。
癌細(xì)胞中基因過(guò)表達(dá)的通常研究機(jī)制一般稱為基因擴(kuò)增，這是一個(gè)基因在祖細(xì)胞染色體內(nèi)復(fù)制成多拷貝的過(guò)程。該過(guò)程包括含有所述基因的染色體區(qū)域無(wú)計(jì)劃性的復(fù)制，隨后復(fù)制片段重組返回所述染色體(Alitalo K.等.(1986), Adv. Cancer Res. 47 235-281)，結(jié)果會(huì)產(chǎn)生50個(gè)或更多的基因拷貝。重復(fù)區(qū)域有時(shí)稱為“擴(kuò)增子”，轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的基因表達(dá)水平(即產(chǎn)生的信使RNA量)以與產(chǎn)生的基因拷貝數(shù)量同樣的比率升高(Alitalo 等)。與其它致癌基因，尤其是那些成神經(jīng)細(xì)胞瘤致癌基因相關(guān)的工作表明，原癌基因的基因重復(fù)與更惡性癌癥形式相關(guān)的事件，并可作為臨床結(jié)果的預(yù)示(Schwab M.等的綜述(1990), Genes Chromosomes Cancer I : 181-193 ;Alitalo 等)。在乳腺癌中，已有報(bào)告erbB2基因的重復(fù)與疾病復(fù)發(fā)和存活時(shí)間減低均相關(guān)(Slamon D. J.等.(1987)，Science235 =178-182)。有證據(jù)表明，erbB2有助于鑒別對(duì)使用環(huán)磷酰胺、阿霉素和氟尿嘧啶的輔助化療有反應(yīng)的腫瘤(Muss 等.N Engl J Med. 1994 330(18) :1260-6)。
在乳腺癌中發(fā)生基因重復(fù)的基因中僅有一部分被鑒定出來(lái)。首先，染色體異常，例如雙微(DM)染色體和均勻染色區(qū)(HSR)在癌細(xì)胞中大量存在。HSR是在染色體組型分析中全長(zhǎng)顯現(xiàn)中等密度吉姆薩染色，而非常規(guī)的明暗交替帶紋的模式，它們對(duì)應(yīng)于多基因重復(fù)。HSR在乳腺癌中尤其豐富，在所調(diào)查的腫瘤中最高達(dá)60-65%都有出現(xiàn)(DutrillauxB.等 (1990), Cancer Genet Cytogenet 49 :203-217 ；Zafrani B.等 (1992), HumPathol23 :542-547)。當(dāng)使用任意16個(gè)已知人致癌基因(包括erbB2和myc)的探針，通過(guò)原位雜交檢測(cè)所述區(qū)域時(shí)，僅有一部分腫瘤顯示了與HSR區(qū)域的任意雜交。而且，每個(gè)染色體組型中只有一部分HSR被牽涉。
第二，比較基因組雜交(CGH)已經(jīng)揭示腫瘤中拷貝數(shù)量的增加的存在，即使是在HSR外的染色體區(qū)域。CGH是一種新方法，其中使用兩種不同熒光染料對(duì)具有來(lái)自正常細(xì)胞和癌細(xì)胞的DNA片段的全長(zhǎng)伸展染色體進(jìn)行同時(shí)染色。圖像經(jīng)電腦處理，計(jì)算熒光比率，表明癌細(xì)胞中發(fā)生擴(kuò)增或缺失的染色體區(qū)域(Kallioniemi A.等.(1992), Science 258 818-821)。該方法最近被用于15種乳腺癌細(xì)胞系(Kallioniemi A.等.(1994)，Proc. Natl.Acad. Sci. USA 91 :2156-2160)，在所有23對(duì)染色體中均檢測(cè)到DNA序列拷貝數(shù)量的增加。
So, C-K 等(Clinical Cancer Research 10 19-27, 2004)發(fā)現(xiàn)在來(lái)自中國(guó)林州(林縣)的食管鱗狀細(xì)胞癌樣本中，環(huán)AMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CBP)，一種核轉(zhuǎn)錄輔激活蛋白，發(fā)生內(nèi)部串聯(lián)重復(fù)。So等表不，CBP基因的內(nèi)部串聯(lián)重復(fù)在人鱗狀細(xì)胞癌中是頻發(fā)的遺傳事件。
人表皮生長(zhǎng)因子受體2(HER-2)/neu(c-erbB_2)基因定位于染色體17q，編碼作為表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)或HER家族成員的跨膜酪氨酸激酶受體蛋白質(zhì)(Ross，JS等，TheOncologist.第8卷第4期，307-325，2003年8月)。HER-2基因在一部分，可能人乳腺癌的25%中發(fā)生擴(kuò)增。
熒光原位雜交(FISH)常用于檢測(cè)染色體異常，包括序列改變，例如在致癌基因中發(fā)現(xiàn)的單核苷酸多態(tài)性或突變。
已經(jīng)公開(kāi)許多用于篩查癌癥和發(fā)育異常，例如高度發(fā)育異常的方法和試劑盒。
例如，由Abbott Molecular制造的Pro Vysion多色探針組設(shè)計(jì)用于檢測(cè)和定量8號(hào)染色體，位于8p22的脂蛋白脂酶(LPL)基因和位于8q24區(qū)域的C-MYC基因。8q24和8p21-22 (LPL)的增加以及雜合性缺失為兩種在異常樣本中觀察到的遺傳變異。ProVysion多色探針組由具有三種獨(dú)立熒光團(tuán)標(biāo)記的三種探針組成。據(jù)稱多色探針組被設(shè)計(jì)用于同時(shí)分析單個(gè)細(xì)胞中的三個(gè)基因組標(biāo)志物用SpectrumAqua標(biāo)記的CEP 8探針、用 SpectrumOrange 標(biāo)記的 LSI LPL 和用 SpectrumGreen 標(biāo)記的 LSI C-MYC0 CEP 8 a 衛(wèi)星 DNA探針與8號(hào)染色體的著絲粒區(qū)域(8pll. 1-qll. I)雜交，提供了用于鑒定8號(hào)染色體拷貝數(shù)的機(jī)制。LSI LPL大小為約170kb，與8p22上的LPL基因雜交。LSI C-MYC探針(約750kb探針)與位于8q24的C-MYC基因雜交。制造商聲稱，在與ProVysion多色探針組雜交的正常細(xì)胞中，預(yù)期的模式是兩個(gè)橙色、兩個(gè)綠色和兩個(gè)淺綠色信號(hào)(202G2A)信號(hào)模式，而在異常細(xì)胞中，可觀察到三種探針信號(hào)拷貝的組合。檢測(cè)試劑盒指示，多于或少于兩個(gè)任意探針的拷貝數(shù)分別表明染色體或基因的增加或缺失。相對(duì)于CEP 8的拷貝數(shù)，少于兩個(gè)拷貝的LSI LPL或LSI C-MYC探針的多重拷貝分別表明相對(duì)于8號(hào)染色體拷貝數(shù)，LPL區(qū)域的缺失和C-MYC區(qū)域的增加。
Vysis公司的公開(kāi)號(hào)為2004/028107和2005/0026190的美國(guó)專利要求保護(hù)使用探針和探針組在子宮頸細(xì)胞中檢測(cè)高度發(fā)育異常和癌的方法。該方法需要使一個(gè)或更多個(gè)染色體探針與生物樣本雜交，并檢測(cè)染色體探針的雜交模式，以確定受試者是否患有高度發(fā)育異?；虬┌Y。該方法包括使用一個(gè)或更多個(gè)探針的組，其矢量值(vector value)為約60或更少，其中矢量值如下計(jì)算矢量值=[(100-特異性)2+(100-靈敏度)2]"2。所述染色體探針可包括用于特異性基因座，例如8q24、3q36、Xp22和CEP15的探針，或者例如與HPV-16、HPV-18、HPV-30、HPV-45、HPV-51和HPV-58中每一個(gè)的全編碼序列基本互補(bǔ)的探針。待篩查的生物樣本可以預(yù)篩查細(xì)胞周期蛋白質(zhì)的存在，例如P16或CyclinE，或細(xì)胞增殖標(biāo)志物，例如Ki67或PCNA。
Abbott Molecular公布號(hào)為2006/0063194的美國(guó)專利也公開(kāi)了探針組，以及使用探針和探針組檢測(cè)癌癥，尤其是肺癌的方法?；蜃禺愋蕴结樅腿旧w計(jì)數(shù)探針聯(lián)合使用，其雜交模式用于確定受試者是否患有肺癌。確定出染色體組分，例如，用于確定肺癌的探針組可包括5pl5基因座特異性探針、8q24基因座特異性探針、6號(hào)染色體計(jì)數(shù)探針和7p 12基因座特異性探針。
診斷性FISH光點(diǎn)計(jì)數(shù)已由熟練的顯微鏡技術(shù)人員常規(guī)手工操作，除了正確地鑒別點(diǎn)及其顏色外，其它的大小和形狀特征必須進(jìn)行分類，以正確地鑒定染色體狀態(tài)。由于該現(xiàn)象影響造成的時(shí)間緊迫使得分析更加困難，因此，顯微鏡技術(shù)人員必須接受訓(xùn)練以實(shí)施該項(xiàng)檢測(cè)。即使在最優(yōu)條件下，該方法也是單調(diào)、冗長(zhǎng)并易受人為錯(cuò)誤影響。
自動(dòng)顯微鏡檢測(cè)的應(yīng)用具有克服手動(dòng)操作多種缺點(diǎn)的潛質(zhì)。自動(dòng)化顯微鏡能夠可靠地鑒別樣本中的熒光點(diǎn)，準(zhǔn)確地確定其顏色，基于形狀和大小對(duì)其分類，并進(jìn)行必要的概要分析以確定目標(biāo)狀態(tài)的存在與否，而不受操作人員在所有適時(shí)操作中所引入的不可避免的主觀因素影響。
值得注意的是，用于檢測(cè)癌癥的試劑盒通常被設(shè)計(jì)僅用來(lái)提供陽(yáng)性或者陰性的答案——是否患有特定的癌癥。雖然這樣的檢測(cè)表明需要例如化療的干預(yù)療法，但其并不被設(shè)計(jì)為指導(dǎo)人們采取最適當(dāng)?shù)母深A(yù)療法。相反地，癌癥患者經(jīng)常接受多重療法，并且療效只能由治療開(kāi)始后多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的癌癥狀態(tài)的快照(snap-shots)確定。這樣的快照需要例如用MRI和CAT掃描身體，以確定腫瘤的生長(zhǎng)或縮減。由于所述快照方法需要一定的經(jīng)濟(jì)成本，其本身也存在風(fēng)險(xiǎn)(如輻射暴露)，這樣的快照能以比考慮到快速干預(yù)以解決疾病狀態(tài)的需要所期望的時(shí)間更長(zhǎng)的時(shí)間間隔進(jìn)行。如下文所提出的，本發(fā)明人還認(rèn)識(shí)到，使用自動(dòng)顯微鏡檢測(cè)不僅可有利地用于確定某人是否罹患特定的癌癥/增生進(jìn)行，還可作為監(jiān)測(cè)工具，以確定針對(duì)癌癥/高度增生的治療的不同干預(yù)治療手段的效果。在一個(gè)實(shí)施方案中，療效監(jiān)測(cè)通過(guò)監(jiān)測(cè)體循環(huán)(包括血管和淋巴系統(tǒng))中的癌癥/增生細(xì)胞，癌癥/增生相關(guān)異常細(xì)胞數(shù)量的減少視為治療成功的指示，所述細(xì)胞減少程度被用作一種療法相對(duì)于另一種療法的效能的度量。本領(lǐng)域需要對(duì)用可檢測(cè)的標(biāo)記探針，包括熒光標(biāo)記探針處理的癌組織樣本進(jìn)行自動(dòng)成像和圖像分析。此外，還需要對(duì)上述標(biāo)記樣本進(jìn)行便捷、快速、非手工的自動(dòng)熒光顯微檢測(cè)。
發(fā)明簡(jiǎn)述
本文公開(kāi)了多種實(shí)施方案。
在一個(gè)實(shí)施方案中，一種篩查受試者中病變的存在和/或程度的自動(dòng)方法，所述病變的特征在于受試者細(xì)胞中的異常染色體成分，其包括以下步驟
a)使來(lái)自所述受試者的包含細(xì)胞核的生物樣本與針對(duì)至少一種表現(xiàn)異常特征的染色體序列的一種或更多種可區(qū)分的標(biāo)記探針接觸，所述接觸在促進(jìn)所述一種或更多種探針與所述至少一種序列雜交的條件下進(jìn)行；
b)自動(dòng)獲得所述一種或更多種與染色體序列雜交的可區(qū)分的標(biāo)記的表現(xiàn)(representation)；
c)自動(dòng)分析所述表現(xiàn)中一種或更多種標(biāo)記結(jié)合的分布和強(qiáng)度，以確定異常染色體成分的存在和/或程度；和
d)自動(dòng)報(bào)告步驟c)的分析結(jié)果；
其中步驟b)至d)在無(wú)人干預(yù)下實(shí)施。
在篩查方法的多個(gè)其它的實(shí)施方案中，自動(dòng)顯微鏡系統(tǒng)實(shí)施自動(dòng)獲得表現(xiàn)、自動(dòng)分析結(jié)合和自動(dòng)報(bào)告結(jié)果中的一個(gè)，并且通常是所有的步驟。在該方法中，獲得表現(xiàn)和實(shí)施自動(dòng)成像分析鑒定病變特征性的核酸性質(zhì)。多種靶向的染色體異?？砂▎魏塑账岫鄳B(tài)性(SNP)、突變序列，重復(fù)的基因或其部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，靶向的染色體基因座(單種或復(fù)數(shù)種)在TERC和PIK3A序列附近的800kb區(qū)域內(nèi)，探針的染色體靶標(biāo)包括人3號(hào)或7號(hào)染色體的著絲?；虬行蛄校约叭炕虿糠諸ERC基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，靶向的染色體基因座(單種或復(fù)數(shù)種)為PIK3A序列，該靶向的染色體基因座(單種或復(fù)數(shù)種)也可位于TERC和/或PIK3A基因或其部分的5'和3'附近區(qū)域。在另外的實(shí)施方案中，對(duì)照探針針對(duì)7號(hào)和/或3號(hào)染色體著絲粒區(qū)域，在該實(shí)施方案中，每個(gè)細(xì)胞核的7號(hào)和/或3號(hào)染色體的對(duì)照計(jì)數(shù)為2個(gè)信號(hào)，針對(duì)靶向的染色體異常的探針的4個(gè)，優(yōu)選5個(gè)或更多的計(jì)
數(shù)表明高度增生或癌癥。
在另外的實(shí)施方案中，可使用多種針對(duì)已知不是異常的染色體基因座的參照探針或參照染色劑，以使獲得表現(xiàn)和分析步驟以參照探針或染色劑為參照。
在另外的實(shí)施方案中，篩查受試者中與癌癥、高度增生或高度發(fā)育異常相關(guān)異常的自動(dòng)方法包括以下步驟
a)從受試者中獲得包含細(xì)胞核的生物樣本；
b)在促進(jìn)探針與靶向的染色體基因座雜交的條件下，使樣本中的細(xì)胞核與第一探針接觸，該第一探針具有針對(duì)異常相關(guān)的染色體序列的第一可檢測(cè)標(biāo)記；c)在所述雜交條件下，使樣本與針對(duì)已知不是異常的染色體基因座的可檢測(cè)地標(biāo)記的參照探針和參照染色劑中的至少一種接觸；
d)使結(jié)合于染色體序列的標(biāo)記自動(dòng)成像，并使染色劑(如使用)成像；
e)自動(dòng)分析圖像中雜交標(biāo)記和染色劑(如使用)的分布和強(qiáng)度；和
f)自動(dòng)報(bào)告步驟e)的分析結(jié)果；
其中步驟d)至f)在無(wú)人干預(yù)下實(shí)施；
從而提供對(duì)受試者異常的評(píng)估。
在所述篩查方法的實(shí)施方案中，在接觸步驟之前，從樣本中分離細(xì)胞核，并將其沉積形成一層細(xì)胞核。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，自動(dòng)顯微鏡實(shí)施自動(dòng)成像、自動(dòng)分析和自動(dòng)報(bào)告結(jié)果中的至少一個(gè)，并且通常是所有的步驟。該單層細(xì)胞核可由本領(lǐng)域已知的多種方法制備，例如對(duì)得自石蠟包埋的腫瘤組織樣本的薄切片進(jìn)行適當(dāng)加工。在該方法中，獲自受試者的樣本可從多處來(lái)源獲得。在該篩查方法的其他實(shí)施方案中，自動(dòng)顯微鏡在該方法的多個(gè)階段使用，包括自動(dòng)提供圖像，經(jīng)顯微鏡自動(dòng)優(yōu)化圖像發(fā)生的視野后獲得圖像，從樣本視野中的兩個(gè)或更多個(gè)平面獲得圖像以實(shí)施對(duì)圖像的自動(dòng)分析。在多種實(shí)施方案中，異?？蔀榘┌Y、高度增生或高度發(fā)育異常。由探針靶向的多種異?？梢园▎魏塑账岫鄳B(tài)性、突變的序列、重復(fù)的基因或其部分。另外，在某些實(shí)施方案中，探針靶向3號(hào)或7號(hào)染色體的著絲粒，或包含TERC基因或其部分的序列。
在另個(gè)實(shí)施方案中，公開(kāi)了在治療患者中的癌癥或高度增生期間，監(jiān)測(cè)隨時(shí)間推移的治療功效的自動(dòng)方法，該方法包括以下步驟
(a)自患者獲得流體生物樣本，其中含有與癌癥或高度增生相關(guān)的細(xì)胞；
(b)用一種或更多種可檢測(cè)地標(biāo)記的染色體探針處理流體生物樣本或其部分，所述探針對(duì)一個(gè)或更多個(gè)染色體基因座具有高度序列相似性，所述染色體基因座或其擴(kuò)增與癌癥或高度增生相關(guān)，其中所述處理在足以使探針與樣本中的染色體雜交的條件下實(shí)施；
(c)自動(dòng)掃描經(jīng)處理的流體生物樣本，檢測(cè)一個(gè)或更多個(gè)結(jié)合于一個(gè)或更多個(gè)染色體探針的標(biāo)記，所述探針與樣本中的任意染色體雜交；
(d)自動(dòng)檢測(cè)與雜交至所述染色體探針的染色體相關(guān)的細(xì)胞數(shù)量；和
(e)在療程的不同時(shí)間自動(dòng)比較步驟(C)和⑷中提供的標(biāo)記雜交模式和細(xì)胞數(shù)結(jié)果，從而評(píng)估所述治療在治療癌癥或高度增生中的療效。
在不同實(shí)施方案中，流體生物樣本包括血液、淋巴、尿液、滲出液、上皮碎屑、灌洗液、生物流體、一種或更多種活組織檢查樣本、手術(shù)切除樣本涂片(例如來(lái)自子宮頸)、口腔粘膜涂片、抽吸液、唾液、痰和組織的一種或更多種。
在一個(gè)實(shí)施方案中，以I天或更長(zhǎng)的時(shí)間間隔實(shí)施監(jiān)測(cè)。在監(jiān)測(cè)療效的該方法的其它實(shí)施方案中，自動(dòng)顯微鏡系統(tǒng)進(jìn)行至少一次自動(dòng)掃描，該自動(dòng)檢測(cè)使用自動(dòng)顯微鏡系統(tǒng)，還自動(dòng)優(yōu)化樣本掃描的視野，并在樣本視野中的兩個(gè)或更多個(gè)平面進(jìn)行掃描。在多種實(shí)施方案中，自動(dòng)顯微鏡系統(tǒng)在無(wú)人干預(yù)下操作。在另一些實(shí)施方案中，探針靶向單核苷酸多態(tài)性(SNP)、突變的序列、重復(fù)或擴(kuò)增的基因或其部分、3號(hào)染色體著絲粒、7號(hào)染色體著絲粒、包含TERC基因或其部分的序列中的至少一種。
在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中 ，公開(kāi)了用于染色體異常的自動(dòng)高通量表征方法。該方法包括以下步驟
a)提供至少一塊其上包含生物樣本的顯微鏡載玻片，其中所述樣本疑似具有染色體異常，且其中所述樣本已與至少一種特異于檢測(cè)異常的可檢測(cè)地標(biāo)記探針雜交；
b)將所述至少一塊包含樣本的載玻片在用于自動(dòng)、可翻轉(zhuǎn)放置載玻片的裝置中安裝于自動(dòng)顯微鏡載物臺(tái)上；
c)使所述放置裝置自動(dòng)化、可翻轉(zhuǎn)地將包含樣本的載玻片可翻轉(zhuǎn)地放置于顯微鏡載物臺(tái)上；
d)使顯微鏡自動(dòng)獲得標(biāo)本的至少一個(gè)圖像，其中所述圖像包括與染色體雜交的標(biāo)記探針的表現(xiàn)；
e)使顯微鏡自動(dòng)分析圖像，以表征異常；
f)自動(dòng)報(bào)告步驟(e)的分析結(jié)果；和
g)自動(dòng)重復(fù)步驟(C)至(f) o
在多種實(shí)施方案中，自動(dòng)顯微鏡在無(wú)人干預(yù)下運(yùn)行。在該高通量方法的其它實(shí)施方案中，自動(dòng)化顯微鏡通過(guò)優(yōu)化圖像產(chǎn)生的視野，自動(dòng)獲得圖像，并從細(xì)胞核視野的兩個(gè)或更多個(gè)平面獲得圖像。生物樣本可來(lái)源于任意不同的組織和生物流體。此外，異?？蔀榘┌Y、高度增生或高度發(fā)育異常。由用于高通量方法中的探針靶向的各種異?？砂▎魏塑账岫鄳B(tài)性(SNP)、突變的序列、重復(fù)的或擴(kuò)增的基因或其部分、3號(hào)染色體著絲粒、7號(hào)染色體著絲粒、包含TERC基因或其部分的序列中的至少一種。
再一個(gè)實(shí)施方案公開(kāi)了一種方法，其按順序包括(a)在足以使探針與樣本中的染色體(如果有的話)雜交的條件下，使與一個(gè)或更多個(gè)部分的染色體物質(zhì)具有高度序列相似性的一個(gè)或更多個(gè)染色體探針與生物樣本雜交，所述探針的特征在于用一個(gè)或更多個(gè)可被檢測(cè)器檢測(cè)的標(biāo)簽標(biāo)記；(b)自動(dòng)掃描生物樣本,并用檢測(cè)器檢測(cè)與雜交至樣本中任意染色體的一種或更多種染色體探針相關(guān)的一個(gè)或更多個(gè)標(biāo)簽；和(C)自動(dòng)報(bào)告用雜交探針和與染色體相關(guān)的特定探針標(biāo)記的樣本中染色體(如果有的話)。
此處公開(kāi)方法的多種實(shí)施方案中，著絲粒探針可針對(duì)已知具有基因座的染色體，該基因座的重復(fù)或存在與特定的癌癥狀態(tài)相關(guān)。例如，著絲粒探針可針對(duì)3號(hào)和/或7號(hào)染色體。針對(duì)單拷貝序列的基因座特異性探針同樣可與癌癥相關(guān)基因座，例如3號(hào)染色體q臂上的基因座雜交。在足以使探針與樣本中的染色體雜交的條件下，探針本身可有利地與基因座相關(guān)的一個(gè)或更多個(gè)部分的染色體物質(zhì)具有高度序列相似性，所述基因座或其擴(kuò)增與特定癌癥/增生相關(guān)。探針，例如可以是由四個(gè)包含染色體3q26位上TERC基因的重疊BAC克隆組成的重疊群?？蓪⒘硗獾闹z粒或基因座特異性探針添加至探針混合物中。核染色可采用復(fù)染方法，核染色劑可以是，例如DAPI。在自動(dòng)掃描樣本時(shí)，可將樣本裝載到視野自動(dòng)切換的自動(dòng)顯微鏡上。顯微鏡可被程控或者可操作化地配置為允許監(jiān)測(cè)若干信號(hào)通道。例如，自動(dòng)顯微鏡可在DAPI和其它熒光通道掃描(以便對(duì)例如3號(hào)染色體信號(hào)、3q上的基因座信號(hào)，以及其它著絲?；蚧蜃禺愋孕盘?hào)計(jì)數(shù))。掃描的細(xì)胞核可由自動(dòng)顯微鏡自動(dòng)記錄，和/或被提交給細(xì)胞遺傳學(xué)者和/或病理學(xué)者，或其它醫(yī)療服務(wù)人員。提交方式多種多樣，例如以分類的方式，首先提交具有異常計(jì)數(shù)的對(duì)象(如首先提交計(jì)數(shù)不等于2的3q)?？梢詸z測(cè)不同的癌癥，例如宮頸癌(使用例如用于3號(hào)和/或7號(hào)染色體的著絲粒探針，以及用于3號(hào)染色體q臂上的單拷貝序列的基因座特異性探針，其包括由四個(gè)含有位于染色體3q26上的TERC基因或其部分的重疊BAC克隆組成的重疊群，DAPI核復(fù)染，然后計(jì)數(shù)3號(hào)染色體信號(hào)、3q上基因座的信號(hào)，找出3q相關(guān)信號(hào)不為2的異常計(jì)數(shù))。
上述實(shí)施方案中的自動(dòng)掃描可例如通過(guò)自動(dòng)顯微鏡來(lái)實(shí)施，其中將生物標(biāo)本放置在載玻片上，其通過(guò)手工或自動(dòng)化裝載在顯微鏡載物臺(tái)上，并自動(dòng)掃描載玻片。上述系統(tǒng)中可用的自動(dòng)顯微鏡如同在申請(qǐng)人其它的專利申請(qǐng)(參見(jiàn)下文)中所描述的。生物樣本也可放置在其他基質(zhì)上/內(nèi)進(jìn)行掃描。掃描可包括掃描生物樣本的一個(gè)或多于一個(gè)平面，例如 兩個(gè)、三個(gè)或更多。通過(guò)在多個(gè)平面掃描，可顯著改善對(duì)就樣本中細(xì)胞總量而言較少的異常細(xì)胞的檢測(cè)。探針可采用FISH探針，其熒光信號(hào)由檢測(cè)器檢得。探針可在有或沒(méi)有另一個(gè)輸入信號(hào)下產(chǎn)生信號(hào)，例如它們可為放射性的，或被激發(fā)信號(hào)(例如適合波長(zhǎng)的光或其它電磁輻射)撞擊時(shí)發(fā)出熒光。探針可針對(duì)不同的重復(fù)相關(guān)的癌癥基因座，并且可包括不同的熒光標(biāo)簽，以產(chǎn)生不同的信號(hào)?？梢罁?jù)由標(biāo)簽產(chǎn)生的信號(hào)選擇檢測(cè)器，如用于檢測(cè)熒光標(biāo)簽的熒光檢測(cè)器，其可操作化地配置為可以檢測(cè)由熒光標(biāo)簽產(chǎn)生的特定熒光信號(hào)。報(bào)告可包括與特定染色體相關(guān)的特定標(biāo)簽的簡(jiǎn)單報(bào)告，和/或可以包括自動(dòng)診斷報(bào)告(表明與染色體的特定雜交模式相關(guān)的癌癥類型)。與正常標(biāo)本比較的矢量值可選定小于特定閾值，例如小于約60，小于約40，小于約30，小于約20，小于約10或小于約0. 500。有用的系統(tǒng)可包括同時(shí)，或在相對(duì)短的時(shí)間間隔內(nèi)(如小于I分鐘)，完成多信號(hào)通道的自動(dòng)掃描和檢測(cè)?？蓪?duì)系統(tǒng)進(jìn)行可操作化地配置，以同時(shí)或并行(或其混合)的方式，實(shí)時(shí)處理多信號(hào)中的每個(gè)信號(hào)，實(shí)現(xiàn)染色體區(qū)域和/或代表一種或更多特定癌癥/增生的區(qū)域性重復(fù)的快速檢測(cè)。


附圖I是宮頸癌診斷方法的流程示意圖。
發(fā)明詳述
這里使用的“標(biāo)簽”和“標(biāo)記”同義地指與探針綴合，并使該探針可被特定檢測(cè)方法和方式檢測(cè)的部分。
這里使用的“探針”一般指特異性設(shè)計(jì)以結(jié)合細(xì)胞靶標(biāo)，而不與非靶標(biāo)細(xì)胞部分或結(jié)構(gòu)顯著結(jié)合的物質(zhì)。在幾個(gè)實(shí)施方案中，探針可為核酸、聚核苷酸或寡核苷酸，其序列與細(xì)胞染色體或其它的核酸中的靶序列充分互補(bǔ)，在適當(dāng)?shù)臈l件下與其雜交。在多種其它實(shí)施方案中，探針可為帶有特異性地靶向細(xì)胞結(jié)構(gòu)的特異性決定結(jié)合部位的抗體或其部分。
這里使用的“表現(xiàn)” 一般指表征使用特定檢測(cè)方法檢查生物樣本所得結(jié)果的任何視覺(jué)、圖形、數(shù)字信息或類似的信息集合。通過(guò)非限制性實(shí)施例，表現(xiàn)包括含有至少一部分生物樣本的顯微鏡視野的圖像，例如通過(guò)電腦驅(qū)動(dòng)的方式將附帶顏色值的信息轉(zhuǎn)變?yōu)橐曇爸刑囟ㄌ卣鞯倪M(jìn)一步修飾的圖像，表征來(lái)自樣本圖像的特定特征的圖象顯示，表征來(lái)自圖像特征的數(shù)值或語(yǔ)言條目的表格。
這里使用的“靶標(biāo)”、“被靶向”、“靶向”和類似的詞或短語(yǔ)一般指探針特異性針對(duì)的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。靶標(biāo)是探針和靶標(biāo)組成的特異性結(jié)合對(duì)的成員的任意結(jié)構(gòu)或成分。探針和靶標(biāo)具有相互結(jié)合的高特異性和親和力，而對(duì)于不意圖被識(shí)別的探針或靶標(biāo)分別具有低特異性和低親和力。對(duì)于包括核酸或至少特異性堿基序列的探針而言，靶標(biāo)是在細(xì)胞的染色體或核酸成分中的互補(bǔ)序列。對(duì)于為抗體或其特異性結(jié)合片段的探針而言，靶標(biāo)可以是細(xì)胞中的抗原或半抗原結(jié)構(gòu)。在該框架下，探針是“靶向”部分，而靶標(biāo)結(jié)構(gòu)被探針“靶向”。
這里提供了利用信號(hào)自動(dòng)檢測(cè)來(lái)檢測(cè)和監(jiān)測(cè)癌癥和增生，尤其是高度增生的系統(tǒng)和方法。
在有代表性的實(shí)施方案中，將生物樣本用具有可檢測(cè)標(biāo)簽的一種或更多種染色體探針進(jìn)行質(zhì)詢(interrogate)。所述染色體探針可選擇和/或配置為與對(duì)指示癌癥或增生， 例如高度增生相關(guān)的成分的一個(gè)或更多個(gè)部分的染色體物質(zhì)具有高度序列相似性。所述探針可選擇與染色體上某區(qū)域相關(guān)，所述區(qū)域指示癌癥/增生或其擴(kuò)增與癌癥/增生相關(guān)。例如，染色體上的特定基因座的多重重復(fù)可為癌癥/增生的指征。有利地，探針上的標(biāo)簽直接或間接(如通過(guò)將另一個(gè)可檢測(cè)的分子結(jié)合至標(biāo)簽的一部分)地可檢測(cè)。在一種情況下，標(biāo)簽是熒光的，例如在FISH(熒光原位雜交)中。為了促進(jìn)標(biāo)記的探針和染色體物質(zhì)上的感興趣基因座之間的雜交，雜交應(yīng)該在可充分雜交的條件下實(shí)施。在這樣的實(shí)施方案中，用可檢測(cè)標(biāo)簽的檢測(cè)器自動(dòng)掃描樣本。自動(dòng)掃描可由經(jīng)可操作化配置，在多個(gè)視野搜尋樣本的自動(dòng)顯微鏡進(jìn)行，無(wú)需人為干預(yù)。將標(biāo)簽與特定的染色體關(guān)聯(lián)的能力，使得人們能夠確定雜交特性是否可指示癌癥或增生，例如高度增生。這樣的關(guān)聯(lián)可以確定癌癥/增生是否可能存在。可選地，上述實(shí)施方案的系統(tǒng)可包括例如軟件、硬件或軟件/硬件組合的裝置，用于自動(dòng)報(bào)告樣本中用雜交探針標(biāo)記的染色體和與染色體相關(guān)的特定探針。作為自動(dòng)顯微鏡系統(tǒng)的一部分，基于雜交的自動(dòng)診斷也可提供。
在另一個(gè)有代表性的實(shí)施方案中，提供監(jiān)測(cè)治療癌癥或增生，例如高度增生的療效的方法和系統(tǒng)?？呻S著時(shí)間的推移實(shí)施監(jiān)測(cè)，以便在患者接受治療時(shí)跟蹤治療方案的效果。在這樣的實(shí)施方案中，易于獲得的流體樣本，例如血液、淋巴、滲出液、灌洗液或抽吸液從接受癌癥和/或增生治療的患者中獲取。這樣獲得的任何樣本均具有有核細(xì)胞，包括疑似具有癌癥或高度增生特征性的可檢測(cè)的染色體異常的細(xì)胞。然后用與染色體物質(zhì)中的特異性基因座或部位雜交的染色體探針處理樣本，例如，以檢測(cè)與由流體樣本包含的異常樣本相關(guān)的擴(kuò)增?？蛇x地，可使用針對(duì)不同基因座的多重探針，其中兩個(gè)或更多個(gè)所述基因座與特定的癌癥/增生相關(guān)。這樣的組合的使用可以改善癌癥/增生的檢測(cè)效率。有利地，用不同的標(biāo)簽，例如不同的熒光標(biāo)簽標(biāo)記上述多重探針。選擇標(biāo)簽以使可被與自動(dòng)掃描裝置，例如自動(dòng)顯微鏡相關(guān)聯(lián)的檢測(cè)器讀取，自動(dòng)顯微鏡可操作化地配置以便在無(wú)人干預(yù)下重復(fù)觀察樣本的不連續(xù)區(qū)域。通過(guò)檢測(cè)與雜交至樣本中染色體的一個(gè)或更多個(gè)染色體探針相關(guān)的標(biāo)簽，檢測(cè)者可確定是否見(jiàn)到指示癌癥/增生的雜交模式。通過(guò)自動(dòng)檢測(cè)與用染色體探針雜交的染色體相關(guān)的細(xì)胞數(shù)量，可改善檢測(cè)效率。即，通過(guò)判斷指示異常染色體組的流體中的細(xì)胞數(shù)量是否比在較早前看到的細(xì)胞數(shù)量少或多，檢測(cè)者可判斷正在使用的治療對(duì)于癌癥/增生的治療是否有效。因而，針對(duì)特定癌癥的特定療法的療效基于隨著時(shí)間推移在生物樣本中檢測(cè)到的細(xì)胞數(shù)量的變化。例如，如果治療后比治療前所見(jiàn)細(xì)胞減少，可確定該治療是有效的。也可通過(guò)循環(huán)異常細(xì)胞的減少程度比較不同的療法。
作為方法的變型，提供用于監(jiān)測(cè)治療癌癥或增生的療效的方法和系統(tǒng)，患者無(wú)需前往醫(yī)療機(jī)構(gòu)或醫(yī)院便可提供樣本。例如，可向患者提供試劑盒、系統(tǒng)或類似的設(shè)備，以獲取血液樣本，并利用此處描述的方法進(jìn)行后續(xù)分析。在這樣的非限制性實(shí)例中，采集小體積的血液樣本，例如一滴或數(shù)滴，可選地進(jìn)行處理以防止凝集，可選地將其沉積在載玻片上，或保持于適于隨后分析的狀態(tài)。收集所述樣本的安排可包括每天取樣，或每隔一天取樣，或每周兩次，或每周一次，或每?jī)芍芤淮?，或每月一次，或更長(zhǎng)的時(shí)間間隔。樣本可以儲(chǔ)存在干燥的腔室內(nèi)，也可以在等待運(yùn)輸或轉(zhuǎn)運(yùn)，以及后續(xù)分析時(shí)將樣本冷藏或冷凍。
在有代表性的實(shí)施方案中還描述可用于檢測(cè)與染色體3q的擴(kuò)增相關(guān)的癌癥/增生，例如高度增生的系統(tǒng)/方法。在一個(gè)實(shí)施方案方法中，制備用于分裂間期FISH雜交的單層細(xì)胞核。例如，可對(duì)來(lái)自石蠟包埋的腫瘤組織樣本的薄切片進(jìn)行適當(dāng)加工，以提供核涂片，從而獲得細(xì)胞核層。然后用3號(hào)或7號(hào)染色體的著絲粒探針對(duì)核涂片染色。在此之后、 之前或同時(shí)，也可用3號(hào)染色體q臂上的單拷貝序列基因座特異性探針對(duì)核涂片染色，該序列指示感興趣的癌癥/增生狀態(tài)。例如，探針可以是由四個(gè)包含染色體3q26位上TERC基因或其部分的重疊BAC克隆組成的重疊群?？蓪⑵渌闹z?；蚧蜃禺愋蕴结樇又猎撎结樆旌衔镏小Ｔ谝粋€(gè)有利的方面，每種探針用不同的熒光染料標(biāo)記，以便更容易地檢測(cè)不同的信號(hào)。可選地，可用核染色劑，例如DAPI復(fù)染涂片。然后將染色的涂片應(yīng)用于自動(dòng)掃描裝置，例如自動(dòng)顯微鏡，并且在DAPI和所需的許多熒光通道中自動(dòng)掃描，以計(jì)數(shù)3號(hào)染色體的信號(hào)，3q上基因座的信號(hào)和任意其它著絲?；蚧蜃禺愋孕盘?hào)。掃描的細(xì)胞核可提交給專業(yè)醫(yī)療服務(wù)人員，例如細(xì)胞遺傳學(xué)者或病理學(xué)者進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果可以以分類的方式提交給專業(yè)醫(yī)療服務(wù)人員，例如，首先提交具有3q相關(guān)信號(hào)異常計(jì)數(shù)(如不等于2)的細(xì)胞核?？蛇x擇地，或聯(lián)合地，該系統(tǒng)可進(jìn)行可操作化配置(如通過(guò)程序)，以基于預(yù)先程序化的運(yùn)算法則(例如)分析掃描的核，并且向醫(yī)療服務(wù)人員提供自動(dòng)診斷指示。這樣的檢驗(yàn)可用于檢測(cè)多種癌癥，包括宮頸癌。
用于實(shí)施生物樣本的顯微分析的自動(dòng)設(shè)備和方法可改進(jìn)診斷程序，優(yōu)化基于顯微鏡的診斷設(shè)備中的樣本通量。在2007年8月2日提交的共同擁有的美國(guó)專利申請(qǐng)11833203中，描述了一種機(jī)器人顯微鏡系統(tǒng)。其公開(kāi)了一種沿著第二表面的可置換的集成顯微鏡系統(tǒng)，其包括安置在不透光的外殼中的自動(dòng)機(jī)器人顯微鏡系統(tǒng)。在該系統(tǒng)中，所述自動(dòng)機(jī)器人顯微鏡系統(tǒng)包括(i)有載物臺(tái)的顯微鏡；(ii)可定位在載物臺(tái)上的至少一塊標(biāo)本載玻片；
(iii)照射載玻片的光源；(iv)捕捉標(biāo)本圖像的圖像捕捉裝置；和(V)與所述標(biāo)本載玻片、光源和圖像捕捉裝置聯(lián)通并控制其定位的電、電子和/或電腦驅(qū)動(dòng)的裝置。此外，在該系統(tǒng)中，不透光的外殼包括殼內(nèi)至少一塊擱板，其中所述自動(dòng)機(jī)器人顯微鏡系統(tǒng)被放置在擱板上；以及能夠顯示被觀察或分析的顯微視野的圖像或表現(xiàn)的觀察監(jiān)視器，其放置在從外殼外部的位置可見(jiàn)的所述外殼表面。
參見(jiàn)附圖1，其呈現(xiàn)了一種生物樣本宮頸癌細(xì)胞的自動(dòng)篩查方法的實(shí)施方案。獲得一個(gè)包含從受試者中獲取的帶有細(xì)胞核的生物樣本的載玻片(步驟10)，所述生物樣本先與具有針對(duì)7號(hào)染色體的第一可檢測(cè)標(biāo)記的第一細(xì)胞核著絲粒探針接觸(步驟20)，再與具有針對(duì)3號(hào)染色體q臂上的單拷貝序列的第二可檢測(cè)標(biāo)記的第二細(xì)胞核非著絲粒探針接觸(步驟30)，其中所述單拷貝序列包括四個(gè)包含染色體3q26位上至少部分TERC基因的重疊BAC克隆的重疊群序列，并以DAPI復(fù)染。所述第一和第二探針在促進(jìn)每個(gè)所述第一和第二探針與各自染色體基因座雜交的條件下接觸。然后定位包括細(xì)胞核在內(nèi)的DAPI染色區(qū)域(步驟40)，確定第一和第二探針的存在(步驟50)，對(duì)每個(gè)細(xì)胞核區(qū)域中所述第一細(xì)胞核著絲粒探針和第二細(xì)胞核非著絲粒探針的標(biāo)記進(jìn)行定量(步驟60)，每個(gè)細(xì)胞核中可檢測(cè)兩個(gè)第一探針標(biāo)記(步驟70)，而大于或等于4個(gè)第二探針標(biāo)記可作為宮頸癌細(xì)胞的陽(yáng)性標(biāo)識(shí)(步驟90)。如果第二探針標(biāo)記少于4個(gè)(步驟80)，便為陰性標(biāo)識(shí)。
在2007年8月3日提交的共同擁有的美國(guó)專利申請(qǐng)11833594中，描述了動(dòng)態(tài)自動(dòng)顯微鏡操作和載玻片掃描系統(tǒng)。公開(kāi)的實(shí)施方案包括用于動(dòng)態(tài)掃描安置在顯微鏡載玻片上的標(biāo)本的自動(dòng)顯微鏡和方法，其使用將顯微鏡載玻片載物臺(tái)、至少一個(gè)照明能源、至少一個(gè)電子成像裝置、至少一個(gè)可互換元件圓盤(pán)傳送帶和同步控制器組合在一起的動(dòng)態(tài)掃描顯微鏡。作為例證的自動(dòng)顯微鏡能顯著減少實(shí)施檢查所需的時(shí)間，減少系統(tǒng)波動(dòng)，提供診斷結(jié)果。在成像過(guò)程中，載物臺(tái)和濾色鏡轉(zhuǎn)盤(pán)勻速運(yùn)動(dòng)，而非如以前的方法中保持靜止。每個(gè)移動(dòng)子系統(tǒng)上的實(shí)時(shí)位置傳感器準(zhǔn)確遙測(cè)載物臺(tái)安置的載玻片和濾色鏡轉(zhuǎn)盤(pán)的即時(shí)位置。濾 色鏡轉(zhuǎn)盤(pán)以足夠高的速度旋轉(zhuǎn)，使得在每一個(gè)濾鏡波長(zhǎng)、每一個(gè)成像位置和聚焦的平面上捕捉圖像。
在2007年8月2日提交的共同擁有的美國(guó)專利申請(qǐng)11833154中，描述了可互換的物鏡、濾鏡和在自動(dòng)顯微鏡系統(tǒng)中使用的類似元件。該申請(qǐng)一般涉及遠(yuǎn)程操作的或用機(jī)器人控制的顯微鏡，還特異性地涉及用于自動(dòng)互換的物鏡集合、濾鏡和/或其它光學(xué)組件的裝置的機(jī)械化。公開(kāi)了用于互換光路上的光學(xué)組件的儀器，其包括具有可旋轉(zhuǎn)的電機(jī)軸的控制發(fā)動(dòng)機(jī)；支持控制發(fā)動(dòng)機(jī)的支持結(jié)構(gòu)；由一般與圍繞平面基座上中心點(diǎn)對(duì)稱的外圍限定的平面基座，所述平面基座包括等角設(shè)置在離基座中心等距的包含多個(gè)多個(gè)光學(xué)組件的多個(gè)固定裝置，和引起平面基座圍繞其中心大體對(duì)稱旋轉(zhuǎn)的機(jī)械裝置，這樣，選擇的特定光學(xué)組件被定位在光束中。
2007年8月2日提交的共同擁有的美國(guó)專利申請(qǐng)11833183描述了用于自動(dòng)顯微鏡系統(tǒng)中的自動(dòng)顯微鏡載物臺(tái)。該申請(qǐng)一般涉及沿著顯微鏡的光軸可調(diào)節(jié)地移動(dòng)的顯微鏡載物臺(tái)。例如，公開(kāi)了沿著顯微鏡的光軸方向可調(diào)節(jié)的顯微鏡載玻片支架，包括基座底板；可移動(dòng)地裝配在所述底板上的顯微鏡載物臺(tái)部件，所述底板可操作化地配置為允許所述部件沿著光軸方向移動(dòng)；以及固定在所述顯微鏡載物臺(tái)部件的顯微鏡載玻片夾持裝置。
2007年8月3日提交的共同擁有的美國(guó)專利申請(qǐng)11833517中描述了用于自動(dòng)顯微鏡系統(tǒng)中的自動(dòng)顯微鏡載玻片盒和載玻片處理系統(tǒng)。該申請(qǐng)公開(kāi)了用于移去和更換放置在載玻片盒中的載玻片的裝置，所述載玻片盒含有多個(gè)經(jīng)配置用于平行放置載玻片的狹槽。
2007年8月3日提交的共同擁有的美國(guó)專利申請(qǐng)11833428中描述了用于自動(dòng)顯微鏡系統(tǒng)中的自動(dòng)顯微鏡載玻片裝載和卸載裝置。作為例證的實(shí)施方案公開(kāi)了顯微鏡載玻片操縱裝置，其包括基座結(jié)構(gòu)；具有穿孔的套管，所述套管具有第一端和第二端，第二端緊扣在基座上，且套管方向與基座垂直；圍繞虛構(gòu)的縱軸對(duì)稱的縱向桿，其以允許縱向桿在套管穿孔中軸向和縱向運(yùn)動(dòng)的方式，部分地被安置在套管穿孔中，縱向桿具有桿的第一端和桿的第二端，桿的第二端被安置于套管穿孔中，而桿的第一端伸出套管第一端之外，并且包括在套管虛構(gòu)的縱軸的平面中的平行軌道結(jié)構(gòu)；平板可滑動(dòng)地安置在套管第一端上的平行軌道結(jié)構(gòu)之間，平板具有第一平板端和第二平板端，第一平板端和第二平板端之一具有兩個(gè)分叉的叉狀構(gòu)造，在每個(gè)叉子之間限定出相當(dāng)于顯微鏡載玻片寬度的空隙區(qū)域，并且其中叉子具有緊夾結(jié)構(gòu)，其可操作化地配置為以允許沿著其邊緣緊夾顯微鏡載玻片。
在2007年8月3日提交的共同擁有的美國(guó)專利申請(qǐng)11833849中，公開(kāi)了應(yīng)用電腦內(nèi)置程序驅(qū)動(dòng)顯微檢測(cè)來(lái)自生物樣本熒光信號(hào)的自動(dòng)方法，其可用于驅(qū)動(dòng)自動(dòng)顯微鏡系統(tǒng)。其中公開(kāi)的適于多個(gè)樣本高通量分析的作為實(shí)施例的顯微分析方法包括以下步驟提供自動(dòng)顯微鏡，其包括載玻片載物臺(tái)、至少一個(gè)物鏡、圖像捕捉裝置、用于依據(jù)方案操作顯微鏡的程控裝置和用于提供分析結(jié)果的程控裝置；提供其上包括樣本和可質(zhì)詢的數(shù)據(jù)的顯微鏡載玻片，其中可質(zhì)詢的數(shù)據(jù)提供與所述樣本分析方案相關(guān)的信息；質(zhì)詢數(shù)據(jù)；將載玻片安置于載玻片載物臺(tái)上；使顯微鏡依據(jù)編碼在可質(zhì)詢的數(shù)據(jù)中的分析方案分析樣本；和使顯微鏡提供代表樣本的分析結(jié)果。2007年8月2日提交的共同擁有的美國(guó)專利申請(qǐng)11833204中描述了在實(shí)施圖像加工的FISH分析中，使用電腦內(nèi)置程序驅(qū)動(dòng)顯微鏡的顯微 鏡自動(dòng)操作，并公開(kāi)了執(zhí)行多種圖像處理功能，可用于實(shí)施自動(dòng)熒光原位雜交方法的實(shí)施方案。該實(shí)施方案包括用于在超過(guò)數(shù)字電子學(xué)動(dòng)態(tài)范圍的強(qiáng)度范圍，使樣本的所有區(qū)域可令人滿意的成像的自動(dòng)曝光方法；用于計(jì)數(shù)定位樣本中靶標(biāo)的感興趣的目標(biāo)物的熒光原位雜交的方法；用于分類和表征被計(jì)數(shù)的感興趣目標(biāo)物的細(xì)胞核鑒定方法；用于確定經(jīng)鑒定的感興趣目標(biāo)物形狀的細(xì)胞核分割方法。所述方法的實(shí)施方案用于表征細(xì)胞核或計(jì)數(shù)染色體。
前文中所述的自動(dòng)顯微鏡系統(tǒng)在電腦內(nèi)置和電腦執(zhí)行的指令控制下運(yùn)行，相應(yīng)地，該系統(tǒng)在無(wú)人干預(yù)下實(shí)現(xiàn)自動(dòng)檢測(cè)和樣本分析。自動(dòng)載玻片盒和自動(dòng)載玻片裝載和卸載裝置使得無(wú)人照顧地進(jìn)行多個(gè)樣本的高通量分析。
這里公開(kāi)的方法針對(duì)組織標(biāo)本的自動(dòng)檢測(cè)和分析，其細(xì)胞疑似具有在致癌過(guò)程中發(fā)生體細(xì)胞基因重復(fù)或基因擴(kuò)增。該方法采用電腦驅(qū)動(dòng)的圖像采集，對(duì)得到的圖像進(jìn)行電腦驅(qū)動(dòng)的分析，并以多種形式自動(dòng)報(bào)告分析結(jié)果，其使該方法顯著地免于人為干擾。非限制性地，報(bào)告可以以圖表、表格、載玻片上視野的示意圖以及類似形式呈現(xiàn)。報(bào)告為例如文檔或記載的數(shù)字化格式，以便于本地或遠(yuǎn)程傳播用于評(píng)估。由于使用本文所述的自動(dòng)熒光顯微鏡，例如包括各種組件和軟件的系統(tǒng)，得以對(duì)組織樣本進(jìn)行快速、便捷和準(zhǔn)確的篩查。所述方法及其中所用的自動(dòng)顯微鏡系統(tǒng)尤其適于對(duì)多個(gè)組織樣本的高通量分析。
組織樣本可來(lái)源于從疑似組織或器官產(chǎn)生樣本的醫(yī)療或手術(shù)過(guò)程，非限制性地，包括從上皮表面刮取、手術(shù)切除上皮組織、多種活組織檢查以及手術(shù)切割下的組織和器官。在非限制性實(shí)施方案中，將這樣的樣本固定和包埋在支持材料中，并在顯微鏡用薄片切片機(jī)或類似的器具中制備其組織切片，將組織切片固定在顯微鏡載玻片上。另外，用于分析的樣本可源自活組織檢查樣本、血液、淋巴、尿液、滲出液、生物流體、灌洗液、抽吸液、痰和組織。
在多種實(shí)施方案中，固定于載玻片的組織切片用常規(guī)熒光染料處理，所述熒光染料利用可被適當(dāng)濾光器分離的特定發(fā)射顏色的熒光探針，使染色體或核酸染色。常規(guī)染料的非限制性實(shí)例是4’，6- 二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)，用DAPI染色提供了確定細(xì)胞核或染色體位置的方式，以便電腦驅(qū)動(dòng)的圖像捕捉程序進(jìn)一步捕捉來(lái)自FISH探針的圖像。
組織標(biāo)本與熒光標(biāo)記的FISH探針雜交，所述探針的核苷酸序列特異性靶向基因序列，或基因序列的片段或部分，即特異性針對(duì)待靶向癌基因。當(dāng)使用適當(dāng)?shù)臑V鏡和相關(guān)的光學(xué)組件時(shí)，用于探針的多種熒光標(biāo)記在光學(xué)上可分離。核苷酸序列的特異性確保具有靶序列的標(biāo)本中的所有或大部分染色體確實(shí)與探針雜交，而非靶標(biāo)序列保持不雜交。充分加熱使靶序列變性，暴露與探針互補(bǔ)的單鏈DNA，從而引發(fā)雜交。該過(guò)程繼續(xù)，這通過(guò)探針與暴露的單鏈退火，實(shí)現(xiàn)序列的熒光標(biāo)記。發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員知道溶液離子強(qiáng)度、緩沖液組分、溫度之類的特定條件，可以實(shí)現(xiàn)所需雜交。退火后，多余的探針被漂洗掉。
將承載雜交標(biāo)本的載玻片插入作為自動(dòng)顯微鏡系統(tǒng)元件的載玻片裝載盒。系統(tǒng)投入運(yùn)行，在該時(shí)刻載玻片從盒中轉(zhuǎn)運(yùn)并置于顯微鏡載物臺(tái)上。在許多實(shí)施方案中，每一片載玻片可帶有由自動(dòng)顯微鏡質(zhì)詢的編碼，其包括如下信息，例如標(biāo)本識(shí)別，任何常規(guī)染色體染料的身份，以及與待測(cè)標(biāo)本一起使用的FISH探針上的各種熒光標(biāo)記。這些信息指導(dǎo)自動(dòng)顯 微鏡在整個(gè)圖像積累過(guò)程中選擇適當(dāng)?shù)臑V光器和相關(guān)光學(xué)元件。
自動(dòng)掃描裝置，例如自動(dòng)顯微鏡可配置為在一個(gè)或多于一個(gè)，例如兩個(gè)、三個(gè)或更多的平面掃描生物樣本。通過(guò)在多個(gè)平面掃描，可顯著改善對(duì)就樣本中細(xì)胞總量而言較少的異常細(xì)胞的檢測(cè)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，探針可利用FISH探針，其熒光信號(hào)由檢測(cè)器檢測(cè)。應(yīng)該理解的是，探針可在有或沒(méi)有另一個(gè)輸入信號(hào)下產(chǎn)生信號(hào)，例如它們可為放射性的，或當(dāng)由激活信號(hào)(例如適當(dāng)波長(zhǎng)的光或其它電磁輻射)刺激時(shí)發(fā)熒光。探針可針對(duì)不同的復(fù)制相關(guān)癌癥/增生基因座，與癌癥/增生相關(guān)的特定基因座。不同的熒光標(biāo)簽可與針對(duì)不同基因座的探針相關(guān)聯(lián)，以產(chǎn)生不同的信號(hào)。
可以依據(jù)標(biāo)簽產(chǎn)生的信號(hào)選擇檢測(cè)器，如用于檢測(cè)熒光標(biāo)簽的熒光檢測(cè)器，其可操作化地配置，使熒光標(biāo)簽產(chǎn)生的特定熒光信號(hào)得以檢測(cè)。
可如下開(kāi)始自動(dòng)分析指定使用低倍顯微鏡，至少使用常規(guī)染料，也可以使用探針標(biāo)記，以確定標(biāo)本中用于更高倍成像的區(qū)域。當(dāng)電腦軟件在低倍下確定感興趣的區(qū)域時(shí)，其可指令自動(dòng)顯微鏡變換物鏡和/或?yàn)V鏡，以及任何其它光學(xué)組件，以便根據(jù)源自探針中所用的熒光標(biāo)記的一種或另一種的發(fā)射光，在較高放大倍數(shù)下進(jìn)行確定基因座的適當(dāng)?shù)膱D像分析。電腦軟件可使用圖像中的特征，作為非限制性實(shí)例，例如FISH標(biāo)記斑點(diǎn)的強(qiáng)度和數(shù)量，以計(jì)數(shù)出現(xiàn)在單個(gè)細(xì)胞核中的所述斑點(diǎn)。所述計(jì)數(shù)可提供被分析標(biāo)本中的組織細(xì)胞中基因擴(kuò)增程度的結(jié)果指示。
報(bào)告可包括與特定染色體相關(guān)的特定標(biāo)簽的簡(jiǎn)單報(bào)告，和/或可以包括自動(dòng)診斷報(bào)告(表明與染色體的特定雜交模式相關(guān)的癌癥類型)。在某些實(shí)施方案中，自動(dòng)顯微鏡系統(tǒng)自動(dòng)產(chǎn)生報(bào)告，其詳細(xì)描述在操作過(guò)程中得到的多種圖像、視野和表現(xiàn)中所獲得結(jié)果。所述報(bào)告可利用，或可參考已經(jīng)存儲(chǔ)在與自動(dòng)顯微鏡相關(guān)聯(lián)的存儲(chǔ)裝置中的歷史信息或患者信息。
有用的系統(tǒng)可包括同時(shí)，或在相當(dāng)短的時(shí)間間隔內(nèi)(如小于I分鐘)，完成多信號(hào)通道的自動(dòng)掃描和檢測(cè)?？蓪?duì)系統(tǒng)進(jìn)行可操作化地配置，以同時(shí)或并行(或其混合)的方式，實(shí)時(shí)處理多信號(hào)中的每個(gè)信號(hào)，實(shí)現(xiàn)指示一種或更多特定癌癥的染色體區(qū)域和/或區(qū)域性復(fù)制的快速檢測(cè)。[0096]與正常標(biāo)本比較的矢量值可選定小于特定閾值，例如小于約60，或小于約40，或小于約30，或小于約20，或小于約10，或小于約3，或小于約1，或小于約0. 500。
在分析方法的非限制性實(shí)例中，自動(dòng)方法可包括如下步驟
I.通過(guò)將來(lái)自石蠟包埋的組織薄切片鋪于載玻片上，使顯微標(biāo)本沉積。
2.用用于靶向的染色體基因座或序列的熒光原位雜交(FISH)探針對(duì)組織切片進(jìn)行染色。
3. FISH探針處理后，使用桌面掃描器掃描載玻片，分辨率可設(shè)定為每英寸100個(gè)點(diǎn),或200個(gè)點(diǎn),或300個(gè)點(diǎn),或400個(gè)點(diǎn),或更多個(gè)點(diǎn),加工掃描圖像，以識(shí)別病理學(xué)者標(biāo)記用于注意的區(qū)域。該區(qū)域的數(shù)字化信息傳輸至自動(dòng)突光顯微鏡，例如Ikoniscope 顯微鏡系統(tǒng)(Ikonisys, Inc. New Haven, CT)。
4.將載玻片裝載在自動(dòng)顯微鏡上。
5.采用低放大倍數(shù)，例如2X，或4X，或5X，或10X，或類似的低放大倍數(shù)開(kāi)始自動(dòng)掃描，用DAPI通道分析，由此所述儀器檢測(cè)包含細(xì)胞核的載玻片區(qū)域。典型地，掃描在步驟(3)中標(biāo)記的區(qū)域中進(jìn)行。
6.然后使用更高放大倍數(shù)，例如10X，或15X，或20X，或40X，或甚至更高放大倍數(shù)，顯微鏡系統(tǒng)掃描在此前的步驟中確定的區(qū)域。在DAPI通道中掃描以檢測(cè)細(xì)胞核，再在針對(duì)由探針中使用的熒光標(biāo)記發(fā)射范圍中的光波長(zhǎng)的通道中進(jìn)行掃描，例如橙色通道，用于計(jì)數(shù)例如來(lái)自具有發(fā)射橙色射線的標(biāo)記物的FISH探針的橙色信號(hào)，在綠色通道中計(jì)數(shù)來(lái)自具有發(fā)射綠色射線的標(biāo)記物的FISH探針的信號(hào)。這提供感興趣的特征，例如細(xì)胞核，以供進(jìn)一步的表征。
7.具有感興趣特征的位置被記錄，用于后續(xù)在最高放大倍數(shù)，例如100X倍數(shù)下的掃描和信號(hào)計(jì)數(shù)確認(rèn)。
8.自動(dòng)顯微鏡將20X和100X掃描期間收集的所有圖像提供給病理學(xué)者進(jìn)行評(píng)估，如果病理學(xué)者需要在高放大倍數(shù)下對(duì)另一載玻片區(qū)域進(jìn)行評(píng)估，還可隨后對(duì)載玻片進(jìn)行再掃描。
有關(guān)優(yōu)選實(shí)施方案的陳述
盡管參照優(yōu)選的實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該易于理解，在不背離如由所附的權(quán)利要求
書(shū)限定的本發(fā)明的精神和范圍下，可對(duì)本發(fā)明進(jìn)行多種變化和/或修改。本文引用的所有文件，在適合用于教導(dǎo)額外的或備選的細(xì)節(jié)、特征和/或技術(shù)背景的情況下均通過(guò)引用的方式并入本文。
權(quán)利要求
1.一種篩查受試者中病變的存在和/或程度的方法，所述病變特征在于受試者細(xì)胞中的異常染色體成分，所述方法包括以下步驟 a)使來(lái)自所述受試者的包含細(xì)胞核的生物樣本與針對(duì)至少一種表現(xiàn)異常特征的染色體序列的一種或更多種可區(qū)分的標(biāo)記探針接觸，所述接觸在促進(jìn)所述一種或更多種探針與所述至少一種序列雜交的條件下進(jìn)行； b)自動(dòng)獲得所述一種或更多種與染色體序列雜交的可區(qū)分的標(biāo)記的表現(xiàn)； c)自動(dòng)分析所述表現(xiàn)中一種或更多種標(biāo)記結(jié)合的分布和強(qiáng)度，以確定異常染色體成分的存在和/或程度；和 d)自動(dòng)報(bào)告步驟c)的分析結(jié)果； 其中步驟b)_d)在無(wú)人干預(yù)下實(shí)施。
2.根據(jù)權(quán)利要求
I所述的方法，其中，步驟b)-d)由自動(dòng)顯微鏡系統(tǒng)實(shí)施。
3.根據(jù)權(quán)利要求
I所述的方法，其中，探針靶向單核苷酸多態(tài)性(SNP)，突變單或多堿基核苷酸序列，TERC和PIK3A基因座附近800kb染色體區(qū)域內(nèi)重復(fù)或擴(kuò)增的基因或其部分，3號(hào)染色體著絲粒，7號(hào)染色體著絲粒，以及包含TERC、PIK3A基因、基因或這些基因的部分的5'和3'附近區(qū)域的序列中的至少一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求
I所述的方法，其進(jìn)一步包括在所述雜交條件下將所述樣本與針對(duì)已知不是異常的染色體基因座的標(biāo)記參照探針接觸，或?qū)⑺鰳颖九c參照染色劑接觸，并使獲得表現(xiàn)和分析步驟以參照探針或染色劑為參照。
5.篩查受試者中與癌癥、高度增生或高度發(fā)育異常相關(guān)異常的方法，其包括以下步驟 a)從受試者中獲得包含細(xì)胞核的生物樣本； b)在促進(jìn)探針與靶向的染色體基因座雜交的條件下，使生物樣本與第一探針接觸，該第一探針具有針對(duì)異常相關(guān)的染色體序列的第一可檢測(cè)標(biāo)記； c)在所述雜交條件下，使所述樣本與至少一種針對(duì)已知不是異常的染色體基因座的可檢測(cè)地標(biāo)記的參照探針接觸，并進(jìn)一步將所述樣本與細(xì)胞核參照染色劑接觸； d)在樣本中自動(dòng)尋找具有所述參照染色劑的區(qū)域，并對(duì)與染色體序列結(jié)合的標(biāo)記成像； e)自動(dòng)分析所述標(biāo)記圖像中雜交標(biāo)記的分布和強(qiáng)度；和 f)自動(dòng)報(bào)告步驟e)的分析結(jié)果； 其中步驟d)_f)在無(wú)人干預(yù)下實(shí)施。
6.根據(jù)權(quán)利要求
5所述的方法，其中，步驟d)-f)由自動(dòng)顯微鏡執(zhí)行。
7.根據(jù)權(quán)利要求
5所述的方法，其中，在接觸步驟之前，所述細(xì)胞核從樣本中分離并沉積形成層。
8.根據(jù)權(quán)利要求
5所述的方法，其中，所述樣本包括活組織檢查樣本、手術(shù)切除樣本、血液、淋巴、尿液、滲出液、生物流體、上皮碎屑、子宮頸涂片、口腔粘膜涂片、灌洗液、抽吸液、唾液、痰和組織中的一種或更多種。
9.根據(jù)權(quán)利要求
5所述的方法，其中，所述第一和第二標(biāo)記是熒光標(biāo)記。
10.根據(jù)權(quán)利要求
5所述的方法，其中，所述第一探針靶向單核苷酸多態(tài)性(SNP)，突變序列，重復(fù)或擴(kuò)增的基因或其部分，3號(hào)染色體著絲粒，7號(hào)染色體著絲粒，以及包含TERC基因或其部分的序列中的至少一種。
11.一種在治療患者的癌癥或高度增生期間，監(jiān)測(cè)隨時(shí)間推移的治療功效的自動(dòng)方法，所述方法包括以下步驟 (a)自患者獲得流體生物樣本，其中含有與癌癥或高度增生相關(guān)的細(xì)胞； (b)用一種或更多種可檢測(cè)地標(biāo)記的染色體探針處理所述流體生物樣本或其部分，所述探針對(duì)一個(gè)或更多個(gè)染色體基因座具有高度序列相似性，所述染色體基因座或其擴(kuò)增與所述癌癥或高度增生相關(guān)，其中所述處理在足以使所述探針與樣本中的染色體雜交的條件下實(shí)施； (C)利用機(jī)器人顯微鏡自動(dòng)掃描所述經(jīng)處理的流體生物樣本，檢測(cè)所述一個(gè)或更多個(gè)結(jié)合于所述樣本中的任意染色體的標(biāo)記； (d)利用機(jī)器人顯微鏡自動(dòng)檢測(cè)與雜交至所述染色體探針的所述染色體相關(guān)的細(xì)胞數(shù)量;和 (e)在療程的不同時(shí)間自動(dòng)比較步驟(C)和(d)中提供的標(biāo)記雜交模式和細(xì)胞數(shù)量結(jié)果，從而評(píng)估該療法在治療癌癥或高度增生中的療效。
12.根據(jù)權(quán)利要求
11所述的方法，其中，以I天或更長(zhǎng)的間隔進(jìn)行監(jiān)測(cè)。
13.根據(jù)權(quán)利要求
11所述的方法,其中,所述流體生物樣本包括血液、淋巴、尿液、滲出液、上皮碎屑、子宮頸涂片、口腔粘膜涂片、灌洗液、唾液、抽吸液和痰的一種或更多種。
14.根據(jù)權(quán)利要求
11所述的方法，其中，自動(dòng)顯微鏡系統(tǒng)在無(wú)人干預(yù)下實(shí)施步驟(c)15.根據(jù)權(quán)利要求
14所述的方法，其中，自動(dòng)顯微鏡系統(tǒng)自動(dòng)優(yōu)化掃描樣本的視野。
16.根據(jù)權(quán)利要求
14所述的方法，其中，自動(dòng)顯微鏡在樣本視野中掃描兩個(gè)或更多平面。
17.根據(jù)權(quán)利要求
11所述的方法，其中，探針靶向單核苷酸多態(tài)性(SNP)，突變單或多堿基核苷酸序列，TERC和PIK3A基因座附近800kb染色體區(qū)域內(nèi)重復(fù)或擴(kuò)增的基因或其部分，3號(hào)染色體著絲粒，7號(hào)染色體著絲粒，以及包含TERC、PIK3A基因、基因或這些基因的部分的5'和3'附近區(qū)域的序列中的至少一種。
18.根據(jù)權(quán)利要求
11所述的方法，其中，患者無(wú)需他人幫助獲取樣本。
19.篩查宮頸癌細(xì)胞的自動(dòng)方法，其包括以下步驟 (a)獲得包含來(lái)自受試者的帶有細(xì)胞核的生物樣本的載玻片，所述生物樣本已與具有針對(duì)7號(hào)染色體的第一可檢測(cè)標(biāo)記的第一細(xì)胞核著絲粒探針，和具有針對(duì)3號(hào)染色體q臂上的單拷貝序列的第二可檢測(cè)標(biāo)記的第二細(xì)胞核非著絲粒探針接觸，其中，所述單拷貝序列包括四個(gè)包含染色體3q26位上至少部分TERC基因的重疊BAC克隆的重疊群序列，并以DAPI復(fù)染，其中所述第一和第二探針在促進(jìn)每個(gè)所述第一和第二探針與各自染色體基因座雜交的條件下接觸； (b)搜索所述載玻片，尋找所述生物樣本中的DAPI染色區(qū)域； (c)搜索所述DAPI染色區(qū)域，尋找所述第一細(xì)胞核著絲粒探針的標(biāo)記和所述第二細(xì)胞核非著絲粒探針的標(biāo)記的存在； (d)定量地確定所述生物樣本中每個(gè)DAPI染色區(qū)域中每個(gè)細(xì)胞核的所述第一細(xì)胞核著絲粒探針和第二細(xì)胞核非著絲粒探針的數(shù)量；(e)當(dāng)每個(gè)細(xì)胞核的DAPI內(nèi)的所述第一探針數(shù)量約為2，并且每個(gè)細(xì)胞核的DAPI染色區(qū)域內(nèi)的所述第二細(xì)胞核非著絲粒 探針數(shù)量等于或多于4時(shí)，指定所述生物樣本具有發(fā)展為高度增生和擴(kuò)散性宮頸癌的可能性。
專利摘要
檢測(cè)生物樣品中癌癥和相關(guān)增生的自動(dòng)方法。
文檔編號(hào)C12Q1/68GKCN102741425SQ200980159227
公開(kāi)日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2009年11月3日
發(fā)明者G·薩基斯, M·基爾佩崔克, P·齊普拉斯, T·塔法斯 申請(qǐng)人:伊康尼西斯公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan