專利名稱:一種電穿孔芯片及基于電穿孔芯片的多孔板裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種電穿孔的芯片，更具體而言，本發(fā)明涉及一種高效地利用電穿孔芯片進(jìn)行電穿孔的多孔板裝置。
背景技術(shù)：
細(xì)胞膜是包圍在細(xì)胞外周的一層薄膜，是細(xì)胞與外界進(jìn)行選擇性物質(zhì)交換的通透性屏障。細(xì)胞膜是細(xì)胞成為一個獨(dú)立的生命單位，并擁有一個相對穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境。周圍環(huán)境中的一些物·質(zhì)可以通過細(xì)胞膜，其它的物質(zhì)則不行。細(xì)胞可以通過細(xì)胞膜從周圍環(huán)境攝取養(yǎng)料，排出代謝產(chǎn)物，使物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)達(dá)到平衡狀態(tài)。所以，細(xì)胞膜的基本功能就是維持細(xì)胞內(nèi)微環(huán)境的相對穩(wěn)定并有選擇地與外界環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)交換。
研究發(fā)現(xiàn)，如果對細(xì)胞施加一定強(qiáng)度的電刺激并持續(xù)一段時間，就可以誘導(dǎo)細(xì)胞膜上產(chǎn)生一些微孔，使細(xì)胞的通透性增強(qiáng)，所謂細(xì)胞電穿孔(Electroporation)就是指細(xì)胞在外加脈沖電場的作用下，細(xì)胞膜脂雙層上形成瞬時微孔的生物物理過程(WaverJ.C.“Electroporation:A dramatic,nothermal electric field phenomenon，，1992)。當(dāng)細(xì)胞膜發(fā)生電穿孔時，其通透性和膜電導(dǎo)會瞬時增大，使親水分子、DNA、蛋白質(zhì)、病毒顆粒、藥物顆粒等正常情況下不能通過細(xì)胞膜的分子得以進(jìn)入細(xì)胞。在短時間內(nèi)撤除電刺激后，細(xì)胞膜可以自我恢復(fù)，重新成為選擇性通透屏障。與傳統(tǒng)的化學(xué)穿孔和病毒穿孔相比，由于電穿孔具有無化學(xué)污染、不會對細(xì)胞造成永久性損傷、效率較高等優(yōu)點(diǎn)，在生物物理學(xué)、分子生物學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。
雖然電穿孔作用的機(jī)理并不完全清楚，但在本文中細(xì)胞電穿孔是公知的，包括細(xì)胞膜脂雙層的破裂，導(dǎo)致在膜上形成暫時性的微孔，允許外源性分子通過擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞。
現(xiàn)有技術(shù)中，主要有三類方法來完成細(xì)胞電穿孔的過程:
1、將細(xì)胞放置于一對相距數(shù)毫米至數(shù)厘米的平行電極之間。使細(xì)胞在電極之間的電場中受到電刺激，以實(shí)現(xiàn)電穿孔的目的。(例如，美國專利U.S.Pat.5389069)
2、使用針狀電極扎入組織或細(xì)胞中對細(xì)胞進(jìn)行電擊，達(dá)到電穿孔的目的。(例如，美國專利U.S.Pat.5389069 ;中國專利申請，公開號CN 101020892A)
3、將一個腔室放置在一對平行電極之間，使得細(xì)胞的懸浮溶液在腔室中流動的同時受到電擊。(例如，美國專利U.S.Pat.6773669 ;中國專利申請，公開號:CN 1195997A)
在現(xiàn)有技術(shù)中公開的系統(tǒng)中，電極之間的距離通常在10毫米左右，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于細(xì)胞的典型尺度(20微米)，所以難以精確控制實(shí)際施加在細(xì)胞上的電場。同時，在兩個平板電極產(chǎn)生的電場中，電場E = V/D (V為施加在兩極板之間的電壓，D為兩極板之間的距離)，在極板之間的距離D較大(大于10毫米)的傳統(tǒng)電穿孔系統(tǒng)中，需要的電壓通常高達(dá)數(shù)千伏特。這給設(shè)計供電系統(tǒng)增加了難度，也不利于節(jié)能環(huán)保。
而在現(xiàn)有技術(shù)中公開的電穿孔設(shè)備及方法均不適用于處理大量的樣品，也不適用于連續(xù)處理樣品。也就是說，現(xiàn)有技術(shù)中得到的電穿孔室均是“靜態(tài)”工作的，即:在電穿孔室處理完一批樣品以后，需要對電穿孔室進(jìn)行清洗、重新培養(yǎng)細(xì)胞等處理，才能繼續(xù)下一批樣品處理。在公開的技術(shù)中，電穿孔常常是在一次性單室試管中進(jìn)行的，其用于電穿孔的最大容量通常為I毫升。在需要處理大量樣品的場合中，這種技術(shù)冗長乏味，勞動強(qiáng)度大。
在公開的現(xiàn)有技術(shù)中，很少考慮到如何實(shí)時觀察細(xì)胞在電穿孔時的形態(tài)變化。而這在細(xì)胞生理研究中，是需要關(guān)注的重點(diǎn)。
在公開的現(xiàn)有技術(shù)中，細(xì)胞的培養(yǎng)和電穿孔是分開進(jìn)行的，而這帶來了額外的工作量并降低了工作效率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明克服了上述現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明的目的之一是提供了一種電穿孔芯片，其具有精確控制的電極；本發(fā)明的另一目的是提供一種用于電穿孔的多孔板裝置，用于處理大量的樣品。
為了達(dá)到上述的目的，本發(fā)明所提供的電穿孔芯片的技術(shù)方案概述如下:
一種電穿孔芯片，其特征在于，包括:
承載電極的基板；
電極，所述的電極每兩個為一對，包括相對設(shè)置的陽極和陰極，且陰極和陽極之間
相互嵌套。
所述基板由絕緣材料制成。
所述基板 為覆蓋了絕緣材料的金屬。
所述絕緣材料為玻璃或硅。
所述電極寬度為I微米至I毫米。
所述電極由金屬或?qū)щ娋酆衔镏瞥伞?br>所述電極形狀為環(huán)形或方形。
所述電極位于基板的表面或嵌入基板中。
所述電極，每對電極分別連接以實(shí)現(xiàn)電場的分區(qū)控制。
所述電極的所有陽極連接在一起，同時所有陰極連接在一起，以實(shí)現(xiàn)電場的同時控制。
為了達(dá)到上述的另一目的，本發(fā)明所提供的用于電穿孔的多孔板裝置技術(shù)方案概述如下:
一種基于電穿孔芯片的多孔板裝置，其特征在于，包括:
多個電穿孔芯片，所述電穿孔芯片包括承載電極的基板和電極，所述電極每兩個為一對，包括相對設(shè)置的陽極和陰極，且陰極和陽極之間相互嵌套；
多孔板，包括多個孔，所述多孔板置于電穿孔芯片的基板上，形成腔體，且每個孔的底部對應(yīng)一個電穿孔芯片；
電壓源，用于設(shè)定并產(chǎn)生脈沖電壓；
及連接電壓源與電穿孔芯片的電連接件。
所述多孔板，包括6、8、16、24、48、96、192、288、384、576、672、768、1536個孔。
所述多孔板上的孔呈圓柱體或是立方體。
所述多孔板上的孔容量為I微升至10毫升之間。
所述多孔板上的孔用作電穿孔的腔體或者用作細(xì)胞培養(yǎng)的腔體。[0037]所述多孔板上一個孔中只培養(yǎng)一種細(xì)胞，或者在一個孔中培養(yǎng)多種細(xì)胞。
所述多孔板上的孔布置成多個行和列。
進(jìn)一步，位于同一行或同一列的孔，其底部對應(yīng)的電穿孔芯片同時連接電壓源，實(shí)現(xiàn)同時電穿孔。
進(jìn)一步，位于同一行或同一列的孔，其底部對應(yīng)的電穿孔芯片分別連接電壓源，實(shí)現(xiàn)分區(qū)電穿孔。
所述多孔板材料由玻璃、塑料、陶瓷和金屬中的一種或多種組成。
該多孔板裝置用于對細(xì)胞進(jìn)行電穿孔,所述的細(xì)胞包括動物細(xì)胞或者細(xì)菌。
該多孔板裝置用于對細(xì)胞進(jìn)行電穿孔時，設(shè)定的脈沖電壓為10-2000V，脈沖寬度
0.05-20ms，脈沖次數(shù)1-100次，脈沖間隔0.1-60秒。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:電穿孔芯片通過在基板上制作微細(xì)的電極來給細(xì)胞施加電場，從而達(dá)到給細(xì)胞電穿孔的目的。
在采用半導(dǎo)體刻蝕等微細(xì)加工方法的條件下，相比于已公開的電穿孔設(shè)備及系統(tǒng)，可以將電極的尺寸縮小很多，同時，電極之間的距離也可以縮小到和細(xì)胞尺寸相配合的程度。這樣，就可以用相對于已公開的技術(shù)來說要小得多的電壓來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞電穿孔的目的。從而降低設(shè)備成本并節(jié)能。
縮小的電極間距還帶來了一個顯著的優(yōu)勢，就是更高的電穿孔效率。因?yàn)榧?xì)胞懸浮液是不均勻的，電極間距越小，就意味著電極之間的不均勻溶液越少，也就越容易控制電穿孔條件的一致性，達(dá)到高電穿孔效率。
在一些實(shí)施例中，采用玻璃或聚合物等透明材料來制作基板，此時，就可以通過顯微鏡來實(shí)時觀察細(xì)胞在電穿孔過程中的變化。對于細(xì)胞生理學(xué)研究來說，這是顯著的優(yōu)勢。在優(yōu)選的實(shí)施例當(dāng)中，采用玻璃等生物兼容性好的材料作為基板，可以使細(xì)胞貼附在基板上，之后再進(jìn)行電穿孔。換言之，本發(fā)明所述的多孔板裝置，既可以電穿孔貼壁狀態(tài)下的細(xì)胞，也可以電穿孔懸浮狀態(tài)下的細(xì)胞。這種彈性對于細(xì)胞生理學(xué)研究來說，也是顯著的優(yōu)勢。
在電穿孔芯片的基礎(chǔ)上制作的用于電穿孔的多孔板裝置。其中每個孔的底部都有電穿孔芯片。在一些實(shí)施例中，通過多個孔的同時工作，可以實(shí)現(xiàn)大批量的高效樣品處理。在另一些實(shí)施例中，通過給不同的孔施加不同的刺激，可以快速的得到對于特定細(xì)胞的最適合電穿孔條件。
在一些實(shí)施例中，用于電穿孔的多孔板裝置上的孔也可以用作細(xì)胞培養(yǎng)的腔體，在優(yōu)選的實(shí)施例中，還可以利用硅烷化基板表面等方法來實(shí)現(xiàn)不同細(xì)胞的分區(qū)培養(yǎng)，從而實(shí)現(xiàn)在同一個孔中電穿孔不同的細(xì)胞。


圖1是多孔板裝置的結(jié)構(gòu)示意圖；
圖2是沿圖1中AA’的部分剖視圖；
圖3是多孔板裝置的分解視圖；
圖4是單個電穿孔芯片的示意圖；[0055]圖5是單個電穿孔芯片的分解試圖；
圖6是多孔板電穿孔系統(tǒng)的各部分連接示意圖。
其中，1-多孔板；2-多孔板的孔4-基板；5-電穿孔芯片陣列；6-陽極;7_陰極；8-電壓源；9-電連接件。 具體實(shí)施方式
下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述:
I 基板:
因?yàn)榛迤鸬匠型凶饔煤驮陔姌O之間起絕緣隔離作用，所以基板需要由絕緣材料制成，或者由非絕緣材料覆蓋絕緣層制成。根據(jù)本發(fā)明的基板可由任何適合以上條件的固體基板來制成，優(yōu)選的基板是那些可以通過鑄?；驒C(jī)器切割制成要求規(guī)格的基板。特別優(yōu)選的是透明的玻璃或者聚合物，因?yàn)樵谶@種情況下，可以通過顯微鏡實(shí)時觀察細(xì)胞的狀態(tài)。如圖1所示，用于電穿孔的多孔板裝置包括:多孔板I ;多孔板的孔2和3 ;基板4 ;多孔板下方的電穿孔芯片陣列5 (該圖中不可見具體電穿孔芯片陣列布置)。
在圖2所示的優(yōu)選實(shí)施例中，基板采用普通玻璃制成，該基板的尺寸可由具體需求決定，并通過切割等方法得到所需尺寸的基板。
在其它實(shí)施例中，基板材料也可以采用硅，陶瓷或覆蓋了絕緣層的金屬。由于這些材料的加工技術(shù)在本領(lǐng)域中是公知的，因而本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在本發(fā)明的實(shí)施中方便的采用這些材料。
2 電極
電極可以由適當(dāng)?shù)膶?dǎo)電材料或這些材料的復(fù)合物來制成。優(yōu)選材料為生物兼容性好的材料，例如金、鈦和摻有銀離子的PDMS (聚二甲基硅氧烷，一種生物科學(xué)中常用的聚合物)。當(dāng)采用多種材料時(例如一種導(dǎo)電材料(例如金)鍍在另一種導(dǎo)電材料(例如銅)上)，最外層的優(yōu)選材料為生物兼容性好的材料。
在如圖2所示的實(shí)施例中，電極材料為鉻和金。首先在基板上濺射(這是一種半導(dǎo)體加工工藝中公知的沉積金屬的方法)一層厚度為0.1微米的鉻，再濺射一層厚度為0.5微米的金。然后對整個基板進(jìn)行光刻(同樣是半導(dǎo)體加工工藝中公知的制作圖形的方法)得到需要的電極形狀。接著腐蝕掉金層和鉻層上不需要的部分。最終得到所需的電極。在另一些實(shí)施例當(dāng)中，也可以在基板上開相應(yīng)的槽，將電極鑲嵌進(jìn)槽中。當(dāng)然，電鍍等本領(lǐng)域公知的加工金屬的方法也可以用來制造電極。
本實(shí)施例采用鉻和金來制作電極，是因?yàn)榻饹]有生物毒性，而鉻是為了增加金和玻璃之間的黏附性。在不同的需求下，其它的導(dǎo)電材料，例如鋁、銅或者導(dǎo)電聚合物都可以用來制造電極。
如圖2所示的實(shí)施例中，電極的高度為0.6微米，這是考慮到電極之上的多孔板需要和基板實(shí)現(xiàn)密封，在本實(shí)施例中，這種密封是通過鍵合(半導(dǎo)體加工工藝中公知的將兩種物質(zhì)緊密結(jié)合在一起的方法)實(shí)現(xiàn)的，所以，電極的高度不宜過大以妨礙密封。已經(jīng)被實(shí)驗(yàn)確定的是:當(dāng)采用鍵合密封時，電極高度從0.1微米到10微米都是合適的。當(dāng)采用熱壓、粘合劑粘合等其它密封方式時，則不存在電極高度的限制，所以，電極高度可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)不同的需求和加工方法來確定。
如圖4、5所示，圖中可見電極陽極6和陰極7相互嵌套的布置。每兩個電極為一對，每對電極包括相對設(shè)置的陽極和陰極，所有陽極連接在一起，同時所有陰極連接在一起，可以實(shí)現(xiàn)電場的同時控制。在其它應(yīng)用場合，本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易實(shí)現(xiàn)每對電極分別連接以實(shí)現(xiàn)電場的分區(qū)控制。
如圖2所示的實(shí)施例中，電極的寬度為100微米，電極之間的距離為500微米，這種尺寸的電極所產(chǎn)生的電場是人胚胎腎細(xì)胞電穿孔條件的最優(yōu)選電場。當(dāng)需要對其它細(xì)胞進(jìn)行電穿孔時，可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員自行選擇合適的電極寬度和電極間距。
3多孔板
多孔板的作用是將不同的電穿孔芯片隔離開，形成不同的電穿孔腔室。使細(xì)胞在不同的腔室中受到電場的作用，從而完成細(xì)胞電穿孔的過程。多孔板可以由任何適合加工成形的絕緣材料制成，或在非絕緣材料的表面覆蓋一層絕緣層。優(yōu)選的，制作多孔板的材料應(yīng)是生物兼容性好的材料。
如圖2所示的實(shí)施例中，采用PDMS(聚二甲基硅氧烷)來制作多孔板，這是一種公知的常用于生物器件領(lǐng)域的易于加工成型的生物兼容聚合物材料。所述PDMS多孔板是通過鑄模的方法來得到，使用硅片充當(dāng)模具。首先在普通不銹鋼模具胚上利用機(jī)床加工出所需凹槽，然后將液態(tài)的PDMS溶液澆鑄進(jìn)模具上的凹槽，待其凝固后將其脫模取出，就得到了成型的多孔板。當(dāng)然，多孔板也可以采用玻璃、塑料、其它聚合物等材料使用本領(lǐng)域所公知的一些加工方法進(jìn)行加工，例如使用對塑料進(jìn)行沖孔。
如圖3所示，圖中可見多孔板電穿孔裝置各組成部分的形狀，多孔板通過鍵合的方法和基板連接在一起。這是考慮到PDMS和玻璃之間極易通過鍵合來形成牢固的密封，而PDMS和玻璃之間的鍵合過程也很簡單，只需要將PDMS和玻璃的表面用高壓激發(fā)的氧等離子處理10秒左右(這是為了激發(fā)PDMS和玻 璃表面的懸掛鍵)，然后施加一定的壓力將其壓緊。靜置24小時后即形成可靠牢固的密封。對于其它不同的應(yīng)用，本領(lǐng)域公知的連接方法也都適用，例如使用粘合劑或熱壓將多孔板和基板密封連接在一起。
在圖2所示的實(shí)施例中，多孔板上每個孔直徑為7毫米，高度為12毫米，共有96個孔。和電極的尺寸設(shè)計一樣，這組尺寸也是為人胚胎腎細(xì)胞電穿孔而設(shè)置的最優(yōu)選條件。在其它應(yīng)用中，本領(lǐng)域研究人員可以自行設(shè)置尺寸以滿足不同的需求。
在圖2所示的實(shí)施例中，因?yàn)镻DMS和玻璃都具有良好的生物兼容性，所以每個電穿孔裝置的孔都可以用來作為細(xì)胞培養(yǎng)的腔體。通過這種方法，可以將細(xì)胞培養(yǎng)和電穿孔的過程結(jié)合在一起。
4多孔板電穿孔裝置及電穿孔方法
如圖6所示，圖中包括多孔板電穿孔裝置，電壓源8和多孔板電穿孔裝置相連的電纜連線9。所述電壓源和電纜連線都是公開的和本領(lǐng)域技術(shù)人員容易獲取的設(shè)備。在如圖所示6的系統(tǒng)中，采用電壓源輸出為正負(fù)100伏特的電壓源。這也是為人胚胎腎細(xì)胞電穿孔而設(shè)置的最優(yōu)選條件。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以自行選擇相似設(shè)備。本電穿孔裝置可以電穿孔動物細(xì)胞和細(xì)菌，在如圖2所示的實(shí)施例中，優(yōu)選的細(xì)胞系有:HEK293(人胚胎腎細(xì)胞)，Hela (人宮頸癌細(xì)胞)，HepG2 (人肝癌細(xì)胞)，Neuro-2A (小鼠腦神經(jīng)瘤細(xì)胞)，Jurkat (人淋巴瘤細(xì)胞)，HL60(人原髓細(xì)胞)和MDCK (狗腎上皮細(xì)胞)；優(yōu)選的原代細(xì)胞有=HUVEC (人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)，DRG(大鼠背要神經(jīng)節(jié)細(xì)胞)，T淋巴細(xì)胞和人胚胎干細(xì)胞；優(yōu)選的細(xì)菌有大腸桿菌，巴氏桿菌。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要選擇不同的細(xì)胞。[0079]本電穿孔裝置可以通過電穿孔的方法使多種不同的高分子化合物進(jìn)入細(xì)胞，包括核酸類(質(zhì)粒DNA，線性DNA，小干擾RNA，反義核酸)，蛋白類(肽段，抗體)。在圖2所示的實(shí)施例中，優(yōu)選的質(zhì)粒是真核表達(dá)載體(PEGFP-C3)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以自行選擇各種真核，原核表達(dá)載體使用。
本電穿孔裝置可以設(shè)計和制作成各種尺寸，這些尺寸與本領(lǐng)域公知并常用的各種尺寸的細(xì)胞培養(yǎng)器皿相匹配，從而可以進(jìn)行高通量的電穿孔實(shí)驗(yàn)，并且對電穿孔后的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)與后續(xù)試驗(yàn)分析。在如圖2所示的實(shí)施例中，優(yōu)選96孔板，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要選擇6、8、16、24、48、96、192、288、384、576、672、768、1536孔板。本裝置既可以對貼壁細(xì)胞，也可以對懸浮細(xì)胞進(jìn)行電穿孔。通過對貼壁細(xì)胞的電穿孔來實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞的實(shí)時觀察，從而研究細(xì)胞在受到電刺激后形態(tài)和生理功能的變化。在圖2所示的實(shí)施例中，優(yōu)選采用本領(lǐng)域常用的共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇其它高速顯微觀察設(shè)備
對懸浮細(xì)胞的電穿孔與本發(fā)明中的多孔板裝置相結(jié)合，可以顯著提高本領(lǐng)域現(xiàn)有電穿孔技術(shù)的樣品處理速度，從而實(shí)現(xiàn)高通量電穿孔。
系統(tǒng)中的電壓源可以對不同細(xì)胞給出不同波形的電壓，在圖2所示的實(shí)施例中，優(yōu)選采用方波脈沖。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)不同的細(xì)胞選擇合適的電壓源輸出。
電穿孔實(shí)驗(yàn)中用到的緩沖液取自由KC1(氯化鉀)，KH2P04(磷酸二氫鉀)，K2HP04(磷酸氫二鉀)，糖類和水組成的組。對于圖2所示的實(shí)施例，優(yōu)選的緩沖液配方為:IOOOml (毫升)緩沖液中含 KCl (15-50mM 毫摩爾)，KH2P04 (0.l_2mM)，K2HP04 (0.l_2mM)，肌醇(20-60mM)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)電穿孔細(xì)胞的不同而調(diào)整各組分的濃度以取得最高的穿孔效率。
5具體制造步驟
`[0085]由如下兩套不同的制作工藝已經(jīng)成功制造出了本發(fā)明所述裝置及系統(tǒng)。給出具體制作方法是為了幫助本領(lǐng)域技術(shù)人員理解本發(fā)明的制造方法，而并不是對本發(fā)明所述器件的材料，尺寸和制造方法做出限定。
制作方法A:
采用半導(dǎo)體制造工藝常用的8英寸玻璃片。在玻璃片上濺射0.1微米厚的鉻金屬層，再在鉻金屬層上濺射0.5微米厚的金層。對玻璃片進(jìn)行光刻，制造出所需電極的形狀，然后再使用碘化鉀溶液腐蝕金層，使用硝酸鈰銨溶液腐蝕鉻層。這樣就得到了基板及其上的電極。然后將玻璃片按長130毫米，寬86毫米的形狀用砂輪切割。采用普通不銹鋼模胚，使用機(jī)床加工出相應(yīng)的12毫米深的槽。將液態(tài)PDMS倒入槽中，待其凝固后脫模取出。將其按長120毫米，寬86毫米的形狀用刀片切割，這樣就得到了多孔板。將玻璃基板以及玻璃頂蓋的表面和PDMS多孔板表面用氧等離子處理后，緊貼在一起并施加壓力，靜置24小時，即得到多孔板電穿孔裝置，其中每個孔的底部都有電穿孔芯片。
制作方法B:
采用半導(dǎo)體制造工藝常用的8英寸N型硅片。在硅片上濺射0.1微米厚的鉻金屬層，再在鉻金屬層上電鍍5微米厚的金層。對硅片進(jìn)行光刻，制造出所需電極的形狀，然后再使用碘化鉀溶液腐蝕金層，使用硝酸鈰銨腐蝕鉻層。這樣就得到了基板及其上的電極。然后將該硅片按長130毫米，寬86毫米的形狀用砂輪切割從而得到適合的尺寸。采用普通塑料，厚度12毫米，使用沖壓方法加工出多孔板的形狀。將塑料片按長120毫米，寬86毫米的形狀用砂輪切割，這樣就得到了多孔板。用紫外固化粘合劑將硅基板和塑料多孔板粘合在一起，即得到多孔板電穿孔裝置，其中每個孔的底部都有電穿孔芯片。
制作方法C:
采用半導(dǎo)體制造工藝常用的12英寸覆銅板。使用公知的PCB電路板加工方法。在覆銅板上制作出所需電極的形狀，再在銅金屬層上電鍍10微米厚的金層。這樣就得到了基板及其上的電極。然后將得到的基板按長130毫米，寬86毫米的形狀用砂輪切割。采用普通塑料，厚度12毫米，使用沖壓方法加工出多孔板的形狀。將塑料片按長120毫米，寬86毫米的形狀用砂輪切割，這樣就得到了多孔板。用紫外固化粘合劑將硅基板和塑料多孔板粘合在一起，即得到多孔板電穿孔裝置，其中每個孔的底部都有電穿孔芯片。
6具體電穿孔方法
由如下三套不同的電穿孔方法已經(jīng)對本發(fā)明所述裝置和系統(tǒng)進(jìn)行了成功的電穿孔實(shí)驗(yàn)。給出具體電穿孔方法是為了幫助本領(lǐng)域技術(shù)人員理解電穿孔裝置的使用方法，而并不是對本發(fā)明所述裝置的適用范圍做出限定。
電穿孔方法A:懸浮細(xì)胞的電穿孔
收集處于對數(shù)生長期的MDCK (狗腎上皮細(xì)胞)，轉(zhuǎn)速800g離心5分鐘，棄上清，用電穿孔緩沖液(氯化鉀15mM,磷酸二氫鉀0.3mM,磷酸氫二鉀0.85mM,肌醇56mM)重懸細(xì)胞，使得細(xì)胞的密度為2X103個/ul (微升)，加入需要電穿孔轉(zhuǎn)入細(xì)胞的質(zhì)粒PEGFP-C3，使質(zhì)粒的濃度為20ug (微克)/ml (毫升)，輕柔混合均勻。將混好的細(xì)胞懸液20ul均勻滴加至多孔板電穿孔裝置的每個孔內(nèi)，采用如下條件進(jìn)行電刺激:電壓100V(伏特)，脈沖寬度
0.2ms (毫秒)，脈沖次數(shù)3次，脈沖間隔2秒。
電穿孔結(jié)束后，在每個芯片上滴加200ul含10%血清的DMEM培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移至96孔板進(jìn)行培養(yǎng)?；蛘咧苯蛹尤?.2-lml培養(yǎng)基，在相應(yīng)的多孔板芯片上培養(yǎng)，培養(yǎng)條件:溫度370C，二氧化碳濃度5%。24小時后熒光顯微鏡下觀察，可成功觀察到90%以上的細(xì)胞有綠色熒光表達(dá)，表明電穿孔的轉(zhuǎn)染效率達(dá)90%以上。
電穿孔方法B:貼壁電穿孔
收集處于對數(shù)生長期的細(xì)胞HEK293(人胚胎腎細(xì)胞)，轉(zhuǎn)速800g離心5分鐘，棄上清，用含10%血清的DMEM培養(yǎng)基重懸至IXioVml，混合均勻。然后向多孔板電穿孔裝置的每個孔內(nèi)滴加500ul細(xì)胞懸液，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為:溫度37°C，C02濃度5%。24小時后，當(dāng)細(xì)胞的密度達(dá)到80%以上時開始電穿孔。把待轉(zhuǎn)入細(xì)胞的Ant1-1aminA/CSiRNA(針對核纖層蛋白的小干擾RNA)用電穿孔緩沖液(氯化鉀15mM(毫摩爾)、磷酸二氫鉀0.3mM、磷酸氫二鉀0.85mM、肌醇56mM)稀釋至40ug/ml,向每孔中加入IOul混好小干擾RNA的緩沖液，采用如下條件進(jìn)行電刺激:電壓60V，脈沖寬度0.1ms，脈沖次數(shù)3次，脈沖間隔2秒。
電穿孔結(jié)束后，再向每個芯片上滴加500ul含10%血清的DMEM培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同上。24小時后收集細(xì)胞，進(jìn)行Real-time PCR(實(shí)時熒光定量PCR)檢測核纖層蛋白的表達(dá)水平，可以檢測到表達(dá)水平降低了 80 %以上。
電穿孔方法C:大腸桿菌的電穿孔轉(zhuǎn)化
向每20ul新制備的感受態(tài)細(xì)胞中加入IOng (納克)待轉(zhuǎn)質(zhì)粒PGL3，置于冰上I分鐘。將細(xì)菌和質(zhì)粒的混合物20ul均勻滴加至多孔板電穿孔裝置的每個孔內(nèi)，采用如下條件進(jìn)行電刺激:電壓800V，脈沖寬度5ms，脈沖次數(shù)I次。
電穿孔結(jié)束后，向每個芯片上滴加500ul LB培養(yǎng)基(1000ml去離子水中含:胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉IOg)并轉(zhuǎn)移至無菌離心管中，37°C輕柔振蕩培養(yǎng)I小時。取出IOOul鋪于含有氨芐抗性的LB瓊脂板上，37°C培養(yǎng)14小時可成功看到轉(zhuǎn)化后的克隆出現(xiàn) 。
權(quán)利要求
1.一種電穿孔芯片，其特征在于，包括: 承載電極的基板； 電極，所述的電極為環(huán)形，每兩個為一對，包括相對設(shè)置的陽極和陰極，且陰極和陽極之間相互嵌套。
2.如權(quán)利要求
1所述的電穿孔芯片，其特征在于，所述基板由絕緣材料制成。
3.如權(quán)利要求
1所述的電穿孔芯片，其特征在于，所述基板為覆蓋了絕緣材料的金屬。
4.如權(quán)利要求
2或3所述的電穿孔芯片，其特征在于，所述絕緣材料為玻璃或硅。
5.如權(quán)利要求
1所述的電穿孔芯片，其特征在于，所述電極寬度為I微米至I毫米。
6.如權(quán)利要求
1所述的電穿孔芯片，其特征在于，所述電極由金屬或?qū)щ娋酆衔镏瞥伞?br>7.如權(quán)利要求
1所述的電穿孔芯片，其特征在于，所述電極位于基板的表面或嵌入基板中。
8.如權(quán)利要求
1所述的電穿孔芯片，其特征在于，所述電極，每對電極分別連接以實(shí)現(xiàn)電場的分區(qū)控制。
9.如權(quán)利要求
1所述的電穿孔芯片，其特征在于，所述電極的所有陽極連接在一起，同時所有陰極連接在一起，以實(shí)現(xiàn)電場的同時控制。
10.一種基于電穿孔芯片的多孔板裝置，其特征在于，包括: 多個電穿孔芯片，所述電穿孔芯片包括承載電極的基板和電極，所述電極為環(huán)形，每兩個為一對，包括相對設(shè)置的陽極和陰極，且陰極和陽極之間相互嵌套； 多孔板，包括多個孔，所述多孔板置于電穿孔芯片的基板上，形成腔體，且每個孔的底部對應(yīng)一個電穿孔芯片； 電壓源，用于設(shè)定并產(chǎn)生脈沖電壓； 及連接電壓源與電穿孔芯片的電連接件。
11.如權(quán)利要求
10所述的多孔板裝置，其特征在于，所述多孔板，包括6、8、16、24、48、96、192、288、384、576、672、768、1536 個孔。
12.如權(quán)利要求
10所述的多孔板裝置，其特征在于，所述多孔板上的孔呈圓柱體或是立方體。
13.如權(quán)利要求
10所述的多孔板裝置，其特征在于，所述多孔板上的孔容量為I微升至10暈升之間。
14.如權(quán)利要求
10所述的多孔板裝置，其特征在于，所述多孔板上的孔用作電穿孔的腔體或者用作細(xì)胞培養(yǎng)的腔體。
15.如權(quán)利要求
10所述的多孔板裝置，其特征在于，所述多孔板上一個孔中只培養(yǎng)一種細(xì)胞，或者在一個孔中培養(yǎng)多種細(xì)胞。
16.如權(quán)利要求
10所述的多孔板裝置，其特征在于，所述多孔板上的孔布置成多個行和列。
17.如權(quán)利要求
16所述的多孔板裝置，其特征在于，位于同一行或同一列的孔，其底部對應(yīng)的電穿孔芯片同時連接電壓源，實(shí)現(xiàn)同時電穿孔。
18.如權(quán)利要求
16所述的多孔板裝置，其特征在于，位于同一行或同一列的孔，其底部對應(yīng)的電穿孔芯片分別連接電壓源，實(shí)現(xiàn)分區(qū)電穿孔。
19.如權(quán)利要求
10所述的多孔板裝置，其特征在于，所述多孔板材料由玻璃、塑料、陶瓷和金屬中的一種或多種組成。
20.如權(quán)利要求
19所述的多孔板裝置，其特征在于，該多孔板裝置用于對細(xì)胞進(jìn)行電穿孔，所述的細(xì)胞包括動物細(xì)胞或者細(xì)菌。
21.如權(quán)利要求
20所述的多孔板裝置，其特征在于，該多孔板裝置用于對細(xì)胞進(jìn)行電穿孔時，設(shè)定的脈沖電壓為10 2000伏，脈沖寬度0.05 20毫秒，脈沖次數(shù)I 100次，脈沖間隔0.1 6 0秒。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種電穿孔芯片及用于電穿孔的多孔板裝置，所述多孔板裝置包括多個電穿孔芯片，所述電穿孔芯片包括承載電極的基板和電極，所述電極每兩個為一對，包括相對設(shè)置的陽極和陰極，且陰極和陽極之間相互嵌套；多孔板，包括多個孔，所述多孔板置于電穿孔芯片的基板上，形成腔體，且每個孔的底部對應(yīng)一個電穿孔芯片；電壓源，用于設(shè)定并產(chǎn)生脈沖電壓；及連接電壓源與電穿孔芯片的電連接件。使用本發(fā)明的裝置具有更高的電穿孔效率，可以實(shí)現(xiàn)大批量的高效樣品處理。
文檔編號C12M1/42GKCN101870949 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請?zhí)朇N 200910237334
公開日2013年6月12日 申請日期2009年11月10日
發(fā)明者梁子才, 李志宏, 杜權(quán), 黃璜, 魏澤文 申請人:昆山文曲生物微系統(tǒng)有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (4),