專利名稱:一種非水相制備手性3r,5s-雙羥基化合物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物催化法不對(duì)稱制備手性醫(yī)藥中間體領(lǐng)域，具體涉及一種以3， 5_二羰基-6-芐氧基-己酸乙酯為底物，以雙羰基還原酶為生物催化劑，還原制備單一光學(xué) 純度的3R，5S- 二羥基-6-芐氧基-己酸乙酯的方法。
背景技術(shù)：
3R，5S_ 二羰基-6-芐氧基-己酸乙酯結(jié)構(gòu)中的兩個(gè)手性中心與3_羥基_3_甲基 戊二酰輔酶A還原酶的抑制劑他汀類降血脂藥物的手性側(cè)鏈立體構(gòu)型相同，因此它是合成 他汀類藥物的關(guān)鍵手性中間體。
目前該類化合物的制備主要是通過(guò)化學(xué)合成來(lái)完成，但是存在下列問(wèn)題需用手 性催化劑，生產(chǎn)成本高；總得率低于50% ；產(chǎn)物的光學(xué)純度很難達(dá)到要求；大量使用有機(jī)試 劑，造成環(huán)境污染嚴(yán)重。
因?yàn)樯锎呋椒ň邆涓叨攘Ⅲw選擇性、溫和的反應(yīng)條件和不造成環(huán)境污染等優(yōu) 勢(shì)，所以如何采用生物催化技術(shù)制備3R，5S-雙羥基化合物已經(jīng)受到研究者高度關(guān)注和廣 泛研究，例如
(I)Wolberg 等(參見(jiàn)Angew. Chem. Int. Ed. 200，39 :4306_4308 ；Chem. Eur. J. 2001,7 4562-4571)利用細(xì)菌 Lactobacllus brevis 將一種 β，δ-雙羰基底物中 的S-羰基還原成δ-羥基，但產(chǎn)物的非對(duì)映體過(guò)量值(enantiomericexcess，ee)只有 98. 1%，且需用其他方法引入另一個(gè)手性中心。
(2)去氧核糖-5-磷酸醛縮酶(DERA)能夠以乙醛和氯乙醛為底物，通過(guò)兩步 醛縮反應(yīng)同時(shí)引入兩個(gè)手性中心得到3R，5S-雙羥基產(chǎn)物(ee > 99.9，de = 96. 6 % ) (參見(jiàn) J. Am. Chem. Soc. 1994，116 :8422_8423 J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004，101 5788-5793)，但該方法的缺點(diǎn)是酶用量較大、底物抑制作用很強(qiáng)并且初始反應(yīng)原料為易燃 易爆試劑，故難以用于工業(yè)生產(chǎn)。
(3) Guo 等(參見(jiàn)Tetrahedron :Asymmetry 2006，17 1589-1602)禾Ij 用 Acinetobacter species SC13874還原3R，5S_ 二羰基_6_節(jié)氧基-己酸乙酯制備得到3R， 5S- 二羥基-6-芐氧基-己酸酸乙酯，但63. 3%的非對(duì)映體過(guò)量值阻礙了該方法的應(yīng)用。
(4)腈基水解酶亦可以用于3R，5S_雙羥基化合物的制備，但底物的合成難度大， 產(chǎn)物分離困難(Org. Process. Res. Dev. 2006，10 661-665)。
(5)公開(kāi)號(hào)為CN 101429514A的中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)公開(kāi)說(shuō)明書(shū)公開(kāi)了一種應(yīng)用雙 羰基還原酶在制備3R，5S-雙羥基化合物的方法，是一個(gè)最為成功的生物催化方法，所述雙 羰基還原酶能夠催化3R，5S- 二羰基-6-芐氧基-己酸乙酯還原成3R，5S- 二羥基-6-芐氧 基_己酸乙酯，產(chǎn)物的de和ee值均高于99. 5%，且底物轉(zhuǎn)化率高達(dá)99. 9%，不過(guò)該方法的 不足之處是反應(yīng)的底物濃度較低(10g/L)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種非水相制備手性化合物3R，5S-雙羥基化合物的方法。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種非水相制備手性化合物3R， 5S-雙羥基化合物的方法，以3R，5S-雙羰基化合物為底物，以雙羰基還原酶為生物催化劑， 催化還原底物得到3R，5S-雙羥基化合物；具體包括以下步驟
(1)在反應(yīng)液中加入底物、雙羰基還原酶和由甲酸脫氫酶介導(dǎo)的輔酶循環(huán)再生體 系，10 50°C條件下，振蕩反應(yīng)至少1小時(shí)；
其中，所述反應(yīng)液為有機(jī)溶劑和緩沖液的混合溶液，有機(jī)溶劑和緩沖液的體積比 為1 9 9 1;所述緩沖液的PH值為4.0 8.0;所述底物的濃度為10 100g/L;所 述雙羰基還原酶的用量為0. 5 9U/mL ；所述甲酸脫氫酶用量為1 5U/ml ；
(2)將步驟(1)得到的產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，單一光學(xué)異構(gòu)體3R，5S_雙羥基化合 物；
其中，3R，5S_雙羰基化合物的通式為
3R，5S_雙羥基化合物的通式為
式中，R1選自芳香基、烷基、環(huán)烷基、烷基取代的芳香基、鹵素取代的芳香基、芳烷 雜烷基、環(huán)狀雜烷基或環(huán)狀雜烷化烷基R2為烷基、環(huán)烷基、商烷基或商環(huán)烷基。
優(yōu)選的技術(shù)方案中，R1選自苯基、吡啶基、呋喃基、吡咯基、碳原子數(shù)1 6的烷 基、碳原子數(shù)3 8的環(huán)烷基、烷基取代的芳香基、鹵素取代的芳香基、芳烷雜烷基、環(huán)狀雜 烷基或環(huán)狀雜烷化烷基；R2為碳原子數(shù)1 6的烷基、碳原子數(shù)3 8的環(huán)烷基、鹵烷基或 鹵環(huán)烷基。
上述技術(shù)方案中，所述雙羰基還原酶為公開(kāi)號(hào)為CN101429514A的中國(guó)發(fā)明專利 申請(qǐng)公開(kāi)說(shuō)明書(shū)中所述雙羰基還原酶，所述雙羰基還原酶由與SEQ IDN0. 1具有80%以上 的同源性的氨基酸序列組成。
優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述的雙羰基還原酶由SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列組成。
上述技術(shù)方案中，所述由甲酸脫氫酶介導(dǎo)的輔酶循環(huán)再生體系屬于本領(lǐng)域技術(shù)人 員公知的常規(guī)現(xiàn)有技術(shù)，通常包括甲酸鹽、輔酶NAD+和甲酸脫氫酶，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根 據(jù)實(shí)際情況選擇合適的組分和用量。
上述技術(shù)方案中，所述溶劑選自乙醇、四氫呋喃、二甲基亞砜、乙酸乙酯、甲苯和 正己烷中的一種或一種以上的混合物。
上述技術(shù)方案中，所述步驟(1)中的振蕩反應(yīng)的轉(zhuǎn)速一般在100 300rpm，優(yōu)選 150 250rpm。
上述技術(shù)方案中，所述步驟(2)的分離提純方法可以是將反應(yīng)液用有機(jī)溶劑萃
4取，合并有機(jī)相，減壓蒸干，純化后即得到所述產(chǎn)物。
優(yōu)選的技術(shù)方案中，步驟(1)中所述有機(jī)溶劑選自甲苯或正己烷；步驟(1)中所 述緩沖液選自磷酸鹽緩沖液或醋酸鹽緩沖液，所述緩沖液的制備均為現(xiàn)有技術(shù)。
上述技術(shù)方案所述反應(yīng)過(guò)程可用如下反應(yīng)式表示
由于上述技術(shù)方案運(yùn)用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點(diǎn)
1.由于本發(fā)明采用雙羰基還原酶，同時(shí)結(jié)合非水相溶劑體系和輔酶再生系統(tǒng)，催 化合成了 3R，5S- 二羥基-6-芐氧基-己酸乙酯，其光學(xué)純度ee和de值均大于99. 5%，底 物濃度高達(dá)150g/L，具有廣泛的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
2.本發(fā)明的制備方法簡(jiǎn)單、過(guò)程可控，效率極高，具有良好的應(yīng)用前景。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述
實(shí)施例一
一種制備3R，5S_ 二羥基-6-芐氧基-己酸乙酯的方法，包括如下步驟在Iml的 反應(yīng)體系中，依次加入甲酸鈉9. 5-140mg, 3，5- 二羰基-6-芐氧基-己酸乙酯10 150mg， 0. IM (pH = 6. 0)磷酸鉀緩沖液，NAD+20 μ 1 (0. 5mM)，甲酸脫氫酶27. 2mg(4U/ml)，雙羰基還 原酶上清65μ l(6U/ml)，最后加入正己烷500 μ 1 ；在常溫、振蕩速度為200rpm條件下反應(yīng) 18小時(shí)，停止反應(yīng)后，分離提純，樣品進(jìn)行高效液相色譜分析底物轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物光學(xué)純度。
在底物濃度小于等于100g/L時(shí)轉(zhuǎn)化率大于99%，125g/L時(shí)的轉(zhuǎn)化率為95. 1%，并 且產(chǎn)物3R，5S- 二羥基-6-芐氧基-己酸乙酯的ee和de值均高于99. 5%。
上述雙羰基還原酶可以通過(guò)以下方法得到將含有誘導(dǎo)表達(dá)的雙羰基還原酶的大 腸桿菌細(xì)胞用0. IM (pH = 6. 0)磷酸鉀緩沖液，按20%的比例重懸，高壓破細(xì)胞，12000rpm 離心15 20min獲得雙羰基還原酶上清，其酶活力為90U/ml。
上述甲酸脫氫酶可以采用如下方法制備將含有誘導(dǎo)表達(dá)的甲酸脫氫酶的大腸桿 菌細(xì)胞用0. 05M(pH = 7. 0)磷酸鉀緩沖液，按20%的比例重懸，高壓破細(xì)胞，12000rpm離心 15 20min獲得甲酸脫氫酶上清，冷凍干燥，使用時(shí)粉末加入反應(yīng)體系。
3，5- 二羰基-6-芐氧基-己酸乙酯的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物3R，5S- 二羥基_6_芐氧基-己 酸乙酯純度用反相C18柱(5ym，4. 6X25(kim，Shimadzu, Japan)進(jìn)行高效液相(Shimadzu 2010A HT, Japan)分析(Chirality, 2008, 20 51-53 ；Acta. Biochim. Biophys. Sin. 2009, 41 163-170)。產(chǎn)物的 ee 和 de 值用手性液相色譜柱 Chiralcel OD-RH(5 μ m, 150X4. 6mm,Daicel,USA)進(jìn)行分析(Chirality, 2008, 20 :51_53 ；Acta. Biochim. Biophys. Sin. 200941 163-170)。
實(shí)施例二
一種制備3R，5S_ 二羥基-6-芐氧基-己酸乙酯的方法，包括如下步驟在Iml的 反應(yīng)體系中，依次加入甲酸鈉9. 5mg，3，5- 二羰基-6-芐氧基-己酸乙酯10mg，0. IM (pH = 6.0)磷酸鉀緩沖液，NAD+20 μ 1 (0. 5mM)，甲酸脫氫酶27. 2mg(4U/ml)，雙羰基還原酶上清 65μ l(6U/ml)，最后加入正己烷500 μ 1 ；在40°C、振蕩速度為200rpm條件下反應(yīng)18小時(shí)， 停止反應(yīng)后，分離提純，樣品進(jìn)行高效液相色譜分析底物轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物光學(xué)純度。
底物轉(zhuǎn)化率為76. 4%，產(chǎn)物3R，5S- 二羥基_6_芐氧基-己酸乙酯的ee和de值均 高于99. 5%。
實(shí)施例三
一種制備3R，5S_ 二羥基-6-芐氧基-己酸酸乙酯的方法，包括如下步驟在Iml 的反應(yīng)體系中，依次加入甲酸鈉140mg(2M)，3，5-二羰基-6-芐氧基-己酸乙酯10g/L， 0. IM (pH = 6. 0)磷酸鉀緩沖液，NAD+20 μ 1 (0. 5mM)，甲酸脫氫酶27. 2mg(4U/ml)，雙羰基還 原酶上清65μ l(6U/ml)，最后加入乙醇100 400 μ 1，在常溫、振蕩速度為200rpm條件下 反應(yīng)18小時(shí)，停止反應(yīng)后，分離純化，樣品利用高效液相色譜分析底物轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物光學(xué) 純度。
在乙醇含量為20% (ν/ν)時(shí)轉(zhuǎn)化率為95. 0%，30%時(shí)轉(zhuǎn)化率為3.3%，產(chǎn)物3R， 5S- 二羥基-6-芐氧基-己酸乙酯的ee和de值均高于99. 5%。
實(shí)施例四
一種制備3R，5S_二羥基-6-芐氧基-己酸乙酯的方法，包括如下步驟在Iml的反 應(yīng)體系中，依次加入甲酸鈉140mg，3，5- 二羰基-6-芐氧基-己酸乙酯10 150g/L，0. IM (pH =6. 0)磷酸鉀緩沖液，NAD+20 μ 1 (0. 5mM)，甲酸脫氫酶27. 2mg(4U/ml)，雙羰基還原酶上清 65 μ 1 (6U/ml)，最后加入二甲基亞砜500 μ 1，在常溫、振蕩速度為200rpm條件下反應(yīng)18小 時(shí)，停止反應(yīng)后，分離提純，樣品利用高效液相色譜分析底物轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物光學(xué)純度。
在當(dāng)?shù)孜餄舛鹊陀诘扔?25g/L時(shí)轉(zhuǎn)化率為99. 2%，150g/L時(shí)的轉(zhuǎn)化率為84. 1%。 產(chǎn)物ee和de值均高于99. 5 %。
實(shí)施例五
一種制備3R，5S_二羥基-6-芐氧基-己酸乙酯的方法，包括如下步驟在Iml的反 應(yīng)體系中，依次加入甲酸鈉140mg，3，5-二羰基-6-芐氧基-己酸乙酯10 150g/L，0. IM(pH =6. 0)磷酸鉀緩沖液，NAD+20 μ 1 (0. 5mM)，甲酸脫氫酶27. 2mg(4U/ml)，雙羰基還原酶上清 65 μ 1 (6U/ml)，最后加入甲苯400 μ 1，在常溫、振蕩速度為200rpm條件下反應(yīng)18小時(shí)，停止 反應(yīng)后，分離提純，樣品利用高效液相色譜分析底物轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物光學(xué)純度。
在當(dāng)?shù)孜餄舛鹊陀诘扔?5g/L時(shí)轉(zhuǎn)化率為99. 5%,100g/L時(shí)的轉(zhuǎn)化率為90. 5%。 產(chǎn)物ee和de值均高于99. 5 %。
實(shí)施例六
一種制備3R，5S- 二羥基-6-芐氧基-己酸乙酯的方法，包括如下步驟在50ml的 反應(yīng)體系中，依次加入甲酸鈉140mg，3，5- 二羰基-6-芐氧基-己酸乙酯5g，0. IM (pH = 6. 0) 磷酸鉀緩沖液，NAD+Iml (0. 5mM)，甲酸脫氫酶1. 36g (4U/ml)，雙羰基還原酶上清3. 25ml (6U/ml)，最后加入正己烷25ml ；在常溫，200rpm條件下進(jìn)行反應(yīng)，在反應(yīng)進(jìn)行了 2小時(shí)和4小 時(shí)時(shí)，分別再加入雙羰基還原酶100U和50U。反應(yīng)中每隔1小時(shí)取樣，乙醇停止反應(yīng)后，用 高效液相色譜分析底物轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物光學(xué)純度。底物轉(zhuǎn)化率在反應(yīng)12小時(shí)后達(dá)到恒定，為 94. 8%。停止反應(yīng)，反應(yīng)液用乙酸乙酯萃取三次，合并有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，旋轉(zhuǎn) 蒸發(fā)有機(jī)溶劑，減壓濃縮得到油狀產(chǎn)物混合物，產(chǎn)物混合物用65/35乙酸乙酯/石油醚(ν/ ν)的硅膠層析柱純化，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)洗脫劑得到白色粉末狀3R，5S- 二羥基-6-芐氧基-己酸乙 酯產(chǎn)物，其純度為99 %，ee和de值均高于為99. 5 %，產(chǎn)物收率為83.9%。
<110>陳依軍[0055]<120> 一種非水相制備手性化合物3R，5S--雙羥基化合物的方法[0056]<160>1[0057]<210>1[0058]<211>283[0059]<212>PRT[0060]<213> 雙羰基還原酶(diketoreductase)[0061]<400>1[0062]Met ThrGlylieThrAsnValThrValLeuGlyThrGlyValLeuGly[0063]151015[0064]Ser GlnIleAlaPheGlnThrAlaPheHisGlyPheAlaValThrAla[0065]202530[0066]Tyr AspIleAsnThrAspAlaLeuAspAlaAlaLysLysArgPheGlu[0067]354045[0068]Gly LeuAlaAlaValTyrGluLysGluValAlaGlyAlaAlaAspGly[0069]505560[0070]Ala AlaGlnLysAlaLeuGlyGlylieArgTyrSerAspAspLeuAla[0071]65707580[0072]Gln AlaValLysAspAlaAspLeuVallieGluAlaValProGluSer[0073]859095[0074]Leu AspLeuLysArgAsplieTyrThrLysLeuGlyGluLeuAlaPro[0075]100105110[0076]Ala LysThrliePheAlaThrAsnSerSerThrLeuLeuProSerAsp[0077]115120125[0078]Leu ValGlyTyrThrGlyArgGlyAspLysPheLeuAlaLeuHisPhe[0079]130135140[0080]Ala AsnHisValTrpValAsnAsnThrAlaGluValMetGlyThrThr[0081]145150155160[0082]Lys ThrAspProGluValTyrGlnGlnValValGluPheAlaSerAla[0083]165170175[0084]lie GlyMetValProlieGluLeuLysLysGluLysAlaGlyTyrVal[0085]180185190[0086]Leu Asn Ser Leu
195
Val Asp Gly Ile
210
Gly Thr Gly Ala
225
Leu Thr Thr Ala
Glu Phe Ala Ala
260
Gly Leu Ala Thr
275
Leu Val Pro Leu Leu Asp 200
Ala Asp Pro Glu Thr lie 215
Pro Lys Gly Pro Phe Glu 230
Tyr Asn lie Ser Ser Val 245250
Tyr Leu Lys Glu Asn Tyr 265
Gly Glu Gly Phe Tyr Arg 280
Ala Ala Ala Glu Leu Leu 205
Asp Lys Thr Trp Arg lie 220
lie Phe Asp lie Val Gly 235240
Ser Gly Pro Lys Gln Arg 255
lie Asp Lys Gly Lys Leu 270
Tyr
權(quán)利要求
一種非水相制備手性3R，5S-雙羥基化合物的方法，以3R，5S-雙羰基化合物為底物，以雙羰基還原酶為生物催化劑，催化還原底物得到3R，5S-雙羥基化合物；其特征在于，具體包括以下步驟(1)在反應(yīng)液中加入底物、雙羰基還原酶和由甲酸脫氫酶介導(dǎo)的輔酶循環(huán)再生體系，10～50℃條件下，振蕩反應(yīng)至少1小時(shí)；其中，所述反應(yīng)液為有機(jī)溶劑和緩沖液的混合溶液，有機(jī)溶劑和緩沖液的體積比為1∶9～9∶1；所述緩沖液的pH值為4.0～8.0；所述底物的濃度為10～100g/L；所述雙羰基還原酶的用量為0.5～9U/mL；所述甲酸脫氫酶用量為1～5U/ml；(2)將步驟(1)得到的產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，得單一光學(xué)異構(gòu)體3R，5S-雙羥基化合物；其中，3R，5S-雙羰基化合物的通式為3R，5S-雙羥基化合物的通式為式中，R1選自芳香基、烷基、環(huán)烷基、烷基取代的芳香基、鹵素取代的芳香基、芳烷雜烷基、環(huán)狀雜烷基或環(huán)狀雜烷化烷基R2為烷基、環(huán)烷基、鹵烷基或鹵環(huán)烷基。F2009102320802C00011.tif,F2009102320802C00012.tif
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的一種非水相制備手性化合物3R，5S-雙羥基化合物的方法，其 特征在于，所述溶劑選自乙醇、四氫呋喃、二甲基亞砜、乙酸乙酯、甲苯和正己烷中的一種 或一種以上的混合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的一種非水相制備手性化合物3R，5S-雙羥基化合物的方法，其 特征在于，步驟(1)中所述振蕩反應(yīng)的轉(zhuǎn)速在100 300rpm。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的一種非水相制備手性化合物3R，5S-雙羥基化合物的方法，其 特征在于，步驟(1)中所述緩沖液選自磷酸鹽緩沖液或醋酸鹽緩沖液。
5.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的一種非水相制備手性化合物3R，5S-雙羥基化合物的方法，其 特征在于，步驟(1)中所述有機(jī)溶劑選自甲苯或正己烷。
6.根據(jù)權(quán)利要求
3所述的一種非水相制備手性化合物3R，5S-雙羥基化合物的方法，其 特征在于，步驟(1)中所述振蕩反應(yīng)的轉(zhuǎn)速在200rpm。
7.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的一種非水相制備手性化合物3R，5S-雙羥基化合物的方法， 其特征在于，所述雙羰基還原酶由與SEQ ID NO. 1具有80%以上的同源性的氨基酸序列組 成。
專利摘要
本發(fā)明屬于生物催化法不對(duì)稱制備手性醫(yī)藥中間體領(lǐng)域，具體涉及一種以3，5-二羰基-6-芐氧基-己酸乙酯為底物，以雙羰基還原酶為生物催化劑，還原制備單一光學(xué)純度的3R，5S-二羥基-6-芐氧基-己酸乙酯的方法，具體包括以下步驟(1)在反應(yīng)液中加入底物、雙羰基還原酶和由甲酸脫氫酶介導(dǎo)的輔酶循環(huán)再生體系，振蕩反應(yīng)至少1小時(shí)，其中，所述反應(yīng)液為有機(jī)溶劑和緩沖液的混合溶液；(2)將步驟(1)得到的產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，單一光學(xué)異構(gòu)體3R，5S-雙羥基化合物。由于本發(fā)明采用雙羰基還原酶，同時(shí)結(jié)合非水相溶劑體系和輔酶再生系統(tǒng)，催化合成了3R，5S-二羥基-6-芐氧基-己酸酸乙酯，其光學(xué)純度ee和de值均大于99.5％，底物濃度高達(dá)150g/L，具有廣泛的實(shí)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12P7/18GKCN101880694SQ200910232080
公開(kāi)日2010年11月10日 申請(qǐng)日期2009年12月1日
發(fā)明者吳旭日, 陳依軍 申請(qǐng)人:陳依軍導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan